NF-κB/iNOS-NO信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的臨床研究進(jìn)展*

史丙科 李守林

中國醫(yī)科大學(xué)深圳市兒童醫(yī)院,廣東省深圳市 518038

1980年Furchgott等發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞可合成并產(chǎn)生血管內(nèi)皮舒張因子(EDRF),隨后Palmer等研究其化學(xué)本質(zhì)為一氧化氮(NO)，在呼吸、心腦血管、神經(jīng)、免疫調(diào)節(jié)等領(lǐng)域起到重要的生物學(xué)作用。誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)目的基因啟動子κB序列位點(diǎn)(GGGACTTCC)被內(nèi)毒素、細(xì)胞因子、炎癥因子、活性氧(ROS)所激活從而上調(diào)表達(dá)產(chǎn)生大量致病性NO，高濃度的致病性NO是一種氮自由基(RNS)，可引起DNA氧化損傷、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡[1]。本文從iNOS的結(jié)構(gòu)和功能出發(fā)，闡述其對核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB及NO的影響，并簡單綜述NO與臨床疾病的關(guān)系。

1 iNOS的結(jié)構(gòu)及功能

一氧化氮合酶(NOS)分布于生物體內(nèi)各種細(xì)胞，大致分為組成型一氧化氮合酶(cNOS)和iNOS，其中cNOS又分為神經(jīng)型一氧化氮合酶(nNOS)和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)，目前可以用序號命名NOS，即NOSⅠ/Ⅱ/Ⅲ，分別替代nNOS，iNOS和eNOS[2]。iNOS在細(xì)胞中通常不表達(dá)，但可以由細(xì)菌脂多糖(LPS)、細(xì)胞因子和其他因子誘導(dǎo)，主要在巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，只要確定了合適的誘導(dǎo)劑，酶的表達(dá)幾乎可以在任何細(xì)胞或組織中被刺激，并且一旦表達(dá)，iNOS就會持續(xù)活躍，不受細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的調(diào)控。iNOS的調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平產(chǎn)生重要介質(zhì)NO。近年來，多種研究表明，iNOS是NF-κB介導(dǎo)的重要調(diào)控因子，與免疫應(yīng)答、氧化損傷及炎癥反應(yīng)有著密切的聯(lián)系[3]。

2 NF-κB與iNOS基因

30余年前，Sen和Baltimore通過研究發(fā)現(xiàn)核因子NF-κB可以與多種基因序列中的啟動子和增強(qiáng)子發(fā)生特異性結(jié)合，進(jìn)而啟動基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控進(jìn)程，并在細(xì)胞免疫及炎癥相關(guān)反應(yīng)參與疾病的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。核因子NF-κB，是細(xì)胞中重要的轉(zhuǎn)錄因子，NF-κB家族有NF-κB1(p50及前體p105)、NF-κB2(p55及前體p100)、相關(guān)因子A(RelA)、核因子c-Rel及相關(guān)因子B(RelA)5個成員組成。P50/p65NF-κB二聚體能與免疫球蛋白κ輕鏈基因增強(qiáng)子κB基序(GGGACTTTCC)結(jié)合；RelA/c-Rel二聚體，能與靶基因增強(qiáng)子的κB基序結(jié)合。研究發(fā)現(xiàn)[4]，NF-κB信號激活通路主要有三種：炎癥因子腫瘤壞死因子(TNF)-α/IL-1/丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)/LPS等激活的經(jīng)典通路；B細(xì)胞中，LT-β/TNF家族成員TALL-1受體(BAFF-R)、B細(xì)胞腫瘤壞死因子激活因子(BAFF)BAFF-R、CD40L/CD40、Blys/LT-βR可誘導(dǎo)非經(jīng)典信號通路活化；適當(dāng)水平ROS活化PTK使IκBα(NF-κB抑制蛋白)磷酸化降解，以及糖原合成酶激酶(GSK)-3β、磷酸化P65等組成的其他通路。

iNOS基因在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)。最近，有研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)核分枝桿菌PPE家族成員PPE2蛋白有一個亮氨酸拉鏈DNA結(jié)合基序,可能與鄰近iNOS基因啟動子TATA盒的GATA-1-binding寡核苷酸近端特異性盒濃度依賴性結(jié)合，此為iNOS基因轉(zhuǎn)錄重要組成部分[5]。根據(jù)研究表明，人iNOS基因啟動子與鼠類iNOS基因啟動子序列結(jié)構(gòu)類似，說明NF-κB也參與人iNOS基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[6]。

