單個(gè)核細(xì)胞治療骨關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展

張文博 趙東寶

（海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，上海 200433）

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis） 是以軟骨破壞為特征，由機(jī)械性、代謝、炎癥和免疫等因素造成的關(guān)節(jié)疾患。一般分為骨性關(guān)節(jié)病、退行性關(guān)節(jié)炎（病）、增生性關(guān)節(jié)炎 、老年性關(guān)節(jié)炎等，是常見(jiàn)病、多發(fā)病，好發(fā)于負(fù)重大、活動(dòng)多的關(guān)節(jié)，如膝、脊柱（頸椎和腰椎）、髖、踝、手等關(guān)節(jié)，特別是膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA），我國(guó)總體患病率為18%[1]～22.8%[2]，且隨年齡增加，發(fā)病率逐步提高[3]， 60歲人群患病率約50%，70歲人群約60%，80歲以上人群則可高達(dá)80%左右，我國(guó)約有1.2億骨關(guān)節(jié)炎患者，且該病的致殘率可高達(dá)53%。傳統(tǒng)的骨關(guān)節(jié)炎治療，一般采用物理、藥物、手術(shù)等治療方法，可減輕患者癥狀，但不能阻止病程進(jìn)展。近年來(lái)，臨床應(yīng)用較多的玻尿酸（hyaluronan）關(guān)節(jié)注射，可以減輕疼痛癥狀、減少關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)損傷，但降低炎癥反應(yīng)作用不明確、不能修復(fù)軟骨缺損，且長(zhǎng)期治療失去效果[4]。

單個(gè)核細(xì)胞（mononuclear cells，MNCs）是指具有單個(gè)細(xì)胞核的細(xì)胞總稱(chēng)，包含有多種異質(zhì)性細(xì)胞群，如多種干/祖細(xì)胞、免疫細(xì)胞、前體細(xì)胞等，在治療骨關(guān)節(jié)炎時(shí)，可以發(fā)揮不同細(xì)胞的協(xié)調(diào)作用。目前骨關(guān)節(jié)炎治療研究涉及的MNCs，有骨髓、外周血、臍血、脂肪源性的MNCs等。大量研究證明，MNCs關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射，對(duì)骨關(guān)節(jié)炎有良好的治療效果，且具有來(lái)源豐富 、易于采集、制備便捷、經(jīng)濟(jì)、低免疫原性、移植耐受性好等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。為給大量骨關(guān)節(jié)炎患者探尋一種便捷、經(jīng)濟(jì)、安全、可靠、有效的治療方法，現(xiàn)對(duì)MNCs制備方法，細(xì)胞組成，治療骨關(guān)節(jié)炎的效果、機(jī)制、安全性等實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)行綜述。

1 單個(gè)核細(xì)胞的分離和主要成分

1.1 骨髓單個(gè)核細(xì)胞

骨髓單個(gè)核細(xì)胞（bone marrow mononuclear cells，BM-MNCs）是具有單個(gè)核的細(xì)胞混合群體。目前分離BMMNCs方法，有密度梯度離心法、流式細(xì)胞分選法和免疫磁珠法等。常用為聚蔗糖（Ficoll）密度梯度離心法，方法簡(jiǎn)單、污染機(jī)會(huì)少、操作時(shí)間短，比較適合臨床應(yīng)用。

BM-MNCs的細(xì)胞種類(lèi)，一般認(rèn)為，含有造血干/祖細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞和血液內(nèi)的單個(gè)核細(xì)胞3類(lèi)，包括間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）、造血干細(xì)胞、造血祖細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等[5]，但各種細(xì)胞的含量及種類(lèi)，受年齡、身體狀況等因素的影響。骨髓濃縮物（bone marrow aspirates concentrate，BMAC）制備方法與成分與BM-MNS相似。

1.2 外周血單個(gè)核細(xì)胞

外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMNCs）的分離方法目前已經(jīng)相對(duì)成熟，常用Ficoll密度梯度離心法和 Percoll非連續(xù)密度梯度分離法。Ficoll密度梯度離心法，由于操作簡(jiǎn)便、價(jià)格低廉等原因更為常用[6]。

