豬口蹄疫病毒MFIA xTAG檢測方法的建立

崔雨葳

遼寧省撫順市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)及扶貧開發(fā)促進中心，遼寧撫順 113006

1 材料與方法

1.1 病毒、毒株、載體和臨床樣本

豬口蹄疫病毒（FMDV）滅活抗原、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）JXA 1 株、豬偽狂犬?。≒RV）活疫苗、豬瘟（CSFV）弱毒疫苗、豬圓環(huán)病毒2 型（PCV2）滅活疫苗、細(xì)小病毒（PPV）滅活疫苗購自商用疫苗。臨床樣本包括：來源于2017-2019年收集到的廣東省各市的水泡液、組織等樣本，-80 ℃保存，臨床樣本共計15 份。

1.2 引物設(shè)計與修飾

設(shè)計1 組用于快速檢測豬口蹄疫病毒的xTAG檢測引物組，用于檢測豬口蹄疫病毒的引物對是根據(jù)豬口蹄疫病毒的3D 基因的保守序列設(shè)計的；經(jīng)過反復(fù)試驗與篩選后，得到表1中引物序列，在上游引物的5’端通過間隔臂序列添加tag 序列，下游引物的5’端添加生物素標(biāo)記[1]。

1.3 方 法

1）核酸提取。從豬場采集的水泡液、組織等樣本裝入離心管中加入適量滅菌的PBS，勻漿；疫苗、組織勻漿液的PBS 溶液等樣品用天根核酸自動抽取儀提取RNA/DNA，操作按說明書進行。

2）質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備。用天根的核酸自動抽取儀提取豬口蹄疫病毒的RNA/DNA 為模板，使用表1中的引物，進行RT-PCR 擴增，將擴增產(chǎn)物分別進行瓊脂糖凝膠電泳檢測并切膠純化[2]。用TaKaRa 公司的試劑盒將純化后的cDNA 連接至pMD-19T 載體中，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5a 感受態(tài)細(xì)胞，挑選單克隆，進行菌落PCR 鑒定，將鑒定為陽性菌的菌落進行質(zhì)粒抽提，并對陽性重組質(zhì)粒測序驗證。用質(zhì)粒提取試劑盒（OMEGA 公司）提取質(zhì)粒，微量紫外分光光度計測定濃度與純度，根據(jù)下面的公式計算拷貝數(shù)。拷貝數(shù)（copies/μL）=6.022×1 023（copies/moL）×DNA 濃度（g/μL）/質(zhì)量MW（g/moL）。其中，MW= DNA 堿基數(shù)（bp）×660 daltons/bp，DNA 堿基數(shù)=載體序列堿基數(shù)+插入序列堿基數(shù)。

表1 豬口蹄疫病毒引物和xTAG 標(biāo)簽

3）xTAG 檢測方法的建立。表1中上游下游引物按等比例進行混合。用FMDV、PRRSV、CSFV、PRV、PPV、PCV2 的核酸為特異性模板，分別進行單重檢測。

4）PCR 擴增反應(yīng)體系。2×buffer，10 μL；上、下游引物混合液，1 μL（10 μmoL/L，final conc.）；酶，1μL；ddH2O，7 μL；總體積20 μL。

5）擴增的反應(yīng)程序。50 ℃30 min；94 ℃變性15 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s；循環(huán)35 次；72 ℃終延伸10 min。PCR 產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析。

6）PCR 產(chǎn)物與熒光編碼微球工作液、鏈霉親和素藻紅蛋白（SA-PE）工作液雜交，包括以下步驟：包被有特異的anti-tag 序列的微球，其中anti-tag 序列能相應(yīng)地與豬口蹄疫病毒引物上的tag 序列互補配對。微球購自luminex 公司，熒光編碼微球號為MTAG-A029[3]。

7）熒光編碼微球工作液的制備。將2 500 個/μL熒光編碼微球用1.1×Tm Hybrdization Buffer 稀釋到1 μL 約含有125 個/種熒光編碼微球。

8）SA-PE 工作液制備。將1 mg/mL SA-PE 用1×Tm Hybrdization Buffer 稀釋到10 μg/μL。充分重懸熒光編碼微球工作液，每個樣品孔和背景孔加入微球工作液20 μL，樣品孔中加入5 μL PCR 產(chǎn)物，背景孔中加入5 μL PCR blank 產(chǎn)物，再加入75 μL SA-PE 工作液，充分混勻，于金屬加熱器中37 ℃孵育30 min。依照檢測儀Luminex 200 儀器的說明將雜交后的50 μL 上述反應(yīng)液進行檢測[4]。