3 NF-κB/iNOS-NO信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路存在于多種生物體細(xì)胞的免疫、抗凋亡、炎癥反應(yīng)及增殖分化反應(yīng)中，而iNOS和NO是NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中重要的兩種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子[7]。iNOS基因的啟動子序列含有κB位點(diǎn)(GGGACTTTCC)，與NF-κB特異結(jié)合，從而啟動基因的轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生大量NO。NO的化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，半衰期過短，在負(fù)氧離子存在時易失活，而存在超氧化物歧化酶(SOD)和酸性pH條件時相對穩(wěn)定。NO可調(diào)節(jié)NF-κB水平:生理性NO能減輕中性粒細(xì)胞的毒性作用，抑制核因子NF-κBp65向核移位，抑制黏附分子表達(dá)，下調(diào)相關(guān)黏附分子水平，保護(hù)血管壁完整性，生理性NO本身能作為NOS的負(fù)反饋抑制劑，使NF-κB水平上升，NF-κB/iNOS-NO信號通路活化，抗凋亡。相反，在高水平致病性NO作用下，抑制IκB磷酸化及降解，可使NF-κB的抗凋亡活性被抑制；內(nèi)源性生理性NO部分與氧結(jié)合形成過氧化亞硝酸陰離子 (ONOO-)，進(jìn)而引起脂質(zhì)過氧化，損傷內(nèi)皮細(xì)胞功能，還有部分與體內(nèi)半胱氨酸殘基(有巰基)的蛋白/谷胱甘肽(GSH)等反應(yīng)，生成硫化亞硝基蛋白/硫化亞硝基硫醇，硫化亞硝基硫醇在酸性PH條件下釋放的NO隨呼出氣體排出體外[8]。高水平致病性NO可與線粒體呼吸鏈中呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ/Ⅱ、DNA合成酶、DNA連接酶等的Fe-S基團(tuán)結(jié)合，破壞它們的活性，產(chǎn)生細(xì)胞毒作用；能通過cADP-核糖通路激活NAD葡萄糖水解酶、CD38樣雙功能酶、ADP核糖轉(zhuǎn)移酶和水解酶、多聚(ADP-核糖)合成酶等，產(chǎn)生細(xì)胞毒作用，使細(xì)胞凋亡。過量的致病性NO通過Cox2(環(huán)氧合酶-2)可促使中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞增殖，產(chǎn)生iNOS,又大量產(chǎn)生NO,入血后結(jié)合亞鐵血紅素的Fe2+，形成大量亞硝?；F，損傷血紅蛋白對氧的運(yùn)輸、細(xì)胞呼吸、能量代謝等，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生[9]。