PBMNCs是外周血中具有單個(gè)核的細(xì)胞，主要包括單核細(xì)胞、免疫細(xì)胞和干/祖細(xì)胞。免疫細(xì)胞有T、B淋巴細(xì)胞，吞噬細(xì)胞，樹(shù)突狀細(xì)胞等；干/祖細(xì)胞占單個(gè)核細(xì)胞的 0.01%～0.10%，以造血干細(xì)胞為主，亦有部分間充質(zhì)干細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞[7]。干細(xì)胞動(dòng)員后，干細(xì)胞含量大量提高。

1.3 臍血單個(gè)核細(xì)胞

臍血單個(gè)核細(xì)胞（cord blood mononuclear cells，CBMNC）是胎兒臍帶血中具有單個(gè)核的細(xì)胞。CB-MNC分離方法主要有：6 % 羥乙基淀粉（HES）分離法、3 % 明膠分離法、Ficoll 分離法、氯化鐵溶解紅細(xì)胞法以及直接離心法等。一般認(rèn)為，6%HES法封閉運(yùn)行、污染機(jī)會(huì)少， 所需時(shí)間短， MNC 回收率高。目前常用HES、Ficoll 分離法[8]。

CB-MNC的細(xì)胞種類(lèi)，大概可以分為血細(xì)胞、免疫細(xì)胞、干/祖細(xì)胞。血細(xì)胞有尚未發(fā)育成熟的紅、白細(xì)胞，單核細(xì)胞等；免疫細(xì)胞主要是淋巴細(xì)胞；干/祖細(xì)胞，種類(lèi)較多，比如造血干細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞、淋巴母細(xì)胞、骨髓細(xì)胞等。Karlupia 等[9]研究顯示，HUCB-MNC中含有一定數(shù)量的神經(jīng)干細(xì)胞和小胚胎干細(xì)胞，以及內(nèi)皮細(xì)胞。陳超等[10]利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)HUCB-MNCs，結(jié)果顯示表 達(dá)CD16（31.90%±3.67%）、CD29（71.50%±0.56%）、 CD34（3.05%±1.06%）、CD45（91.65%±9.69%）、CD73（18.90%±4.38%） 和 CD90（43.70%±0.42%）， 以 表 達(dá) CD45，CD29和 CD90的淋巴細(xì)胞為多 。

1.4 脂肪基質(zhì)細(xì)胞

脂肪組織去除成熟脂肪細(xì)胞后，其余細(xì)胞成分被稱(chēng)為脂肪基質(zhì)血管組分 （stromal vascular fraction， SVF ）、或脂肪基質(zhì)細(xì)胞、或脂肪源性基質(zhì)細(xì)胞（adipose-derived stromal cell， ADSC）。獲取的方法，常用酶消化法、推注破碎法和超聲波法，其中超聲波法又分為接觸式超聲波法和非接觸式超聲波法。破碎成熟脂肪細(xì)胞后，通過(guò)離心，獲得基質(zhì)細(xì)胞。研究證明，非接觸式超聲波法沒(méi)有消化酶殘留、污染概率小、細(xì)胞活性好[11]。

Zuk等[12]2001年，從抽脂手術(shù)廢棄的脂肪組織中，分離出與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)相似的細(xì)胞，將其命名為脂肪源性干細(xì)胞，首次證明了脂肪組織中含有間充質(zhì)干細(xì)胞。研究證明，基質(zhì)血管組分含有內(nèi)皮細(xì)胞、非特征性的基質(zhì)細(xì)胞、血液細(xì)胞和組織型巨噬細(xì)胞，其中有核細(xì)胞包括37%白細(xì)胞、造血祖細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞（CD45+），35%脂肪干細(xì)胞（CD31-、CD34+、CD45-）[13]。目前一般認(rèn)為，脂肪干細(xì)胞的含量受年齡的影響較小。

2 單個(gè)核細(xì)胞治療關(guān)節(jié)滑膜炎

骨關(guān)節(jié)炎是涉及軟骨、軟骨下骨和滑膜炎癥的復(fù)雜和多組織病理改變性疾病。Benito等[14]研究顯示，滑膜炎癥在骨關(guān)節(jié)炎出現(xiàn)較早，甚至在可見(jiàn)的軟骨變性發(fā)生之前，滑膜就出現(xiàn)內(nèi)膜增厚，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，血管形成，血管生成因子、核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）活化，腫瘤壞死因子α （TNFα）、白細(xì)胞介素（IL）1b、環(huán)加氧酶（COX）-1、COX-2表達(dá)；且滑膜炎癥持續(xù)骨關(guān)節(jié)炎的全過(guò)程。炎癥介質(zhì)在早期骨性關(guān)節(jié)炎中的過(guò)度表達(dá)，可能反映了相關(guān)病理生理通路的激活增加，這些通路有助于患者的軟骨退化。Mathiessen等[15]分析總結(jié)了2017年之前，骨關(guān)節(jié)炎滑膜炎的病理生理學(xué)和流行病學(xué)的研究，得出滑膜炎與骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)疼痛、功能差有關(guān)，是影像學(xué)骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病和結(jié)構(gòu)進(jìn)展的獨(dú)立驅(qū)動(dòng)因素，并認(rèn)為治療滑膜炎是減少骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)疼痛、阻止骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展的關(guān)鍵措施。

