中醫(yī)藥逆轉(zhuǎn)EGFR-TKIs治療非小細胞肺癌獲得性耐藥研究進展

周晴晴，李慧杰，李秀榮*

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟南 250014)

根據(jù)中國2015年惡性腫瘤發(fā)病和死亡分析報告，肺癌是發(fā)病率、死亡率均居首位的惡性腫瘤[1]。約85%的肺癌患者為非小細胞肺癌(NSCLC)，而在NSCLC患者中表皮生長因子(EGFR)表達率為40%～80%[2]。近年來，分子靶向治療成為繼手術(shù)及化療、放療三大腫瘤經(jīng)典治療方法后的熱門治療手段，尤其是表皮生長因子酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs)的發(fā)展及應(yīng)用使NSCLC的治療取得里程碑式進展[3-4]，臨床試驗PIONEER研究顯示，51.4%隨機的亞裔晚期肺腺癌患者伴有EGFR基因敏感突變，且在不吸煙腺癌患者中該比例高達60%[5]。目前，臨床上使用的EGFR-TKIs有三代，第四代EGFR-TKIs仍在研發(fā)中。三代EGFR-TKIs均表現(xiàn)出優(yōu)于傳統(tǒng)化療的臨床療效，但患者在獲得可觀臨床收益的同時，用藥9～12個月后不可避免的耐藥現(xiàn)象使EGFR-TKIs的臨床應(yīng)用受到極大局限[6]。既往臨床及實驗研究發(fā)現(xiàn)，中藥聯(lián)合EGFR-TKIs可改善患者生活質(zhì)量、進一步延長患者生存期，起到減毒增效的作用，在逆轉(zhuǎn)EGFR-TKIs獲得性耐藥方面有確切療效。本文通過復(fù)習(xí)近10年國內(nèi)外的相關(guān)文獻，對不同中藥提取物、中藥制劑等逆轉(zhuǎn)EGFR-TKIs獲得性耐藥的療效和機制進行綜述，以期為中醫(yī)藥逆轉(zhuǎn)EGFR-TKIs獲得性耐藥提供理論依據(jù)，探討中醫(yī)藥聯(lián)合靶向治療的臨床優(yōu)勢和可行性。

1 EGFR-TKIs獲得性耐藥

2010年哈佛醫(yī)學(xué)院Jackman等[7]將EGFR-TKIs獲得性耐藥準確定義為：①既往接受單藥EGFR-TKIs治療(如吉非替尼、厄洛替尼等)；②符合以下兩種情況中的任意一種：攜帶已知與使用EGFR-TKIs治療的藥物敏感性相關(guān)或客觀臨床獲益相關(guān)的EGFR基因突變(如19外顯子缺失、L858R、G719X、L816Q)的腫瘤；③疾病在至少連續(xù)接受EGFR-TKIs治療30天以后發(fā)生系統(tǒng)性進展(進展指RECIST指或 WHO評價標(biāo)準)；④從停用吉非替尼或厄洛替尼到開始新的治療之間沒有介入的系統(tǒng)治療。該定義相對簡單明確，將患者群體中對EGFR-TKIs的獲得性耐藥問題趨于統(tǒng)一化，最大限度地減少了臨床試驗中假陽性和假陰性活動性信號的報告，并有助于識別真正克服獲得性耐藥性的藥物。

第一代EGFR-TKIs以厄洛替尼、吉非替尼等藥物為代表，其與ATP可逆地與酪氨酸激酶功能域競爭結(jié)合以抑制其磷酸化[8]。第二代EGFR-TKIs，如阿法替尼、達克替尼等，第三代EGFR-TKIs，如奧希替尼等可與酪氨酸激酶功能域不可逆地競爭結(jié)合抑制其磷酸化[9]。眾多臨床研究發(fā)現(xiàn)，使用EGFR-TKIs治療的患者均在開始治療9～12月后不可避免地出現(xiàn)獲得性耐藥[10]。60%的患者因為EGFR在T790M上的突變而產(chǎn)生耐藥作用[11]。第一、二代EGFR-TKIs對獲得性T790M耐藥突變型患者尚未見可喜療效，第三代EGFR-TKIs對此較第一、二代有更明顯的臨床優(yōu)勢[12]，但仍會再次出現(xiàn)耐藥的情況。

