TRF及其在腫瘤中作用的研究進展

單世婷，朱春富

(1.南京醫(yī)科大學研究生學院，南京 210029；2.南京醫(yī)科大學附屬常州第二人民醫(yī)院肝膽外科，江蘇 常州 213000)

轉運RNA(transfer RNA,tRNA)衍生片段(tRNA-derived fragments,TRF)是指轉運RNA(transfer RNA,tRNA)來源的小片段RNA，由特定核酸酶(如RNA內切酶和血管生成素)在特定細胞或組織中或某些條件下(如應激和缺氧)對tRNA的特異性切割產生的片段[1]。TRF屬于非編碼RNA家族成員。非編碼RNA是一種不具有翻譯成蛋白質能力的RNA,廣泛存在于各種細胞中，在生物體中發(fā)揮廣泛的作用。作為經典的非編碼RNA，tRNA在蛋白質合成中具有重要作用。tRNA是特異性識別信使RNA(messenger RNA,mRNA)密碼子并在翻譯過程中將帶電荷的氨基酸轉移到核糖體中的關鍵銜接子。當前的熱點RNA分子包括長鏈非編碼RNA、微RNA(microRNA，miRNA)和環(huán)狀RNA，但TRF通常被忽視。近年來TRF不同生物學功能的重要性逐漸受到關注。與miRNA相同，TRF在各種生物體的組織和細胞中均較豐富。TRF已被公認為是一種具有多功能的動態(tài)調節(jié)因子，能夠發(fā)揮獨特而多樣的生物學作用[2]，在基因表達調控、翻譯調控、病毒感染、癌癥和神經變性方面均發(fā)揮了重要作用。現(xiàn)就TRF的生物學功能及其分子機制進行綜述。

1 TRF的概念及來源

根據(jù)前體或成熟tRNA轉錄體的切割位點不同，tRNA衍生的小RNA(tRNA-derived small RNAs，tsRNA)分為兩種主要類型：一種是在成熟tRNA的反密碼子環(huán)中的特異性切割產生的長度為28～36 nts的tRNA片段，被命名為tiRNA；另一種來源于成熟或初級tRNA的長度為14～30 nts的片段，命名為TRF。到目前為止已鑒定出5-TRF、3-TRF、1-TRF和2-TRF 4種類型的TRF。5-TRF是由Dicer在tRNA的D-環(huán)切割生成的產物，通常以腺嘌呤為3′端進一步分為5a-TRF、5b-TRF和5c-TRF[3]。3-TRF由Dicer、ANG或Ribonucases A超家族的其他成員在T-環(huán)上切割生成，通常包含一個CCA尾序列，長度約為18 nts或22 nts[4-5]。RNaseZ核酸內切酶或其elaC同系物2對tRNA前的3′-尾片段進行切割產生1-TRF，其起始于成熟tRNA的3′端，并在3′端具有多聚-U。近年來在乳腺癌細胞中發(fā)現(xiàn)了一種新的含反密碼子環(huán)的TRF亞型，被稱為2-TRF[6]。人類細胞中5-TRF主要存在于細胞核，而3-TRF和1-TRF主要存在于細胞質[7]。

2 TRF的功能

2.1調節(jié)mRNA穩(wěn)定性 作為一種長度小于30 nts的非編碼小RNA，TRF與miRNA具有相似的功能，可以直接與mRNA結合，抑制蛋白翻譯或切割部分互補靶點。3-TRF和1-TRF通過與AGO(Argonaute)家族蛋白競爭性結合調控基因表達，從而影響靶基因的沉默效率。此外，2-TRF或其類似物還能替換腫瘤基因mRNA結合蛋白YBX1，阻斷其與致癌mRNA的相互作用使許多促癌基因mRNA不穩(wěn)定，從而導致癌細胞的浸潤性被顯著抑制[8]。TRF的內源性mRNA靶點需要進一步研究，從而明確TRF的調控機制。

