金屬硫蛋白在肺動脈高壓形成中的機制研究進展

李子廣，黃禮年

(1.蚌埠醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院呼吸內科，安徽 蚌埠 233003；2.蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，安徽 蚌埠233000)

肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)是由多種因素導致肺血管受累引起肺循環(huán)阻力和壓力進行性增高，最終導致右心功能不全的一大類疾病。目前采用于海平面、靜息狀態(tài)時、右心導管法檢查肺動脈收縮壓>30 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)和(或)肺動脈平均壓>25 mmHg，或者運動時肺動脈平均壓>30 mmHg，并且肺毛細血管楔壓≤15 mmHg 為PAH的診斷標準[1-2]。引起PAH的常見病因包括遺傳、缺氧、基因變異、血栓栓塞、左心疾病等多種因素[3-4]。PAH的病理生理包括肺動脈平滑肌細胞過度增殖、肺動脈內皮細胞凋亡、減少血管舒張以及增加血管收縮等啟動一系列的肺血管改變(包括內膜增厚和血管壁向心性肥大)，從而使肺小動脈閉塞，并使肺動脈壓升高[5]。目前PAH的治療藥物包括內皮素受體拮抗劑、前列環(huán)素類似物和一氧化氮擴張劑。然而，目前促進PAH發(fā)生的確切機制尚不明確，因此，尋找新的形成PAH的作用靶點更為迫切。金屬硫蛋白(metalthioneins，MTs)在一些疾病模型中被證明可調節(jié)細胞增殖和血管收縮[6]?，F(xiàn)就MTs在PAH形成機制中的研究進展予以綜述。

1 MTs概述

MTs是存在于細菌、植物、無脊椎動物和脊椎動物中的低相對分子質量的細胞質蛋白。哺乳動物有4種MT亞型(MT-1、MT-2、MT-3和MT-4)。MT-1和MT-2存在于軟組織(特別是呼吸系統(tǒng))；MT-3表達于腦組織、心臟、腎臟和生殖器官，而MT-4存在于口腔上皮、食管、胃、足墊和新生兒皮膚中[7]。在細胞內，MTs的功能作用通過銅/鋅解毒和維持金屬離子穩(wěn)態(tài)實現(xiàn)，參與多個細胞過程[8]。MTs還可調節(jié)細胞中的凋亡途徑，并通過胱天蛋白酶-3和p38促分裂原活化的蛋白激酶介導[9]。MTs在細胞內環(huán)境中具有多種功能作用，有助于調節(jié)關鍵的細胞過程和細胞內穩(wěn)態(tài)[10]。

2 MTs在PAH形成中的相關作用

2.1氧化應激與抗氧化作用 氧化應激被認為是PAH進展和嚴重程度的生物標志物[11]，MTs通過其半胱氨酸殘基的硫醇基團與重金屬結合，參與金屬調控過程。MTs對重金屬有很高的親和力，與金屬結合，提供對金屬毒性，特別是鎘毒性的保護。當MTs與鋅和銅等生理重金屬結合時，參與調節(jié)細胞生長和增殖，保護機體免受氧化應激；血管重構和血管收縮劑的產(chǎn)生增加，肺動脈平滑肌細胞鈣離子(Ca2+)水平升高，收縮裝置對Ca2+的敏感性增強；信號通路的激活和對肺動脈平滑肌細胞肌球蛋白輕鏈磷酸酶的抑制，在慢性缺氧相關的血管收縮中起著重要作用[12]。黃嘌呤氧化酶和線粒體[13]是與PAH發(fā)展相關活性氧類的主要來源，在PAH中也起著重要作用，因為氧化應激可以降低細胞的功能[14]。在慢性缺氧大鼠中，減少右心室肥大對缺氧相關PAH的發(fā)生有重要作用，同樣，抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸也可減弱慢性缺氧誘導的PAH[15]。另外，慢性低氧可增加心肌中膜肌化和超氧化物歧化酶水平，研究表明，在慢性低氧和低氧/SU5416治療大鼠中，與單純缺氧相比，缺氧/SU5416暴露通過超氧化物歧化酶和Rho激酶依賴的Ca2+敏化機制，導致更嚴重的PAH、右心室肥厚、外膜病變形成和更高的血管收縮敏感性，另外，低氧組和低氧/SU5416組均能降低右心室收縮壓，且活性氧類在介導慢性缺氧和缺氧/SU5416模型大鼠血管收縮反應性和PAH中具有重要作用[16]；由于這些原因，有研究在不同的PAH模型中測試了抗氧化療法的有效性[17]，包括抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸和褪黑激素[18]。氧化應激可導致含鋅蛋白中鋅的釋放，并誘導MTs在多種組織中的表達，在肝組織中，氧化應激誘導MTs的表達，這可能意味著MTs的表達作為一種表觀現(xiàn)象與氧化應激的升高平行；MTs通過調節(jié)線粒體環(huán)境來限制氧自由基的產(chǎn)生，其機制可能為MTs通過調節(jié)線粒體復合體活性和呼吸，從而提高線粒體偶合效率，限制氧自由基的產(chǎn)生[19]。因此，作為對氧自由基的一種自然反應，細胞可以增加MTs的表達。這些細胞MTs使線粒體復合物更有效地傳遞電子，限制了過量的氧自由基的產(chǎn)生，并具有抗氧化作用。因此，可以通過研究MTs抑制劑對PAH模型中氧自由基水平的影響來降低PAH的形成。