Menarim等[16]利用放射加脂多糖（ lipopolysaccharide）注射馬腕關(guān)節(jié)滑膜炎模型，研究了自體BM-MNCs關(guān)節(jié)內(nèi)注射，對(duì)滑膜炎的治療效果與機(jī)制。分別于單個(gè)核細(xì)胞注射后24、96h和144 h收集滑膜液，進(jìn)行細(xì)胞學(xué)、細(xì)胞因子定量和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)；144 h時(shí)，對(duì)馬實(shí)施安樂(lè)死，宏觀評(píng)估關(guān)節(jié)，收集滑膜進(jìn)行組織學(xué)和免疫組織化學(xué)檢查。結(jié)果顯示，BM-MNCs治療后96 h，炎癥關(guān)節(jié)滑膜液中的巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)比非治療組高24%，炎癥與免疫抑制因子IL10+細(xì)胞數(shù)高10%，且隨時(shí)間延長(zhǎng)逐步增高；治療144 h時(shí)，在組織學(xué)上，BM-MNCs治療的關(guān)節(jié)滑膜腫脹較輕，呈淺橙色至粉紅色，與健康的關(guān)節(jié)相似，而對(duì)照組中仍然異常。Menarim等[16]認(rèn)為，巨噬細(xì)胞祖細(xì)胞是BM-MNCs中負(fù)責(zé)下調(diào)炎癥反應(yīng)的主要細(xì)胞，IL-10是軟骨細(xì)胞代謝和損傷恢復(fù)的關(guān)鍵細(xì)胞因子，通過(guò)巨噬細(xì)胞相關(guān)作用治療滑膜炎，IL-10減輕軟骨損傷、促進(jìn)軟骨修復(fù)，可使成千上萬(wàn)的骨關(guān)節(jié)炎患者受益。

3 單個(gè)核細(xì)胞治療關(guān)節(jié)軟骨損傷

骨關(guān)節(jié)炎是關(guān)節(jié)軟骨退行性變或損傷引起的一系列臨床表現(xiàn)的總稱(chēng)，以軟骨退變和損傷為基礎(chǔ)，因此，治療關(guān)節(jié)軟骨退行性變或損傷是治療骨關(guān)節(jié)炎的主要目的和手段。軟骨組織無(wú)血管，如果干/祖細(xì)胞不能穿透軟骨下骨為軟骨修復(fù)提供細(xì)胞，軟骨損傷修復(fù)將無(wú)法進(jìn)行。單個(gè)核細(xì)胞為臨床治療骨關(guān)節(jié)炎提供了一種現(xiàn)成的自體細(xì)胞和細(xì)胞因子的來(lái)源。

細(xì)胞向損傷軟骨組織遷移，是修復(fù)軟骨缺損的前提。Hopper等[17]利用膝關(guān)節(jié)炎患者自體軟骨細(xì)胞與自愿者PBMNCs體外共培養(yǎng)的體外模型，劃痕法研究了PBMNCs促進(jìn)軟骨細(xì)胞遷移的效果與機(jī)制，結(jié)果顯示，PBMNCs間接刺激3 d后，軟骨細(xì)胞總遷移率提高9.7倍， PBMNCs直接共培養(yǎng)3 d后，軟骨細(xì)胞總遷移率提高8.2倍；研究還發(fā)現(xiàn)，MMP9和IGF1 是PBMNCs誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞遷移的主要調(diào)節(jié)因子。

