懸浮培養(yǎng)技術在豬圓環(huán)疫苗生產(chǎn)中的應用

李少麗 邵攀峰 朱國坡 尹忠良

杭州佑本動物疫苗有限公司，杭州 310018

1 豬圓環(huán)病毒概況

豬圓環(huán)病毒（porcine circovirus，PCV）是目前發(fā)現(xiàn)的脊椎動物中最小的一種動物病毒，該病毒可分為PCV1 和PCV2 兩種血清型。PCV1 對豬無致病性，廣泛存在于豬體內(nèi)和豬源傳代細胞系中，PCV2可在豬群內(nèi)引發(fā)多種傳染病，如斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）、豬皮炎腎病綜合征（PDNS）等。PCV2 不僅可造成仔豬生長緩慢，而且還會侵害豬的免疫系統(tǒng)，導致豬群免疫抑制，影響其他疫苗的免疫效果，并引發(fā)其他病原的繼發(fā)感染。PCV2 基因組大小為1 766～1 768 bp，共包括ORF1 和ORF2在內(nèi)的11 個ORF。ORF2 編碼病毒衣殼蛋白（Cap蛋白），Cap 蛋白為病毒的主要結(jié)構蛋白，是刺激機體產(chǎn)生免疫應答的主要抗原，也是基因工程亞單位疫苗研究的熱點。目前，針對圓環(huán)病的商品化疫苗國內(nèi)已有30 多家，主要為全病毒滅活疫苗和亞單位疫苗。目前，國內(nèi)疫苗企業(yè)上市的全病毒滅活疫苗均為轉(zhuǎn)瓶工藝。

2 懸浮培養(yǎng)技術在豬用疫苗生產(chǎn)中的應用

隨著細胞培養(yǎng)技術的不斷發(fā)展成熟，許多細胞已從傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)被馴化為懸浮培養(yǎng)。懸浮培養(yǎng)技術具有病毒產(chǎn)量高、生產(chǎn)周期短、污染小、批間穩(wěn)定、操作方便、可自動化控制、勞動成本低等優(yōu)勢，其可分為微載體懸浮培養(yǎng)和全懸浮培養(yǎng)2 種方式。微載體培養(yǎng)是以細小的顆粒作為細胞載體，通過攪拌使細胞懸浮在培養(yǎng)液內(nèi)，細胞在載體表面生長成單層的一種細胞培養(yǎng)方式。常用的微載體一般為紙片載體或球狀載體，球狀載體相對于紙片載體更容易進行細胞觀察。1962年，Capstick PB 首次采用BHK21 細胞懸浮培養(yǎng)FMDV[1]；1965年，TellingR.C使用發(fā)酵罐懸浮培養(yǎng)BHK21 細胞進行FMDV 的批量生產(chǎn)[2]。周燕等[3]利用生物反應器培養(yǎng)ST 細胞進行TGEV 的繁殖，培養(yǎng)病毒效價為1011.3TCID50/0.2 mL，比方瓶培養(yǎng)效價提高約100倍。馮磊等[4]在Marc145 細胞上使用微載體懸浮灌注培養(yǎng)方式大規(guī)模培養(yǎng)PRRSV，將Marc145 細胞種子以循環(huán)灌注培養(yǎng)方式在5 L 反應器中完成初級培養(yǎng)，經(jīng)消化傳代工藝，將種子細胞放大接種于60 L反應器中進行分批換液式的二級培養(yǎng)，用于PRRSV的大規(guī)模增殖，PRRSV 的增殖滴度可達到108.3TCID50/mL，成功模擬了Marc145 細胞在工業(yè)化水平上的放大培養(yǎng)操作工藝，具備實際應用價值。

全懸浮培養(yǎng)不需要載體，培養(yǎng)細胞的生長密度不受附著物限制，無需胰酶消化，工藝放大相對微載體更簡單，自動化程度高，長期使用成本低，但前期對細胞馴化技術要求較高。目前，實現(xiàn)全懸浮培養(yǎng)的細胞有BHK21、Vero、ST、MDCK、293 細胞等。陳文慶等[5]采用全懸浮培養(yǎng)口蹄疫病毒和狂犬病毒，并與轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)作比較，當BHK21 細胞生長至96 h細胞密度可達5.4×106/mL，成活率維持在94%左右；從細胞數(shù)量比較，650 L 反應器培養(yǎng)一批的細胞數(shù)量相當于500～700 個15 L 轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的細胞總量，且病毒接種12 h 后病毒效價均比轉(zhuǎn)瓶高出約100.25TCID50/mL；而采用70 L 的反應器微載體培養(yǎng)Vero 細胞生產(chǎn)狂犬病毒，其毒價要比15 L 轉(zhuǎn)瓶高出10 倍，生產(chǎn)效率和產(chǎn)品質(zhì)量明顯提高。

3 懸浮培養(yǎng)在豬圓環(huán)疫苗生產(chǎn)中的應用

目前，關于圓環(huán)全病毒培養(yǎng)的研究主要集中于懸浮培養(yǎng)的方式。鄒勇[6]利用生物反應器灌注工藝微載體培養(yǎng)PCV2，其病毒效價可達105.0TCID50/mL。南京農(nóng)業(yè)大學何錫忠[7]利用Celli Gen 生物反應器，高密度懸浮培養(yǎng)PK15 細胞繁殖PCV2，同時設轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)作對照，懸浮培養(yǎng)的病毒毒價為105.0TCID50/mL，而轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的病毒毒價為105.5TCID50/mL。張許科等[8]以聚酯、明膠、多糖為微載體，每克載體加入1.4×107～2.6×107個傳代細胞，使細胞與微載體充分結(jié)合，當傳代細胞培養(yǎng)至5.0×109～8×1010cells/L 時，換用細胞維持液，按照感染復數(shù)為MOI=0.001～1.000 接種PCV2，使病毒與細胞充分接觸，運用潮汐式微載體懸浮培養(yǎng)技術生產(chǎn)的PCV2 病毒毒價可達到106.0～107.0TCID50/mL，其毒價要比轉(zhuǎn)瓶的104.0TCID50/mL 高出100～1 000倍。錢鐘等[9]采用灌注懸浮培養(yǎng)技術繁殖PCV2，病毒效價可達106.5TCID50/mL。華濤等[10]利用生物反應器微載體懸浮培養(yǎng)PK15 細胞，優(yōu)化各重要參數(shù)條件后，收獲PCV2 病毒液效價可達107.25TCID50/mL。

綜合比較，細胞懸浮培養(yǎng)技術在圓環(huán)疫苗生產(chǎn)中的應用優(yōu)勢非常明顯，而且由于全病毒含有病毒全部的抗原決定簇，免疫原性更占優(yōu)勢。因此，預計圓環(huán)全病毒滅活疫苗將會在很長時間占據(jù)國內(nèi)市場，一旦全病毒懸浮培養(yǎng)技術成熟，將從很大程度上提高優(yōu)質(zhì)圓環(huán)全病毒滅活疫苗的產(chǎn)能，進一步提高疫苗質(zhì)量，為豬圓環(huán)病的有效防控提供堅實的保障。