目前，T790M二次突變和c-MET基因擴增是EGFR-TKIs產(chǎn)生獲得性耐藥較明確的主要機制[13]。此外還有30%～40%的EGFR-TKIs獲得性耐藥機制還在探索中。已報道的可能的耐藥機制主要分為依賴EGFR通路和非依賴EGFR通路兩類。依賴EGFR通路主要包括EGFR二次突變，非依賴EGFR通路包括人表皮生長因子受體-2(HER2)擴增、Bcl-2蛋白家族促凋亡介質(zhì)(BIM)缺失、HGF/c-MET通路的激活、胰島素樣生長因子1受體(IGF-1R)的活化、RAS突變、磷酸酶和張力蛋白類似物(PTEN)缺失、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)、p53上調(diào)的細胞凋亡調(diào)節(jié)劑(PUMA)表達下調(diào)、白細胞介素-6(IL-6)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)高表達等[14]。

1.1 依賴EGFR通路

依賴EGFR通路主要指EGFR二次突變，其增加了EFRR激酶功能域的ATP親和力，使EGFR-TKIs無法有效阻斷EGFR活化信號從而產(chǎn)生獲得性耐藥，包括T790M突變、C797S突變以其他罕見突變，如D716Y及T854A突變等，其中最常見的是T790M突變[15]。

1.2 非依賴EGFR通路

非依賴EGFR通路包括旁路激活、組織學(xué)轉(zhuǎn)化、下游靶點激活三類途徑[16]。旁路激活是指某些細胞因子活化或激酶激活的旁路途徑，如MET擴增、HER2擴增、IGF活化、IL-6活化、VEGF高表達、核轉(zhuǎn)錄因子kappa B(nuclear factor-κB，NF-κB)信號途徑的激活等。組織學(xué)轉(zhuǎn)化主要指非小細胞肺癌向上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)或小細胞肺癌(SCLC)轉(zhuǎn)化。該途徑是NSCLC上皮細胞在細胞外因子刺激后通過特定程序轉(zhuǎn)化為喪失極性、遷徙能力強的間質(zhì)細胞表型或小細胞肺癌表型的過程，此種轉(zhuǎn)化不易經(jīng)常規(guī)治療后恢復(fù)。下游靶點激活如KRAS、BRAF和PIK3CA突變，以及抑癌基因PTEN和NF-1的缺失等。下游靶點的激活情況可以作為細胞對EGFR-TKIs敏感性的獨立預(yù)測因素。

2 中醫(yī)藥逆轉(zhuǎn)EGFR-TKIs獲得性耐藥的實驗研究

2.1 中藥提取物

康小紅等[17]采用具有抗腫瘤作用的蟾毒靈和吉非替尼分別作用于肺腺癌耐藥H1975細胞裸鼠皮下移植瘤，兩藥聯(lián)合干預(yù)下的瘤組織中p-EGFR、p-PI3K和p-Akt蛋白表達水平較吉非替尼組、蟾毒靈組均有明顯下調(diào)(P<0.01)，因此推斷蟾毒靈阻斷了EGFR-PI3K/Akt信號通路而發(fā)揮逆轉(zhuǎn)吉非替尼耐藥的作用。

歐陽學(xué)農(nóng)等[18]發(fā)現(xiàn)吉非替尼聯(lián)用具有抑癌、抑菌作用的蒽醌衍生物大黃素可顯著降低吉非替尼耐藥細胞株HCC827/GR中p-EGFR、p-ERK1/2、p-MET的表達，認為大黃素逆轉(zhuǎn)EGFR-TKIs耐藥可能和抑制c-Met活化有關(guān)。

盛琦等[19]通過體外實驗研究發(fā)現(xiàn)將中藥有效成分姜黃素作用于肺癌PC9/G2細胞株可逆轉(zhuǎn)其對EGFR-TKIs耐藥，采用RT-PCR法檢測發(fā)現(xiàn)姜黃素可上調(diào)Caspase-3凋亡蛋白的表達并干預(yù)PI3K-Akt通路，這也可能是姜黃素逆轉(zhuǎn)PC9/G2細胞株耐藥的作用機制。張衛(wèi)平等[20]進一步研究了姜黃素對非小細胞肺癌NCI-H1975細胞細胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用，發(fā)現(xiàn)姜黃素聯(lián)合吉非替尼組的p-PI3K、p-Akt、p-Ras、p-ERK的蛋白表達顯著降低，尤其是經(jīng)姜黃素溶液預(yù)處理后的聯(lián)合用藥組，分析姜黃素的逆轉(zhuǎn)耐藥作用與其下調(diào)p-PI3K、p-Akt、p-Ras、p-ERK的蛋白表達水平作用有關(guān)。

王媛等[21]通過實驗發(fā)現(xiàn)紫草素聯(lián)合埃克替尼可明顯抑制肺腺癌耐藥H1975細胞凋亡，Western Blot結(jié)果顯示聯(lián)用組的p-ERK、PARP蛋白表達受抑制，推測紫草素逆轉(zhuǎn)EGFR-TKI耐藥可能是因為聯(lián)用組阻斷了EGFR下游MAPK/ERK和PI3K/Akt信號通路分子活化。