9）最低檢測閾值（cutoff 值）的確定。選取10 只健康豬組織樣品（每個樣品平行重復(fù)3 次），分別讀取MFI 值并計算其平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

10）特異性試驗。使用表1中的混合引物，用FMDV、PRRSV、CSFV、PRV、PPV、PCV2 作為模板進行xTAG 特異性分析檢測。

11）靈敏性試驗。將上述質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品用Easy dilution（Takara 公司）做10 倍系列稀釋，稀釋至10 copies/μL 作為標(biāo)準(zhǔn)模板。利用1.3 4）中優(yōu)化后的反應(yīng)體系和條件測定各稀釋度的熒光信號值。

12）重復(fù)性試驗。對2 份10 倍系列稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品1×105、1×107copies/μL 在同一次反應(yīng)中進行3 次重復(fù)測定，對不同稀釋度的MFI 值進行統(tǒng)計，計算每個樣品各反應(yīng)管之間的批內(nèi)變異系數(shù)（CV%）；對上述樣品分別進行3 次測定，計算同一樣品每次測定結(jié)果之間的批間變異系數(shù)（CV%）。

13）臨床樣本的檢測。從豬場采集的水泡液、組織等樣品，用天根核酸自動抽取儀提取RNA，使用Qiagen 的RT-PCR 進行擴增，以RNA 作為模板，采用上述建立的豬口蹄疫病毒的xTAG 檢測方法進行檢測，擴增產(chǎn)物與熒光編碼微球和SA-PE 雜交，在Luminex200 檢測儀上讀數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

以豬口蹄疫病毒為模板擴增得到產(chǎn)物大小約為208 bp，與預(yù)期目的片段大小相符。與pMD19-T載體連接構(gòu)建重組陽性質(zhì)粒，對重組質(zhì)粒進行PCR鑒定，條帶大小與預(yù)期結(jié)果相符。重組質(zhì)粒的測序結(jié)果與目的基因序列同源性為100%，表明質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備成功。

2.2 xTAG 方法的建立

最低檢測閾值（cutoff 值）的確定：獲得cutoff 值為389，因此將cutoff 值定為400。只有檢測樣品的MFI 值高于400 時，該試驗數(shù)據(jù)才能進行有效分析。待測樣本的分析判斷：①待測樣本的MFI 值＞400時，判斷為陽性樣本；②待測樣本的MFI 值≤400時，判斷為陰性，需要進行重復(fù)試驗或采取其他檢測方法進一步驗證。

2.3 特異性試驗結(jié)果

采用建立的xTAG 方法對FMDV、PRRSV、PPV、PRV、CSFV、PCV2 進行檢測，結(jié)果表明引物僅能擴增出對應(yīng)病原核酸片段，其他病毒均為陰性，表明建立的方法具有良好的特異性。

2.4 靈敏性試驗結(jié)果

對10 倍系列稀釋的質(zhì)粒進行檢測，結(jié)果表明，本試驗建立的液相基因芯片方法檢測的靈敏度可達(dá)1×102copies/μL。

2.5 重復(fù)性試驗結(jié)果

通過對1×105、1×107copies/μL 2 個稀釋度質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品樣本進行重復(fù)性檢測，批內(nèi)及批間重復(fù)性試驗的變異系數(shù)均小于3% ，表明建立的xTAG 方法重復(fù)性好，方法穩(wěn)定可靠。

2.6 xTAG 方法在臨床樣本檢測中的應(yīng)用

應(yīng)用建立的xTAG 檢測方法對15 份樣本進行檢測，5 份水泡液都為陽性，10 份組織均為陰性。

3 小 結(jié)

本試驗根據(jù)豬口蹄疫病毒的3D 基因的保守序列設(shè)計了一對特異性引物，建立了擴增豬口蹄疫病毒的液相基因芯片檢測方法，該方法敏感性高，可達(dá)1×102copies /μL；特異性強，對PRRSV、PRV、PPV、CSFV、PCV2 的檢測結(jié)果均為陰性；批內(nèi)、批間試驗的變異系數(shù)都在3%以下，該方法具有很好的重復(fù)性。本試驗無需電泳，避免了電泳過程中的污染。

應(yīng)用建立的液相基因芯片檢測技術(shù)方法，對廣東某豬場送檢的15 份臨床樣本進行了檢測，檢出陽性率為33.3%。本試驗建立的禽豬口蹄疫病毒的液相基因芯片檢測方法具有快速、靈敏度高、特異性強、重復(fù)性好等優(yōu)點，該液相基因芯片檢測方法的建立可用于豬口蹄疫病毒的臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查，為進一步研究該病的防治具有重要意義。