2.2血管細胞增殖和血管增生 在PAH中，肺動脈內皮細胞和肺動脈平滑肌細胞增殖以及小血管增生是肺血管重構的重要因素。研究表明，PAH大鼠的血管增生和人類肺微血管內皮細胞增殖依賴于銅的促血管生成作用[20]。銅轉運蛋白1和賴氨酰氧化酶的表達及活性在PAH小鼠的肺動脈中被上調，這些小鼠表現(xiàn)出明顯的肺血管重構，銅轉運蛋白1的參與證實了銅依賴血管細胞增殖和血管增生[21]。這些發(fā)現(xiàn)支持銅螯合蛋白的作用。此外，內皮過度增殖是PAH的一個顯著特征[22]。在其他疾病模型中，MTs表現(xiàn)出銅的螯合特性和抑制細胞增殖的能力[23]。因此，MTs在調節(jié)非病理性細胞增殖方面起著重要作用。轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)可誘導肺動脈內皮細胞和肺動脈平滑肌細胞增殖，促使PAH形成。Hopper等[24]的研究表明，血管細胞的增殖由機械敏感受體的激活引起，使增殖基因和TGF-β的活性增加，提示TGF-β在PAH中升高。另一方面，高濃度的TGF-β可抑制MTs[25]?？梢姡琈Ts在TGF-β相關增殖中的作用與PAH密切相關，因此MTs可能參與PAH的病理生理過程。而TGF-β抑制劑能否降低PAH模型中MTs的表達和細胞增殖是值得研究的問題。

2.3缺氧性肺血管收縮 肺長期暴露于缺氧，缺氧引起血管收縮和PAH。在缺氧等應激條件下，MT-1/2對血管生成和對照生成的刺激作用也被提出，MT-1/2蛋白水平升高可穩(wěn)定缺氧誘導因子-1α的表達；另外，MT-1/2可誘導成纖維細胞生長因子、TGF-β和血管內皮生長因子A等促血管生成因子的表達[26]。研究表明，肺血管收縮是通過過量產(chǎn)生的氧自由基和鋅介導，低氧刺激線粒體產(chǎn)生活性氧類，并刺激肌質網(wǎng)鈣釋放和血管收縮，在缺氧反應中，鋅激活鉀通道并使肺動脈平滑肌細胞膜超極化[27]。這與鋅轉運體的表達增加相一致，并促進肺動脈平滑肌細胞的增殖和血管收縮。MTs是PAH中活性氧自由基家族生成的重要媒介。MTs基因功能的喪失和獲得分別阻斷和增強了血管的重構調節(jié)，活性氧類的產(chǎn)生和氧化應激可導致肺動脈的重構，這也是持續(xù)性酸堿度發(fā)展的主要因素；線粒體產(chǎn)生的活性氧類與氮氧化物產(chǎn)生活性氧的正反饋系統(tǒng)有關，活性氧類自由基的增加可導致細胞一氧化氮濃度的降低，這不僅可能導致血管內皮功能障礙，也可能參與PAH發(fā)展的血管重構；由氧自由基激活Ca2+通道的下游信號，導致Ca2+從肌質網(wǎng)中釋放，致使肺動脈血管收縮[28]。Jernigan等[16]的研究結果也支持氧自由基的生成在調節(jié)缺氧的肺動脈血管收縮和酸堿度方面具有重要作用。成纖維細胞的增殖和遷移可促進與肺血管收縮相關的血管重構，最終導致肺血管重構。成纖維細胞參與肺血管重構的原因是氮氧化物活性增加，然而，MTs在缺氧引起的肺血管收縮或PAH模型中的作用少見報道。

