高通量測(cè)序技術(shù)在牙周微生物群落研究中的應(yīng)用

楊萬(wàn)娟，徐杰

(昆明醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙周病科，昆明 650106)

近年來(lái)，檢測(cè)唾液、菌斑中微生物的高通量測(cè)序技術(shù)被廣泛應(yīng)用于口腔內(nèi)多種疾病的研究，并取得了一定進(jìn)展[1-3]。牙周炎是一組臨床表現(xiàn)為慢性炎癥和牙齒周圍支持組織破壞的疾病，始動(dòng)因素為牙菌斑生物膜。通常牙周菌群之間及其與宿主之間維持著動(dòng)態(tài)平衡，若牙周微生態(tài)失衡，則牙周炎開(kāi)始發(fā)生發(fā)展，此時(shí)的微生態(tài)環(huán)境和微生物群落組成較牙周健康時(shí)更復(fù)雜。牙周炎是感染性疾病，但其與病因?qū)W有關(guān)的微生物成分和宿主反應(yīng)成分尚未完全明確，因此，對(duì)與牙周炎相關(guān)菌種進(jìn)行分類，并對(duì)牙菌斑生物膜中微生物之間的關(guān)系進(jìn)行闡述，有助于理解微生物之間的聯(lián)系及致病機(jī)制[4]。高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展使群落組成和結(jié)構(gòu)成為牙周微生物研究的新方式之一，可用于牙周炎、種植體周圍炎相關(guān)微生物的研究，該技術(shù)憑借高通量、高效率和高準(zhǔn)確度的優(yōu)勢(shì)，能夠全面細(xì)致地了解牙周微生物群落的組成和結(jié)構(gòu)，有利于更好地理解牙周微生物之間的相互關(guān)系，并能從復(fù)雜的微生物群落中尋找優(yōu)勢(shì)菌群，探索牙周炎與全身疾病之間的關(guān)系，指導(dǎo)臨床診斷及疾病防治，為牙周病的病因?qū)W發(fā)展提供幫助[5-7]?，F(xiàn)對(duì)高通量測(cè)序技術(shù)的原理、特點(diǎn)及其近年來(lái)在牙周微生物群落中的研究及應(yīng)用予以綜述。

1 牙周微生物

口腔中有超過(guò)500種微生物定植在齦下菌斑生物膜中，組成了復(fù)雜的牙周微生態(tài)環(huán)境[8]。其中大部分細(xì)菌為口腔正常菌群，僅牙周致病菌具有顯著的毒力。當(dāng)前公認(rèn)的牙周致病菌主要有11種：牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis，Pg)、福賽坦氏菌(Tannerela forsythia，Tf)、齒垢密螺旋體、伴放線聚集桿菌、直腸彎曲菌、纏結(jié)優(yōu)桿菌、聚核梭桿菌、中間普式菌(Prevotella intermedia，Pi)、變黑普式菌(Prevotella nigrescens，Pn)、微小微單胞菌和中間鏈球菌。研究表明，牙周機(jī)械治療后，牙周致病菌較臨床指標(biāo)的變化更早[9]，因此牙周微生物的檢測(cè)對(duì)疾病的治療與預(yù)后評(píng)估有指導(dǎo)意義。然而，與典型細(xì)菌感染不同，在大多數(shù)牙周炎病例中，隨著疾病的發(fā)展，微生物群落的多樣性也會(huì)增加。復(fù)雜的微生物群落使針對(duì)某個(gè)特定牙周致病菌的治療難以達(dá)到治療目的[10]，牙周病的治療目標(biāo)不是消除口腔微生物群落，而是選擇性地支持有益菌種的生長(zhǎng)，并減緩菌斑生物膜的生長(zhǎng)和新陳代謝，減少牙周微生態(tài)失調(diào)的發(fā)生[11]。因此，選擇合適的方法檢測(cè)牙周微生物，了解群落的組成和多樣性，有助于進(jìn)一步探索牙周微生物之間的相互作用，并為疾病的治療和預(yù)防提供參考。

2 高通量測(cè)序技術(shù)