4 NO與臨床的關(guān)系

4.1 NO與呼吸系統(tǒng)疾病 NO在呼吸系統(tǒng)調(diào)節(jié)氣道和血管平滑肌、黏液轉(zhuǎn)運(yùn)以及肺發(fā)育、肺損傷中起到重要作用，適量的生理性NO對人體產(chǎn)生正向保護(hù)作用，但過量致病性NO具有細(xì)胞毒作用[10]。氣道在炎癥情況下，TNF-α可誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞iNOS基因持續(xù)表達(dá)，進(jìn)而產(chǎn)生大量致病性NO,引起炎癥反應(yīng)，增加氣道通透性導(dǎo)致滲出和水腫。致病性NO與炎癥細(xì)胞產(chǎn)生的O2-,可生成過氧亞硝酸鹽，使氣道發(fā)生炎性損傷[11]。肺纖維化由肺成纖維細(xì)胞分泌的膠原纖維增生聚集導(dǎo)致結(jié)構(gòu)重塑，肺泡巨噬細(xì)胞異?；罨痠NOS釋放大量致病性NO，導(dǎo)致肺成纖維細(xì)胞大量增生并分泌膠原分子，最終引起肺纖維化。目前，抑制iNOS-NO通路，可明顯改善肺纖維化。有研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌患者中，高/低水平NO與患者的晚期或者較差的生存率有關(guān)，持續(xù)中等水平NO可促進(jìn)肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的侵襲作用。NO依賴性的炎癥細(xì)胞浸潤及IgG、IgA免疫復(fù)合物可引起急性肺損傷，給予硝普鈉促進(jìn)生理性NO適量增加，肺水腫可明顯減輕，NO還可抑制NADOH氧化酶產(chǎn)生O2-,減少多形核細(xì)胞對血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附及肺部的浸潤[12]。接觸職業(yè)性暴露因素二氧化硅等可引起肺巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞iNOS表達(dá)產(chǎn)生大量致病性NO，誘發(fā)肺部組織炎癥反應(yīng)，了解其發(fā)病機(jī)制，有助于增強(qiáng)對肺部職業(yè)疾病的預(yù)防和調(diào)控,因此，可通過應(yīng)用抑制劑來保證NO處于正常生理水平，或許可以成為治療肺部纖維化相關(guān)疾病的新藥靶點(diǎn)。

4.2 NO與心血管系統(tǒng)疾病 NO是幾種最常見心血管疾病的危險因素之一。硝酸甘油在臨床上治療心血管疾病已經(jīng)有150多年的歷史，直到20世紀(jì)70年代末，其作用成分被證實(shí)為NO。生理性NO可以調(diào)節(jié)血管張力，促使冠脈擴(kuò)張增加側(cè)支循環(huán)，增加對心肌的保護(hù)作用；致病性NO，可經(jīng)cGMP/PKG通路上調(diào)NF-κB/TNF-α,TNF-αK可刺激產(chǎn)生iNOS進(jìn)而產(chǎn)生大量NO，在冠心病、高脂血癥患者血管內(nèi)，促進(jìn)氧化應(yīng)激，可引起脂質(zhì)、DNA、蛋白質(zhì)的過氧反應(yīng)產(chǎn)生細(xì)胞毒作用，進(jìn)而發(fā)生炎癥反應(yīng)、功能失常、器官衰竭等改變[13]。高水平持續(xù)病理性NO可降低心肌細(xì)胞收縮力，引起心肌功能障礙。目前部分研究已證實(shí)NO與心血管系統(tǒng)存在緊密聯(lián)系，通過抑制NF-κB/iNOS-NO信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可能為臨床提供新的科研方向。

4.3 NO與消化系統(tǒng)疾病 低水平NO可降低因應(yīng)激、藥物等引起的氧自由基減少到最后的胃黏膜損害，NO可通過維持胃黏膜組織氧合作用來保證HCO3-以及相關(guān)營養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸并且加速有毒物質(zhì)的清除。作為重要的神經(jīng)遞質(zhì)，幽門括約肌及oddi括約肌等均受NO的調(diào)控，故對胃腸動力起到重要作用。幽門螺旋桿菌激活NF-κB/iNOS-NO信號通路導(dǎo)致慢性萎縮性胃炎。Rashed等[14]研究發(fā)現(xiàn)消化性潰瘍患者與對照組相比NO含量下降，胃酸分泌的能力及胃黏膜保護(hù)作用降低。研究發(fā)現(xiàn)iNOS誘導(dǎo)產(chǎn)生的NO在抵抗病菌感染方面同樣發(fā)揮重要的作用，NF-κB、TNF-α、IL-17A、IL-8、INF(干擾素)-γ可刺激炎癥細(xì)胞表達(dá)iNOS產(chǎn)生致病性NO，引起結(jié)腸組織水腫、充血以及功能障礙[15]。IL-6可通過NF-κB/iNOS-NO信號通路激活肝星狀細(xì)胞，進(jìn)而增生和分泌細(xì)胞外基質(zhì)參與肝纖維化的形成和肝內(nèi)機(jī)構(gòu)的重建?；谏鲜鲅芯?，NF-κB/iNOS-NO信號通路是引起消化系統(tǒng)炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制之一。