2.4線粒體動力學、基因/蛋白質變化與功能障礙 線粒體動力學包括一系列調節(jié)的細胞反應，改變線粒體的形狀和大小及線粒體的基因/蛋白質，致使線粒體分裂上調，融合下調。線粒體代謝和氧化應激的變化可能決定了線粒體動力學和MT表達的調節(jié)。MT-1/2在各種細胞過程中起著重要作用，MT-1/2調節(jié)鋅離子穩(wěn)態(tài)，因此可能調節(jié)許多轉錄因子或鋅依賴酶的活性。研究表明，MT-1/2在增殖細胞中的定位取決于細胞周期的階段，并在細胞核中觀察到，在靜止細胞中，MT的異構體主要局限于細胞質，在G1期，細胞質中的MT-1/2濃度最高，而在G1/S期，可以觀察到MT-1/2分子向細胞核易位[26]。此外，在細胞周期的S和G2階段檢測到最高濃度的MT-1/2分子，這突出了它們在細胞分裂中的作用[29]。研究表明，PAH中線粒體動力蛋白相關蛋白-1的磷酸化狀態(tài)改變，導致線粒體分裂，促使肺動脈平滑肌細胞增殖，導致線粒體基因/蛋白的變化，增加了線粒體碎片，造成了增殖和凋亡之間的不平衡，并促進了肺動脈平滑肌細胞的增殖[30]。缺氧誘導因子-1通過調節(jié)細胞代謝、增殖、存活、紅細胞生成和血管生成來適應低氧[31]，說明線粒體動力學和基因/蛋白改變在PAH病理生理中的重要性。研究還表明，MTs影響過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α、核轉錄因子1/2以及線粒體轉錄因子A的基因表達[32]。表明MTs在線粒體基因/蛋白改變中起一定作用，如果在PAH模型中發(fā)現(xiàn)細胞MTs參與線粒體基因/蛋白的變化，那么未來的研究將為PAH的病理生理提供新的見解。PAH與線粒體功能障礙之間的聯(lián)系已有報道，在各種PAH模型中均觀察到線粒體功能障礙[33]。因此，研究細胞MTs在PAH相關線粒體功能障礙中的作用，對PAH的研究具有重要意義，不僅可揭示MTs在PAH相關線粒體功能障礙中的作用，而且可以描述MTs的參與對PAH病理生理的影響。