2.1原理 高通量測(cè)序技術(shù)通過(guò)引物延伸、檢測(cè)新加入核苷酸、以化學(xué)或酶的方法清除反應(yīng)底物或熒光源等一系列重復(fù)步驟進(jìn)行測(cè)序，同時(shí)檢測(cè)每個(gè)片段群進(jìn)行反應(yīng)所產(chǎn)生的信號(hào)，“大規(guī)模并行測(cè)序”可以使數(shù)十萬(wàn)乃至數(shù)億個(gè)測(cè)序反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行并被同步檢測(cè)[12]。因此，該技術(shù)能夠一次檢測(cè)成百上千萬(wàn)的基因序列，并通過(guò)完整的序列信息，全面細(xì)致地對(duì)基因組進(jìn)行測(cè)序[13]。

2.2特點(diǎn) 高通量測(cè)序技術(shù)具有高輸出量與高解析、高效率和高精確度的特點(diǎn)[14]。與細(xì)菌培養(yǎng)、聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)等檢測(cè)技術(shù)相比，高通量測(cè)序技術(shù)可以一次性同時(shí)檢測(cè)多種微生物，高效省時(shí)。傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)法是微生物檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但培養(yǎng)技術(shù)和條件復(fù)雜，存在一定的局限性[15]。目前，不依賴細(xì)菌培養(yǎng)的PCR等技術(shù)被廣泛應(yīng)用于牙周微生物的研究，PCR技術(shù)可以對(duì)一種或幾種已知的牙周致病菌進(jìn)行詳細(xì)的檢測(cè)，探究它們與臨床指標(biāo)之間的相關(guān)性，但僅通過(guò)PCR技術(shù)同時(shí)檢測(cè)的細(xì)菌有限，而牙周微生物群落復(fù)雜多樣，細(xì)菌之間存在協(xié)同或拮抗作用，單純檢測(cè)某種細(xì)菌無(wú)法全面反映各細(xì)菌之間的相互作用，因此對(duì)微生物群落整體進(jìn)行研究顯得尤為重要[16-17]。隨后，研究者開(kāi)始通過(guò)PCR變性梯度凝膠電泳技術(shù)分析牙周微生物群落的組成結(jié)構(gòu)，并初步認(rèn)識(shí)群落結(jié)構(gòu)，但圖譜的條帶容易出現(xiàn)多種細(xì)菌混雜的現(xiàn)象，識(shí)別細(xì)菌的分辨率較低[18-19]。在微生物檢測(cè)方面，上述技術(shù)僅能檢測(cè)保守區(qū)已知的微生物基因序列，當(dāng)微生物的基因發(fā)生重組突變或者需要檢測(cè)未知的微生物時(shí)，這些技術(shù)就無(wú)法發(fā)揮作用。與上述傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)相比，高通量測(cè)序技術(shù)不僅能夠同時(shí)檢測(cè)多種微生物的基因組序列，對(duì)微生物進(jìn)行定性及定量，還能檢測(cè)低豐度甚至痕量菌種，并可發(fā)現(xiàn)未知微生物。但高通量測(cè)序技術(shù)費(fèi)用昂貴，在樣本處理階段，該技術(shù)對(duì)樣本DNA的純度及濃度要求較高[20]；在生物信息分析階段，由于受到測(cè)序平臺(tái)讀長(zhǎng)、物種數(shù)據(jù)庫(kù)和物種分類軟件等的影響，該技術(shù)對(duì)種水平分類學(xué)信息的置信度較低[21]。

3 高通量測(cè)序技術(shù)與牙周微生物群落研究

由于牙周病是多種微生物混合感染性疾病，而高通量測(cè)序技術(shù)具有高通量、高效率和高準(zhǔn)確度的特點(diǎn)，能夠較全面地對(duì)牙周微生物群落的組成和結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，因此，近年來(lái)學(xué)者們將高通量測(cè)序技術(shù)用于牙周微生物的檢測(cè)，并取得了一定的進(jìn)展。高通量測(cè)序技術(shù)在牙周微生物檢測(cè)中的應(yīng)用使牙周微生物的研究從以往單一特定的菌種研究向群落整體研究轉(zhuǎn)變。高通量測(cè)序技術(shù)在牙周微生物群落研究中的應(yīng)用主要包括以下幾方面。