4.4 NO與泌尿系統(tǒng)疾病 NO在腎組織損傷的作用有雙重性，早期腎組織nNOS、eNOS合成NO，其擴(kuò)血管，抑制血小板聚集大大保護(hù)腎組織損傷，在晚期，系膜和腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生的NO可能加劇損傷，部分原因是這些細(xì)胞被炎癥因子刺激后iNOS表達(dá)，從而加重腎損傷[16]。NO主要調(diào)節(jié)腎血流動力學(xué)及腎小球微循環(huán)，Kiyotaka Mukai等研究在麻醉小鼠NO抑制劑L-NAME可增強(qiáng)血管收縮并伴有腎功能不全。膀胱癌患者中NO等氧化劑含量較高，提示氧自由基在膀胱癌中發(fā)揮重要的作用。脊髓損傷可導(dǎo)致逼尿肌—外括約肌協(xié)同障礙，從而引起膀胱出口梗阻，研究表明，增加NO供體引起其在尿道濃度增高可減輕尿道壓力,這種治療方式可在一定程度緩解脊髓損傷帶來的膀胱出口梗阻問題[17]。近些年，NO與神經(jīng)源性膀胱的關(guān)系成為研究熱點(diǎn)，但其具體作用機(jī)制尚未明了，通過建立膀胱出口梗阻動物模型，選擇性抑制NF-κB/iNOS-NO信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路靶點(diǎn)，可以提供新的治療策略。

4.5 NO與神經(jīng)系統(tǒng)疾病 中樞神經(jīng)系統(tǒng)氧化應(yīng)激時，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)氧化作用增強(qiáng)，抗氧化作用減弱，ROS及活性氮(RNS)水平明顯上調(diào)，引發(fā)過氧化反應(yīng)、硝基化反應(yīng)，可能使細(xì)胞的蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)以及細(xì)胞因子被損傷，進(jìn)而引起炎癥、異常收縮及細(xì)胞凋亡[18]。而高水平致病性NO產(chǎn)生原因有：一是大量乙酰膽堿、緩激肽的刺激；二是IL-1、TNF-α、INF-γ水平明顯上調(diào)；三是細(xì)胞質(zhì)鈣離子、脂多糖、內(nèi)毒素等水平明顯上調(diào)；此時腦血管內(nèi)皮細(xì)胞，膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞產(chǎn)生大量iNOS、NO、ROS、RNS。高水平NO還會導(dǎo)致腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌的下調(diào)，而腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子對神經(jīng)元的存活、發(fā)育和分化、突觸形成以及學(xué)習(xí)和記憶至關(guān)重要。阿爾茨海默病(AD)是一種典型的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變，少突膠質(zhì)細(xì)胞(OLS)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的髓鞘形成細(xì)胞，髓鞘損傷可能與AD的認(rèn)知功能障礙有關(guān)，研究表明一氧化氮(NO)作為一種信號分子，可能通過單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(MCT1)影響能量傳輸機(jī)制進(jìn)而對軸突和髓鞘產(chǎn)生作用[19]。帕金森病時過高水平致病性NO、ROS、RNS參與毒物1甲基4苯基1236四氫吡啶(MPTP)引起腦酪氨酸羥化酶的硝基化失活，下調(diào)多巴胺水平，過高水平致病性NO激活多聚(ADP-核糖)聚合酶，阻斷DNA修復(fù)并損傷神經(jīng)細(xì)胞。通過選擇性實(shí)用NOS抑制劑，如L-精氨酸類似物、糖皮質(zhì)激素、抗氧化劑、前列腺素E2能抑制NOS合成，保護(hù)多巴胺神經(jīng)元，也可以擴(kuò)張腦血管，增加腦血流量[20]。

但是臨床疾病成因及發(fā)展機(jī)制相對復(fù)雜，各個信號通路相互影響，單純抑制NF-κB/iNOS-NO信號通路效果一般，隨著研究的深入，對部分疾病作用機(jī)制的認(rèn)識越來越全面，因此，掌握NF-κB/iNOS-NO信號通路具體作用機(jī)制，會對未來臨床實(shí)踐產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。