2.2抑制蛋白質的生物合成 TRF(主要為5-TRF)可使翻譯速度降低10%～15%[8]。特異性的5-TRF可組裝成G-四重鏈樣結構，能競爭性地與翻譯起始復合物真核起始因子4G和真核起始因子4A結合，直接影響蛋白質的翻譯過程，不抑制負責細胞存活和抗凋亡的內部核糖體進入位點介導的蛋白的翻譯[9]。負責細胞存活和抗凋亡的蛋白質是通過內部核糖體進入位點途徑翻譯的，TRF在應激條件下通過選擇性地抑制某些蛋白質的翻譯來減少細胞能量消耗，同時使有利于生存的蛋白質的產生不受影響[10]。這些結果表明TRF的產生不是為了降低功能成熟的tRNA水平，而是為了調節(jié)應激條件下蛋白質的翻譯過程。此外，5-TRF還可以與翻譯沉默子YBX1結合，并通過eIF2α蛋白磷酸化獨立途徑增強應激顆粒的組裝，從而加強細胞對壓力的抵抗能力并促進生存[11]。TRF可作為多體組裝的分子制動器，從而產生平移抑制[12]。5-TRF能抑制報告基因的表達而不需要與mRNA中的互補位點結合，預示著TRF可能以翻譯機制為靶點。從tRNA中提取的5-TRF已被證明與mRNA通道附近的小核糖體亞基結合，并結合DIM蛋白參與生物的合成[13]。綜上所述，TRF能夠通過影響翻譯機制來抑制蛋白質的生物合成。

2.3調節(jié)核糖體生物的發(fā)生 TRF是核糖體生物發(fā)生的重要調節(jié)因子，包括調節(jié)核糖體RNA(ribosome RNA,rRNA)的合成、加工和核糖體亞單位的裝配等過程。在低等生物中(如嗜熱四膜蟲)，TRF是其rRNA前體剪接復合物的組成部分。3-TRF可與Twi12蛋白(AGO/Piwi家族蛋白)特異結合，從而誘導Tan1(Twi-associated novel 1)蛋白和核酸外切酶Xrn2形成pre-rRNA剪切復合物，切割和加工前體rRNA并促進rRNA合成[14]。然而TRF是否能促進高等生物體的rRNA過程還有待進一步研究。在哺乳動物細胞中，來源于tRNA的3-TRF可與核糖體蛋白mRNA結合，促進其翻譯過程[15]。綜上所述，TRF可根據(jù)其亞型、細胞狀態(tài)和物種在不同的水平上調節(jié)翻譯調節(jié)核糖體的生物發(fā)生。

2.4作為一種新的表觀遺傳因子 在表觀遺傳學中，大部分表觀遺傳標記被抹去然后重新建立，基因組自我保護的機制目前仍不明確[16]。研究發(fā)現(xiàn),不同長度的3-TRF(18 nts和22 nts)分別通過阻斷反轉錄(18 nts 3-TRF)和miRNA樣轉錄后沉默(22 nts 3-TRF)，使長端重復序列的反轉錄轉座子沉默，進而參與調控基因組的穩(wěn)定性[17]。tiRNA是小鼠成熟精子中最豐富的小RNA，受精時精子tiRNA可以改變早期胚胎的轉錄，包括與代謝途徑相關的基因[18]。這些變化與DNA甲基化狀態(tài)無關，表明調節(jié)精子的TRF可能是一種新的表觀遺傳因子并影響后代的表型。但TRF在體內的確切作用機制可能更為復雜，值得深入研究。

2.5引導調控RNA的反轉錄 TRF可作為病毒RNA逆轉錄中的指導RNA。宿主細胞的3-TRF(稱為TRF-3019)可與人T細胞白血病病毒1型RNA的引物結合位點結合，啟動逆轉錄從而促進病毒自合成。同時呼吸道合胞病毒的感染可通過誘導tRNA的血管緊張素裂解而產生TRF，從而引起宿主細胞的應激反應[19]。呼吸道合胞病毒利用宿主TRF作為引物促進其復制提高感染效率。因此，這兩種類型的tiRNA可以作為引物進行反轉錄[20-21]。進一步研究TRF在病毒感染中的作用能為深入了解病毒與宿主之間的相互作用提供更有價值的見解。