2.5MTs基因多態(tài)性與細胞凋亡 MTs在正常肺細胞、支氣管上皮細胞和癌細胞的細胞質和細胞核中表達，MT-1/2可保護肺組織免受細菌內毒素、臭氧、卡莫司汀(脂溶性高肺毒性烷基化劑)、卵清蛋白和鎘等有毒金屬離子的破壞[34]。在人氣道上皮細胞中，鎳通過動員細胞內游離鋅水平來增加MT-2A信使RNA的表達[35]。多個MTs基因在PAH患者的肺中上調，但它們在PAH中的確切作用仍存在爭議。MT-1、MT-2A和MT-3表達增強可減輕肺損傷，而MT基因剔除小鼠缺氧后肺血管收縮較輕[36]。提示MTs可能在缺氧等應激條件下對血管生成和側支生成的刺激作用，意味著應激源可以調節(jié)MT的表達。高水平的肺脂質過氧化物表明氧化應激可能是脂多糖治療的MT-1/2缺陷小鼠肺部的重要損傷因子[37]。在接受臭氧處理的MT-1/2剔除小鼠中也觀察到了肺超微結構和氧化應激相關分子的變化，與對照組相比，MT-1/2剔除小鼠肺組織中血紅素加氧酶1、誘導型一氧化氮合酶、8-羥基-2′-脫氧鳥苷和硝基酪氨酸等氧化應激相關分子的表達顯著增高[38]；盡管臭氧和脂多糖暴露對MT-1/2缺陷小鼠的肺損傷更嚴重，但在這兩項研究中均未觀察到支氣管肺泡灌洗中促炎細胞因子表達水平的變化[39]。然而，與野生型對照組相比，卵清蛋白治療導致MT-1/2剔除小鼠肺部白細胞介素-1b水平顯著升高；在PAH的實驗模型中，MT的表達和活性可能根據(jù)疾病的嚴重程度而增加或降低[38]。因此，有必要對MTs在PAH中的表達/活性進行全面的研究和探討。有研究分析MTs在肺癌中的表達與臨床病理數(shù)據(jù)的關系，結果發(fā)現(xiàn)，與正常上皮性氣道細胞相比，非小細胞肺癌細胞的MT-1/2水平持續(xù)升高[40]。此外，對肺癌患者中MT-1/2蛋白表達的分析表明，MT-1/2蛋白只存在于非小細胞肺癌細胞、鱗狀細胞癌和腺癌中，而在小細胞肺癌中無MT-1/2蛋白[41]。癌細胞中MT-1/2免疫反應性與腫瘤惡性程度、原發(fā)性大小、淋巴結受累或壞死無關，但值得注意的是，MT-1/2免疫反應性的增加與惡性腫瘤分級的增加平行[42]。然而，另有研究表明，MT-2A的表達增加與乳腺癌組織的增殖有關，表明MTs可能具有與PAH相關的有益影響，而其他MTs如果在PAH中過度表達，則可能產(chǎn)生有害影響[43]。因此，還需要通過更多的研究，明確PAH的病理生理過程中各種MTs在自然細胞反應中的作用。MT-1/MT-2基因剔除小鼠對阿霉素誘導的心臟疾病具有天然的保護作用，而心臟特異性MT-2A過表達的小鼠對糖尿病引起的心臟疾病具有抵抗力[44]。在上述研究中，MT的心臟保護作用是由于MT的抗炎、抗氧化作用。MTs在不同的器官中表達，不同MTs在心和肺中可能有不同的作用，這一點在研究MTs作為PAH的潛在藥物靶點或在PAH模型中作為心臟保護的藥物靶點時是必不可少的。有文獻表明，MTs可用于臨床治療各種疾病[45]，主要是因為MTs可以作為氧化還原代謝改變的生物標志物和治療藥物靶點[46]。因此，Sharma等[47]認為，MTs是最受歡迎的分子，可用于細胞療法和納米技術的發(fā)展。

3 小 結

PAH是一種危及生命的罕見疾病，進展迅速，目前尚無治愈方法。治療的目的是通過靶向調節(jié)前列環(huán)素、內皮素或一氧化氮途徑來減緩疾病進展和減輕臨床癥狀。以往的經(jīng)典途徑為藥物通過擴張血管、抗增殖和抗炎降低PAH，但往往使用不足，與藥物相關的不良反應、無法達到靶向治療相關。MTs與PAH發(fā)展過程密切相關，在基礎研究、體外實驗及臨床試驗中，MTs通過細胞的氧化應激和肺血管平滑肌細胞的增殖以及線粒體動力相關蛋白的磷酸化參與PAH的形成，雖然取得了一定進展，但MTs參與PAH形成的相關細胞信號通路仍不明確，在臨床實踐中還有很長的路要走，需要進行更多的流行病學及多中心的臨床研究。