3.1牙周炎相關(guān)菌群的檢測(cè) 高通量測(cè)序技術(shù)能夠明確牙周組織在健康或疾病狀態(tài)下的菌群組成和結(jié)構(gòu)差異，并從微生態(tài)角度更具體的檢測(cè)導(dǎo)致牙周微生態(tài)失調(diào)的菌群，對(duì)于了解牙周炎的發(fā)病機(jī)制并明確牙周疾病的診斷具有重要作用。在門水平上，擬桿菌門(Bacteroidetes)、梭桿菌門(Fusobacteria)、互養(yǎng)菌門(Synergistetes)和螺旋體門(Spirochaetes)等是牙周炎的優(yōu)勢(shì)菌門，變形菌門(Proteobacteria)是牙周健康者的優(yōu)勢(shì)菌門，而厚壁菌門是牙齦炎中的優(yōu)勢(shì)菌門[22-23]。在屬水平上，鏈球菌屬(Streptococcus)在牙周健康者中占主導(dǎo)地位，而牙周炎中的優(yōu)勢(shì)菌屬主要包括普氏菌屬(Prevo-tella)、卟啉單胞菌屬(Porphyromonas)和密螺旋體屬(Treponema)等[5]，它們均是革蘭陰性專性厭氧菌，在齦下菌斑生物膜的定植過(guò)程中發(fā)揮重要作用。上述研究通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)分別從細(xì)菌學(xué)的不同分類級(jí)別對(duì)牙周微生物群落的輪廓進(jìn)行了詳細(xì)的描繪，并從更全面的微生態(tài)角度證實(shí)了牙周健康者與牙周病患者菌群之間的區(qū)別，使復(fù)雜的牙周微生物群落更加形象具體，了解微生物在不同生態(tài)環(huán)境中的相互作用，也為進(jìn)一步確認(rèn)牙周優(yōu)勢(shì)菌提供了更多的可能。

隨著牙周炎的進(jìn)展，疾病可分為輕、中、重度，而探診深度(probing depth，PD)可在一定程度上反映牙周炎的進(jìn)展?fàn)顩r，因此對(duì)不同PD牙周袋內(nèi)微生物的相應(yīng)研究能為牙周炎的治療及預(yù)防提供幫助。研究發(fā)現(xiàn)，淺牙周袋(PD≤3 mm)與深牙周袋(PD≥6 mm)內(nèi)的菌群存在明顯差異，放線菌門(Actinobacteria)在深袋內(nèi)檢出率高，淺袋和深袋內(nèi)的微生物可能還受不同種族、牙位以及吸煙等因素的影響[24-25]。Shi等[20]的研究表明，隨著PD的增加，侵襲性牙周炎或慢性牙周炎的細(xì)菌豐度均發(fā)生改變，某些細(xì)菌還與牙周袋深度呈線性相關(guān)，慢性牙周炎中與PD呈正相關(guān)的有Porphyromonas、產(chǎn)線菌屬和支原體等，侵襲性牙周炎中與PD呈正相關(guān)有棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、克雷伯菌屬等，但在兩種牙周炎中某些細(xì)菌的變化趨勢(shì)不同，有時(shí)甚至相反，如Corynebacterium，表明不同牙周炎進(jìn)展階段的優(yōu)勢(shì)菌群也不同，與以往研究某種細(xì)菌的致病性不同，通過(guò)測(cè)序了解細(xì)菌在疾病發(fā)生發(fā)展中的微生物群落的變化，有助于通過(guò)調(diào)控微生態(tài)平衡控制牙周疾病。