促進(jìn)軟骨再生和減少退行性變，是治療骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵。Bekkers等[18]利用成年荷蘭奶山羊膝關(guān)節(jié)股骨內(nèi)側(cè)髁 5 mm圓柱形軟骨缺損模型，研究了BM-MNCs、未擴(kuò)增軟骨細(xì)胞和纖維蛋白膠復(fù)合體，治療局灶性關(guān)節(jié)軟骨損傷，促進(jìn)軟骨再生和抑制軟骨退行性變的效果。研究表明，BMMNCs聯(lián)合未擴(kuò)增軟骨細(xì)胞治療促進(jìn)了缺損處軟骨再生，與微骨折治療相比，減少關(guān)節(jié)軟骨的退變。Zhang等[19]利用貴州小型豬在膝關(guān)節(jié)股骨外側(cè)滑車(chē)直徑6.0 mm的全層軟骨缺損模型，通過(guò)大體檢查、立體顯微鏡觀察、組織學(xué)分析和 O'Driscoll評(píng)分系統(tǒng)軟骨組織學(xué)評(píng)分，評(píng)價(jià)了Ⅱ型膠原水凝膠和BM-MNCs治療軟骨缺損的療效。結(jié)果顯示，以Ⅱ型膠原水凝膠為支架材料的BM-MNCs治療4周時(shí)，細(xì)胞治療組可見(jiàn)軟骨缺損處表面形成光滑的半透明再生組織、再生組織與周?chē)浌侵g無(wú)間隙，但界面容易識(shí)別；治療8周時(shí)，軟骨缺損完全被透明樣再生組織填充，其顏色為象牙白，類(lèi)似正常軟骨，界面很難被識(shí)別；對(duì)照組沒(méi)有軟骨再生。證明了BM-MNCs可以修復(fù)全層軟骨缺損，研究者認(rèn)為，包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在內(nèi)的BM-MNCs可能分泌大量的細(xì)胞因子（或生長(zhǎng)因子），為MSCs的增殖和成軟骨分化提供更完善、持續(xù)的微環(huán)境支持。因此，自體未培養(yǎng)的BM-MNCs移植是一種臨床有效、經(jīng)濟(jì)、方便、高效軟骨修復(fù)的技術(shù)。

4 單個(gè)核細(xì)胞治療骨關(guān)節(jié)炎的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

Song 等[20]利用前交叉韌帶橫斷加內(nèi)側(cè)半月板切除的方法誘導(dǎo)的 小尾寒羊 KOA 模型，BM-MNCs 以4.5×108個(gè)細(xì)胞（5 mL）、BMSCs 以1×107個(gè)細(xì)胞（5 mL）的劑量，一次性關(guān)節(jié)內(nèi)注射。細(xì)胞移植后 8周， 細(xì)胞治療組軟骨部分修復(fù)，干細(xì)胞組較單個(gè)核細(xì)胞組有較高的軟骨再生能力和較低的蛋白多糖丟失，BM-MNCs 治療效果不如 BMSCs，但作者認(rèn)為，BM-MNCs對(duì)骨關(guān)節(jié)炎模型亦具有良好的治療作用，且允許在手術(shù)室中直接處理細(xì)胞，無(wú)需培養(yǎng)和立即自體給藥，降低了成本，減 少了污染風(fēng)險(xiǎn)，也不需要 GMP 設(shè)施，是一種合適的潛在的BMSCs替代物。Lv等[21]比較了 SVF和BMSCs 關(guān)節(jié)內(nèi)注射，治療小尾寒羊KOA模型的效果，發(fā)現(xiàn)在阻止骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展、促進(jìn)軟骨再生方面，BMSCs 效果優(yōu)于 SVF，但 SVF 亦可有效阻斷羊骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展的軟骨破壞，促進(jìn)軟 骨再生。

綜上所述，單個(gè)核細(xì)胞關(guān)節(jié)內(nèi)注射，可以減輕或消除骨關(guān)節(jié)炎的疼痛、改善關(guān)節(jié)的功能、阻止病程的進(jìn)展、促進(jìn)軟骨的再生，且分離操作簡(jiǎn)單、無(wú)需體外擴(kuò)增培養(yǎng)、便捷經(jīng)濟(jì)、安全性好，是值得臨床推廣的治療骨關(guān)節(jié)炎的較為理想的方法，但是，MNCs細(xì)胞成分復(fù)雜，來(lái)源不一，各細(xì)胞成分在治療骨關(guān)節(jié)炎中的作用、機(jī)制、協(xié)同作用，不同來(lái)源MNCs治療骨關(guān)節(jié)炎的效果差異，年齡、身體狀況等對(duì)治療效果的影響等，應(yīng)進(jìn)行深入研究。