張愛琴等[22]檢測到β-欖香烯聯(lián)合吉非替尼組的人肺腺癌耐藥細胞PC9/ZD中P-糖蛋白(P-gP)及survivin的表達水平明顯降低，分析β-欖香烯可逆轉(zhuǎn)吉非替尼耐藥是因為其明顯降低了耐藥細胞內(nèi)耐藥相關(guān)蛋白P-gP及survivin的表達水平。陳琦等[23]研究了欖香烯逆轉(zhuǎn)由HGF誘導(dǎo)的肺癌PC-9細胞對吉非替尼耐藥的機制，發(fā)現(xiàn)抑制HGF活化和影響c-MET下游信號通路可能是該機制的關(guān)鍵。

朱銀松[24]發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇聯(lián)合吉非替尼干預(yù)的非小細胞肺癌耐藥細胞株P(guān)C9/G細胞中p53、p21、Caspase-3蛋白表達水平升高，白藜蘆醇通過誘導(dǎo)細胞自噬、衰老，阻滯細胞周期，逆轉(zhuǎn)PC9/G細胞對吉非替尼的耐藥性。

戴彭辰[25]通過實驗研究發(fā)現(xiàn)，中藥黃芪的有效成分黃芪甲苷通過促進SIRT6蛋白過表達而抑制NF-κB活化，從而恢復(fù)腫瘤細胞對靶向藥物的藥物敏感性。

蔡雪婷等[26]分別對雙氫青蒿素聯(lián)合吉非替尼對敏感細胞株P(guān)C-9、耐藥細胞株H1975的細胞存活增殖力和EGFR/STAT3信號通路變化情況做了研究，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥指數(shù)值表現(xiàn)優(yōu)于單藥，且雙氫青蒿素在不影響TKI活性的前提下抑制吉非替尼誘導(dǎo)的STAT3反饋激活途徑而抵抗耐藥。

丘韶校等[27]將不同濃度的葫蘆素B作用于吉非替尼耐藥細胞株P(guān)C-9/GR細胞，檢測細胞的增殖抑制、周期抑制及凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)葫蘆素B對細胞增殖抑制、周期阻滯及對p-Jak2、p-STAT3蛋白表達抑制呈濃度依賴，但p-EGFR的激活以及總EGFR、Jak2、STAT3的表達不受影響，由此可見葫蘆素B通過特異性抑制STST3途徑逆轉(zhuǎn)細胞對吉非替尼的耐藥性。

Lou W等[28]通過體外實驗發(fā)現(xiàn)重樓皂苷I有效地恢復(fù)了厄洛替尼獲得性耐藥肺腺癌細胞株HCC827的藥物敏感性，且逆轉(zhuǎn)了腫瘤EMT并抑制了IL-6/STAT3信號通路的激活。

孫偉紅等[29]觀察瑞香狼毒聯(lián)合吉非替尼干預(yù)后的裸鼠總生存期、移植瘤體積和血清中Bcl-2、p-EGFR含量，發(fā)現(xiàn)瑞香狼毒在延緩荷瘤小鼠腫瘤生長速度、延長荷瘤小鼠生存期的同時可顯著降低Bcl-2和p-EGFR的表達，提示抑制EGFR磷酸化和降低Bcl-2凋亡蛋白表達可能是其逆轉(zhuǎn)TKI耐藥的機制。

沈云飛等[30]發(fā)現(xiàn)苦參聯(lián)合吉非替尼使人肺腺癌耐藥細胞PC9/ZD細胞增殖抑制率和細胞凋亡率明顯升高，由于波形蛋白(Vimentin)及N-鈣黏蛋白(N-cadherin)表達下調(diào)，E-鈣黏蛋白(E-cadherin)表達上調(diào)現(xiàn)象明顯，考慮苦參通過改善細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化而提高耐藥細胞對吉非替尼的藥物敏感性。

張郜晨茜等[31-32]從EGFR/PI3K/Akt通路著手研究南方紅豆杉水提物協(xié)同吉非替尼對人肺腺癌細胞增殖的抑制作用，發(fā)現(xiàn)水提物逆轉(zhuǎn)吉非替尼耐藥與T790M突變和c-MET擴增有關(guān)，而抑制HGF/Met/PI3K/Akt信號通路是克服阿法替尼耐藥的關(guān)鍵。