高通量測(cè)序技術(shù)將為深入探究微生物的致病機(jī)制提供方向。除了分析牙周炎微生物群落的組成和結(jié)構(gòu)外，高通量測(cè)序技術(shù)還可以通過(guò)分析微生物群落結(jié)構(gòu)的差異推斷微生物間的親緣關(guān)系，進(jìn)行群落功能差異分析。通過(guò)測(cè)序可以預(yù)測(cè)包括膜轉(zhuǎn)運(yùn)、復(fù)制和修復(fù)、糖代謝、氨基酸代謝及能量代謝等在內(nèi)的許多細(xì)菌代謝功能[26]。Wang等[27]研究亦發(fā)現(xiàn)，在牙周微生物群落中，與調(diào)控細(xì)菌趨化和多糖生物合成有關(guān)的許多功能基因和代謝途徑呈過(guò)表達(dá)。Li等[28]通過(guò)454焦磷酸測(cè)序?qū)?lái)自中國(guó)的10例侵襲性牙周炎患者及其直系親屬的微生物群落進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，家庭成員間微生物群落的組成更加相似，說(shuō)明中國(guó)人侵襲性牙周炎及家屬的微生物群落系統(tǒng)發(fā)育結(jié)構(gòu)存在親緣關(guān)系，提示中國(guó)家庭共用餐具和父母咀嚼喂養(yǎng)嬰兒等飲食習(xí)慣可能在一定程度上造成牙周微生物在家庭成員間的傳播。

與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相同，高通量測(cè)序可以檢測(cè)主要的牙周致病菌[29]。研究發(fā)現(xiàn)，Pi和Pn可能是齦下菌斑中的“關(guān)鍵物質(zhì)”，能反映齦下微生態(tài)系統(tǒng)中微生物和環(huán)境的動(dòng)態(tài)變化，提示可將它們作為預(yù)測(cè)牙周炎的新的生物標(biāo)志物[30]。與傳統(tǒng)檢測(cè)方法不同，除檢測(cè)已知的牙周致病菌外，測(cè)序還能檢測(cè)與牙周炎相關(guān)的可疑致病菌，發(fā)現(xiàn)新菌種[31]。Torres等[32]通過(guò)測(cè)序發(fā)現(xiàn)了一種新型牙周病相關(guān)細(xì)菌，該細(xì)菌屬于擬桿菌屬，暫命名為CBP(Candidatus Bacteroides periocalifornicus)，主要存在于深牙周袋中，與紅色復(fù)合體的關(guān)系密切，促使了牙周炎病因?qū)W研究的進(jìn)一步發(fā)展。

3.2牙周基礎(chǔ)治療前后菌群變化的檢測(cè) 牙周基礎(chǔ)治療是所有牙周病患者的必經(jīng)治療，旨在消除大部分致病及危險(xiǎn)因素，進(jìn)而控制炎癥，穩(wěn)定病情。通過(guò)高通量測(cè)序觀察基礎(chǔ)治療前后牙周菌群的變化有助于進(jìn)行療效評(píng)估。Shi等[33]使用宏基因組鳥(niǎo)槍測(cè)序，描述了牙周炎患者基礎(chǔ)治療前后齦下微生物組的動(dòng)態(tài)變化，揭示了病原微生物之間的協(xié)同作用對(duì)疾病發(fā)生發(fā)展的影響，并提出齦下微生物組可作為疾病診斷和預(yù)后的潛在指標(biāo)。牙周基礎(chǔ)治療后減少的菌群主要是Bacteroidetes、Spirochaetes、Fusobacteria、Pg、Tf和Pi等牙周致病菌，顯著增加的菌群主要是Actinobacteria、Proteobacteria、Streptococcus等有益菌[29,34]，提示牙周基礎(chǔ)治療可以明顯改變牙周微生物群落的構(gòu)成，輔助使用抗生素能夠顯著降低菌群豐度[35]。Laksmana等[36]通過(guò)檢測(cè)基礎(chǔ)治療前后的菌群變化發(fā)現(xiàn)，齦下菌群的特征是由少數(shù)物種主導(dǎo)的高物種豐度的微生物群落，高通量測(cè)序適用于評(píng)估牙周微生物群的復(fù)雜性和變化。牙周炎是一種靜止期和活動(dòng)期交替發(fā)展的疾病，如何確定治療的有效性，并以此作為依據(jù)制訂治療策略是牙周治療成功的關(guān)鍵。相較于其他僅能分析單一種或幾種細(xì)菌的傳統(tǒng)檢測(cè)法，采用高通量測(cè)序技術(shù)能夠更全面地分析牙周微生物群的復(fù)雜性和變化，可為臨床醫(yī)師的治療選擇提供更多參考。