2.6結合細胞色素C抑制細胞凋亡 研究表明，成熟的tRNA分子可以與細胞色素C結合，進而抑制凋亡小體的形成和胱天蛋白酶-9的活性，從而促進細胞的存活[22]。由于TRF來源于tiRNA，推測tRNA在高滲條件下也可能與細胞色素C相互作用[23]。血管緊張素介導的tiRNA(5-TRF和3-TRF)可能與線粒體釋放的細胞色素C相互作用，從而抑制凋亡小體的形成和活性。TRF與細胞色素C相互作用觸發(fā)了一系列抑制凋亡的生物學過程，被認為是一種新的抗凋亡機制。然而在這一生物過程中，TRF如何特異性地識別細胞色素C，是否涉及自己的修改或其他因素，在哪些特定條件下可與細胞色素C相互作用均需要進一步研究。

2.7免疫調節(jié) TRF存在于造血細胞、淋巴組織和血液循環(huán)系統(tǒng)。急性炎癥期，循環(huán)系統(tǒng)TRF水平迅速升高，表明TRF可能在免疫應答中起重要作用[24]：一方面，TRF參與免疫細胞內的基因調控，在單核細胞成熟為樹突狀細胞期間，來自tRNA的5-TRF可與AGO樣蛋白家族中PIWIL4和PIWIL1蛋白形成復合物，然后募集SETDB1、SUV39H1和HP1β以甲基化CD1A分子，啟動子區(qū)域上的組蛋白H3K9，導致CD1A表達的抑制[25]；另一方面TRF可直接與Toll樣受體相互作用，激活Th1細胞和毒性T淋巴細胞的免疫應答[26]。這些結果顯示，TRF可作為一種新的免疫信號分子參與免疫調節(jié)，但詳細作用機制有待進一步研究。

3 TRF在腫瘤中的作用

腫瘤細胞生長迅速，血液供應不足導致微環(huán)境中氧氣和營養(yǎng)缺乏。腫瘤細胞可以通過不同的調控策略來適應這種環(huán)境，從而確保其生存和增殖[27]。tRNA可在缺氧缺血環(huán)境下產生TRF，并且TRF可以保護細胞在應激條件下的存活。近年來，TRF已成為腫瘤治療的研究熱點。此外腫瘤患者的尿液和血清中可檢測到TRF，其有望成為腫瘤診斷的新的分子標志物[28]。

3.1乳腺癌 乳腺癌是女性中最常見的惡性腫瘤，TRF與乳腺癌的發(fā)生、進展有密切關系。TRF通過取代RNA結合蛋白YBX1中的3′非翻譯區(qū)來抑制乳腺癌細胞中多種致癌基因的穩(wěn)定性，從而抑制腫瘤細胞的轉移和擴散[29-30]。因此，TRF可作為腫瘤治療的新診斷指標和治療靶點。通過高通量測序分析發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者血液中TRF水平與其病理特征密切相關。乳腺癌細胞和未分化的乳腺上皮細胞中TRF表達上調，而轉移性高的乳腺癌細胞中未發(fā)現(xiàn)TRF表達，表明TRF在乳腺癌進展中有潛在作用[31]。研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細胞在缺氧刺激條件下TRF水平顯著上調[32]。通過基因本體論和通路分析表明，上調的TRF主要參與維持干細胞群和細胞對白細胞介素-6的反應，這可能是缺氧誘導的TRF促進三陰性乳腺癌中阿霉素耐藥的潛在機制。同時，在曲妥珠單抗耐藥的細胞中也驗證了這一結論。Sun等[29]使用高通量測序檢測了正常乳腺上皮細胞系，曲妥珠單抗敏感和抗性乳腺癌細胞系中TRF的表達水平，結果顯示TRF在HBL-100、SKBR3和JIMT-1細胞系中差異表達。與敏感個體相比，在曲妥珠單抗耐藥患者中TRF-30和TRF-27顯著上調，并且受試者工作特征曲線分析顯示TRF-30和TRF-27與曲妥珠單抗抗性相關；在多變量分析中，較高水平的TRF-30和TRF-27表達與轉移性人表皮生長因子受體陽性乳腺癌患者的無進展生存期顯著縮短相關，表明TRF-30和TRF-27在曲妥珠單抗抗性中起重要作用[33]。因此，TRF可作為潛在的生物標志物和干預靶點來指導耐藥性乳腺癌的臨床診斷和治療。