2.2 中藥制劑

消癌平注射液(Xap)是中藥通關(guān)藤的精提取物是臨床上常用于肺癌、消化道腫瘤和白血病等多種惡性腫瘤的中藥注射液。韓淑燕等[33]用免疫組化法和Western蛋白印跡法研究Xap對吉非替尼耐藥細胞H460和H1975荷瘤裸鼠的療效及其機制，實驗中發(fā)現(xiàn)抑制EGFR下游信號通路PI3K/Akt/mTOR和ERK活化可能是Xap逆轉(zhuǎn)吉非替尼耐藥的機制。

張帆[34]通過一系列實驗方法研究康萊特注射液及吉非替尼處理后的人肺腺癌A549細胞，檢測到聯(lián)合組p-Akt及c-Met在轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平均明顯下調(diào)，提示PI3K/Akt通路的Akt磷酸化下調(diào)與c-Met/ErbB3/PI3K通路的c-Met表達降低是康萊特注射液抑制吉非替尼耐藥的重要因素。

Pan Z等[35]采用Western blotting法檢測參芪扶正注射液(SFI)處理過的PC-9和PC-9/GR細胞中p-MEK、p-ERK和SREBP1的表達，MTT法檢測細胞增殖，劃痕實驗檢測細胞遷移，探討MAPK/SREBP1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在吉非替尼耐藥中的作用。發(fā)現(xiàn)SFI通過抑制MAPK/SREBP1通路調(diào)節(jié)對吉非替尼的耐藥性，SFI聯(lián)合吉非替尼可增強吉非替尼與EGFR的結(jié)合，從而恢復(fù)細胞對吉非替尼的敏感性。

孫璽媛等[36]使用金復(fù)康口服液作用于人肺腺癌PC-9細胞，研究其對吉非替尼耐藥細胞的逆轉(zhuǎn)作用，通過Western-Blot及RT-PCR研究發(fā)現(xiàn)金復(fù)康口服液與吉非替尼聯(lián)合組相較于吉非替尼單藥組，其P-EGFR蛋白及P-EGFR mRNA的表達均有顯著降低，說明其逆轉(zhuǎn)耐藥的機制可能與下調(diào)P-EGFR的表達有關(guān)。

蔣立峰等[37]采用清肺化瘀解毒方(由葦莖、薏苡仁、冬瓜仁、桃仁、夏枯草、蜈蚣、全蟲、魚腥草、雞內(nèi)金組成)和吉非替尼聯(lián)合干預(yù)吉非替尼獲得性耐藥細胞株A549/R，增殖和凋亡實驗提示該方有逆轉(zhuǎn)吉非替尼獲得性耐藥的作用，進一步Western-Blot及RT-PCR實驗結(jié)果顯示聯(lián)合組A549/R的CMET、IGF-1R蛋白及mRNA表達水平受到明顯抑制，提示下調(diào)CMET、IGF-1R表達可能是清肺化瘀解毒方逆轉(zhuǎn)吉非替尼獲得性耐藥的關(guān)鍵。

陳舒怡等[38]采用MTT法、流式細胞術(shù)、Western-Blot法探究養(yǎng)陰解毒方聯(lián)合吉非替尼抑制由于T790M突變產(chǎn)生的TKI耐藥機制，實驗結(jié)果表明聯(lián)合組細胞增殖被明顯抑制，Caspase-3、Cleave Caspase-3、PARP、Cleave PARP等凋亡相關(guān)蛋白的表達水平明顯升高，因此認為養(yǎng)陰解毒方逆轉(zhuǎn)T790M突變的耐藥株H1975細胞對吉非替尼的與上調(diào)Caspase-3、Cleave Caspase-3、PARP、Cleave PARP蛋白有關(guān)。

羅楊等[39]研究了除痰解毒方對人肺腺癌耐藥細胞株H1975裸鼠移植瘤EMT相關(guān)蛋白表達的影響，發(fā)現(xiàn)除痰解毒方不同程度地上調(diào)上皮型標(biāo)志物E-cadherin蛋白及mRNA的表達，下調(diào)EMT核心轉(zhuǎn)錄因子Snail和間質(zhì)型標(biāo)志物Vimentin蛋白及mRNA的表達，除痰解毒方通過EMT途徑逆轉(zhuǎn)吉非替尼耐藥機制可能與調(diào)控EMT相關(guān)蛋白的表達有關(guān)。

3 中醫(yī)藥逆轉(zhuǎn)EGFR-TKIs獲得性耐藥的臨床研究

近年來，中醫(yī)藥聯(lián)合EGFR-TKIs治療非小細胞肺癌的臨床研究不斷涌現(xiàn)，通過學(xué)習(xí)近年來的相關(guān)文獻，歸納總結(jié)相關(guān)研究后有如下發(fā)現(xiàn)。