3.3伴全身性疾病的牙周炎相關(guān)菌群的檢測(cè) 牙周炎與心血管疾病、糖尿病及IgA腎病等多種全身性疾病有關(guān)。研究證明，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中存在口腔微生物的定植，且動(dòng)脈粥樣硬化伴牙周病患者血管內(nèi)皮中細(xì)菌類群顯著高于單純動(dòng)脈粥樣硬化患者[37]。Saeb等[7]通過(guò)測(cè)序發(fā)現(xiàn)，糖尿病及糖尿病前期患者的牙周微生物群落的生物和系統(tǒng)發(fā)育多樣性明顯低于血糖正常者，該研究結(jié)果可能有助于更好地理解牙周炎與糖尿病之間的雙向關(guān)系。有學(xué)者提出，齦下微生物群或許可用于預(yù)測(cè)慢性牙周炎患者IgA腎病的發(fā)病率，由于伴有IgA腎病的慢性牙周炎患者的齦下微生物多樣性略高于無(wú)IgA腎病的慢性牙周炎患者，且齦下微生物結(jié)構(gòu)的變化與慢性牙周炎患者的IgA腎病發(fā)病率之間存在相關(guān)性[38]?？梢?jiàn)，牙周炎與全身性疾病相關(guān)，但尚無(wú)關(guān)于系統(tǒng)性疾病發(fā)病機(jī)制中微生物和炎癥作用的確切結(jié)論，測(cè)序通過(guò)描繪具體的菌群輪廓可能有助于更深入地認(rèn)識(shí)全身性疾病與牙周炎的關(guān)系，為患者提供更個(gè)性化的診療。

3.4種植體周圍炎相關(guān)菌群的檢測(cè) 種植體周圍炎也是以菌斑生物膜為始動(dòng)因子的疾病。若不進(jìn)行定期維護(hù)，5年內(nèi)種植體周圍炎的發(fā)生率為43.9%[39]，了解種植體周微生物群落組成和結(jié)構(gòu)，有利于進(jìn)行種植體周圍黏膜炎與種植體周圍炎的預(yù)防與治療。種植體周圍炎的部位與健康部位的微生態(tài)系統(tǒng)不同，Synergistetes與種植體周圍炎高度相關(guān)[40]。Sanz-Martin等[6]研究發(fā)現(xiàn)，種植體周圍炎的菌群具有共生體缺失、致病菌富集、傳統(tǒng)致病菌和新致病菌并存的特點(diǎn)，且種植體周圍炎的核心微生物群是牙周炎相關(guān)菌屬的一個(gè)類群，這些菌群特點(diǎn)只有通過(guò)測(cè)序才能被發(fā)現(xiàn)，若通過(guò)測(cè)序了解其特點(diǎn)及相互作用，并在此基礎(chǔ)上選擇性地促進(jìn)有益菌的生長(zhǎng)，可能將為種植體相關(guān)疾病的治療提供幫助。

4 小 結(jié)

牙周病是多種微生物混合感染性疾病，隨著牙周微生物檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，關(guān)于牙周病的病因?qū)W研究也不斷發(fā)展。高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展使牙周微生物的研究不僅僅局限于檢測(cè)某種特定的牙周致病菌，而是在不同層次牙周微生態(tài)細(xì)菌分類學(xué)的基礎(chǔ)上認(rèn)識(shí)牙周微生物群落的組成和結(jié)構(gòu)，了解微生物在牙周病及種植體周圍相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展中的作用，揭示牙周病與全身性疾病之間的關(guān)系，為疾病的預(yù)防及治療提供參考。高通量測(cè)序技術(shù)能夠進(jìn)行全面的牙周微生物群落研究，而常用PCR等技術(shù)則可以在此基礎(chǔ)上對(duì)已經(jīng)篩選出的微生物群落中的特定菌種展開(kāi)研究，各種微生物檢測(cè)技術(shù)之間相互補(bǔ)充，也為牙周病的病因?qū)W研究提供了更多可能。