3.2前列腺癌 前列腺癌是發(fā)達國家男性中最常見的癌癥。雖然它的遺傳背景已被深入研究，但對于TRF在這種疾病中的作用仍不明確。由于缺乏可靠的疾病預后標志物導致不恰當?shù)幕颊叻謱樱^度治療以及由前列腺切除術和放療后引起的不良反應使前列腺癌的治療受到阻礙，因此需要更好地了解前列腺癌發(fā)病和進展的分子機制，以發(fā)現(xiàn)更好的標志物并開發(fā)新的治療策略。Sun等[29]用RNA測序方法分析了來自前列腺癌旁細胞和不同分期的腫瘤細胞，發(fā)現(xiàn)了598個獨特的TRF，其中大多數(shù)TRF來自成熟的細胞胞質tRNA的5′端和3′端；tRNA的其他部分產生的TRF，包括tRNA的前拖尾和先導，以及線粒體tRNA產生的TRF?；谄纹鹪吹某墒靦RNA部分，可以區(qū)分5種不同的TRF類別。其中，5e-TRFs類是最豐富的，包含最多的獨特TRF。鑒于5′衍生的TRF在抑制蛋白質合成中的作用及其在應激顆粒(應激顆粒是一種應激誘導的細胞質灶，具有高度集中的非翻譯信使核糖體微粒)組裝中的作用，這將有利于鑒定上調的5′衍生的TRF，測試它們抑制翻譯的能力以及在前列腺癌細胞系中體外誘導應激顆粒的組裝。研究表明，應激顆?？赡芡ㄟ^哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合體1-過度活化誘導的細胞凋亡的負調節(jié)在癌癥中發(fā)揮重要作用，因此TRF在應力顆粒裝配中起重要作用,表明TRF的上調可能與癌細胞中細胞凋亡的抑制間接相關[34]。TRF在腫瘤細胞中的特異性高表達預示著TRF可作為前列腺癌無進展生存和良好預后的指標，為進一步研究TRF在前列腺癌中的生物標志物潛力和功能奠定了基礎。

3.3結直腸癌 結腸直腸癌是最致命的疾病之一，也是癌癥相關死亡的第三大原因，是一種由遺傳和表觀遺傳改變引起的疾病[35]。40%～50%的人類結直腸癌病例在診斷時出現(xiàn)轉移或在治療后發(fā)生遠處復發(fā)，轉移性結直腸癌的中位總生存期不到2年[36]。因此，需要新的診斷標志物和治療靶標。研究發(fā)現(xiàn)，TRF/miR-1280可通過抑制JAG2(Jagged 2)蛋白支持的干細胞樣表型，顯著抑制大腸癌細胞的存活和轉移相關特征[37]。TRF/miR-1280在結直腸癌細胞中過表達或JAG2基因敲除顯著抑制干細胞樣表型標記CD133，減少乳突球的數(shù)量和大小,從而抑制癌細胞的生長[38]。此外,TRF/miR-1280在結直腸癌細胞中的過表達和JAG2基因敲除也能抑制大腸癌細胞的遷移[39]。TRF/miR-1280可以通過靶向JAG2直接抑制Notch信號轉導，導致Notch途徑組分和Notch信號轉導的活性降低。這些結果可以解釋為非編碼RNA片段驅動的異常Notch信號轉導激活與癌癥起始和進展分子相關，包括結直腸癌中癌細胞的增殖和耐藥性。因此，TRF/miR-1280被認為是結腸直腸癌細胞中Notch信號轉導和上皮-間充質轉化的強大主要調節(jié)因子，將TRF/miR-1280引入腫瘤細胞的研究中可能是一種逆轉腫瘤進展的新方法。

4 展 望

TRF在基因表達調控，翻譯調控，病毒感染，癌癥和神經變性方面均發(fā)揮重要作用。目前大多數(shù)TRF生物學功能和生物學起源尚不清楚。因此，明確tRNA中修飾堿基具體機制有利于更深入地研究TRF的生物發(fā)生?；赥RF非侵入性生物標志物的應用將在疾病診斷方面有廣闊的應用前景。目前對TRF的相關研究還處于初級階段，但TRF已經引起了越來越多研究者的關注。隨著高通量測序技術和新一代測序技術的發(fā)展，TRF將得到深入研究，并可能成為腫瘤分子診斷的特異性生物標志物，為臨床診斷和篩查早期腫瘤提供一種無創(chuàng)、安全、可靠的治療手段。