康小紅等[40]通過臨床觀察發(fā)現(xiàn)益氣養(yǎng)精、解毒散結(jié)的肺巖寧方使吉非替尼/厄洛替尼治療的EGFR突變晚期肺腺癌患者有更好的生存獲益，聯(lián)合治療組的中位無進展生存期(mPFS)較靶向單藥組顯著延長。益氣通絡(luò)解毒方是具有益氣通絡(luò)扶正、解毒散結(jié)功效的安徽省立醫(yī)院中醫(yī)腫瘤科自配方，張慧敏等[41]觀察統(tǒng)計后得出，益氣通絡(luò)解毒方聯(lián)合靶向治療組的PFS為29.5個月，較單純靶向治療組的PFS為12.4個月有顯著差異。茆俊卿教授以其臨床經(jīng)驗自擬的扶正抗癌方具有益氣補中、健脾益肺、活血化瘀、化痰散結(jié)、清熱解毒的功效。柴小姝等[42]通過觀察51例EGFR基因突變的中晚期NSCLC患者發(fā)現(xiàn)扶正抗癌方可有效延長患者的(OS)和(無進展生存期)PFS?，F(xiàn)有實驗研究表明，益氣養(yǎng)陰扶正、解毒散結(jié)之益氣養(yǎng)陰解毒方可抑制Lewis肺癌細胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，張敏等[43]發(fā)現(xiàn)益氣養(yǎng)陰解毒方改善了患者的mPFS(9.00個月：7.70個月，P<0.05)。中藥人參提取物人參皂苷Rg3在拮抗血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)抑制血管新生進而抗腫瘤方面證實有效[44]，江冠銘等[45]發(fā)現(xiàn)經(jīng)人參皂苷Rg3聯(lián)合奧希替尼治療的實驗組患者mPFS為16個月，優(yōu)于經(jīng)奧希替尼單藥治療的對照組患者的13個月。

4 結(jié)語

關(guān)于EGFR-TKIs治療NSCLC獲得性耐藥的研究是目前腫瘤靶向治療的難點和熱點。前期相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，EGFR-TKIs治療NSCLC產(chǎn)生獲得性耐藥的機制涉及EGFR二次突變、旁路激活、組織學(xué)轉(zhuǎn)化及下游靶點激活等多方面，且不同耐藥機制之間相互聯(lián)系和影響，可見其耐藥機制的復(fù)雜性和多變性。無論是否依賴EGFR通路介導(dǎo)的獲得性耐藥，調(diào)控癌細胞的生長、增殖、轉(zhuǎn)移及凋亡均需要RAS/RAF/MAPK/ERK、PI3K/Akt/mTOR和STAT3條下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的持續(xù)活化，這為探尋逆轉(zhuǎn)EGFR-TKIs獲得性耐藥的有效藥物奠定了良好基礎(chǔ)。

盡管新一代EGFR-TKIs不斷被研發(fā)與應(yīng)用，創(chuàng)新性耐藥防治策略不斷涌現(xiàn)，但耐藥現(xiàn)象仍未得到解決。中藥具有多途徑、多靶點、多重藥理學(xué)效應(yīng)、不易產(chǎn)生耐藥性等特點，能通過調(diào)控多個通路實現(xiàn)抗腫瘤生成效應(yīng)。因此，中藥在改善、延緩甚至逆轉(zhuǎn)EGFR-TKIs獲得性耐藥方面具有長足優(yōu)勢。雖然中藥聯(lián)合EGFR-TKIs治療NSCLC有效性和優(yōu)越性突出，但是，該研究現(xiàn)狀仍具有一定的困難和局限，如缺乏前瞻性、大樣本、多中心臨床研究數(shù)據(jù)，缺乏體內(nèi)實驗證據(jù)，許多研究缺乏嚴謹?shù)目蒲性O(shè)計，難以提出有力的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)，腫瘤內(nèi)部異質(zhì)性影響活檢標(biāo)本的代表性，耐藥機制尚不明確，逆轉(zhuǎn)耐藥機制大多籠統(tǒng)歸納為下游靶點激活而對具體耐藥機制的介紹模糊中藥水煎劑成分難以穩(wěn)定、中藥臨證應(yīng)用靈活多變，缺乏最優(yōu)的給藥時機、途徑和方式的探尋等問題仍有待解決。對于中藥逆轉(zhuǎn)EGFR-TKIs治療NSCLC產(chǎn)生獲得性耐藥的研究仍處于探索階段，進一步探究中醫(yī)藥治療的優(yōu)勢和機制，以及臨床的有效性、安全性是今后的重要課題。