豬偽狂犬病毒的分離鑒定及TK獨(dú)立基因的測序分析

偽狂犬病是由皰疹病毒科α亞科中的Ⅰ型皰疹病毒所引起的多種家畜和野生動物以發(fā)熱、奇癢及腦脊髓炎為主要癥狀的高度致死性疾病。豬是本病毒最重要的貯存宿主和傳染源。豬感染偽狂犬病毒后的癥狀因日齡不同而異，妊娠母豬感染后引起流產(chǎn)，產(chǎn)木乃伊胎和死胎；哺乳仔豬感染后出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，麻痹、衰竭死亡，死亡率幾乎高達(dá)100%。成年豬一般為隱性感染，不表現(xiàn)臨床癥狀，但病毒可在豬體內(nèi)保存很長時間[6]。該病在豬群中具有傳播快、死亡率高、流行范圍廣、傳播途徑多、病原體頑固等特點(diǎn)。我國自1947年劉永純[1]首次報道以來，隨著養(yǎng)豬業(yè)集約化、規(guī)?；陌l(fā)展，已有20多個省、市相繼報道過本病。該病屬于典型且極難防疫的自然疫源性疾病之一。近幾年豬偽狂犬病在我國許多省市種豬場呈爆發(fā)流行趨勢[2,3]，已成為危害中國養(yǎng)豬業(yè)最嚴(yán)重的疫病之一，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4,5]。

豬偽狂犬病毒基因組為線狀雙鏈DNA，在核內(nèi)DNA以高分子量的連環(huán)體存在，核苷酸鏈長度約為150kb，基因由獨(dú)特的長區(qū)段（UL）和短區(qū)段（US）及位于US兩側(cè)的末端重復(fù)序列（TR）和內(nèi)部重復(fù)序列（IR）所組成，大約可編碼70-100種蛋白質(zhì)。其中胸腺激酶（TK）基因是偽狂犬病毒的非必需基因同時也是主要的毒力基因之一，它與病毒在機(jī)體中的潛伏感染和神經(jīng)組織中的增殖有關(guān)[7,8]。

本實(shí)驗(yàn)室從某豬場送檢的肺、脾、腎等病料中分離鑒定出1株偽狂犬病毒，對其進(jìn)行TK基因測序，并與國內(nèi)外其他分離株進(jìn)行了序列比較，旨在弄清偽狂犬病毒流行特點(diǎn)、來源及其他毒株的親緣關(guān)系等，為該病的分子流行規(guī)律、遺傳變異、疾病防控及基因工程疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 Ik88u病料 病料采集于2014年6月，病料來源于某臨床病例疑似偽狂犬病病豬的肺、脾、腎等組織。

1.1.2 主要試劑 DL2000 DNA Maker、rTaq with GC Buffer購自寶生物工程有限公司。病毒基因組DNA/RNA快速提取試劑盒購自博邁德生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病料組織的處理 無菌的取病料剪碎后加入PBS(0.1 mol/L，pH 7.2)，用組織研磨棒研碎，制成1:5的懸液，反復(fù)凍融3次，12000r/min 離心15min，取上清，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物的設(shè)計與合成 引物參照周斌等[9]建立的PCR體系所涉及的序列，擴(kuò)增部分gE基因，擴(kuò)增片段長度為850bp。引物序列為：上游引物：5‘CCCTGGACGCGAACGGCACGATG3’，下游引物：5’GGGTGGCACGCGCTCTCGAAGCA3’。 引物根據(jù)GenBank已公布的PRV TK基因序列，通過Primer 5.0生物軟件設(shè)計出一對引物，上游引物：5‘AGGCGTTCG TAGAAGCGGTTGT3’，下游引物：5’GCACGGCAAACTTTATTGGGAT3’。預(yù)期擴(kuò)增片段長度為1400bp。引物由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.3 病毒DNA的提取及PCR鑒定 將上述處理的病料組織液，用博邁德的病毒基因組DNA/RNA快速提取試劑盒提取病毒DNA作為模板，利用上述引物分別擴(kuò)增PRV gE、PRV TK 基因片段。PCR總體積為25μL，反應(yīng)體系如下：2×GC Buffer 12.5μL，2.5mmol/L dNTP 2μL，模板 DNA 2μL，上游、下游引物各0.5μL，rTaq DNA聚合酶 0.5μL，去離子水 7μL。PCR 反應(yīng)程序均為：94℃ 5min；94℃ 1min，60℃ 30s，72℃ 1min30s，30 個循環(huán)；72℃延伸 10min。PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳鑒定，其余產(chǎn)物進(jìn)行膠回收。PRV TK膠回收產(chǎn)物送上海英俊生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測定。

1.2.4 PRV TK基因序列分析 用DNAMAN軟件對測得的此病料的PRV-TK基因核苷酸序列和推導(dǎo)出的氨基酸序列進(jìn)行分析，并與GenBank中收錄的偽狂犬病毒Bartha 株、FS170株、LA株、Min-A株、SA株、SL株的TK基因進(jìn)行同源性分析。

2 結(jié)果

2.1 PCR鑒定 用gE基因設(shè)計的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果在850bp左右有一特異性條帶（圖1），與預(yù)期結(jié)果相符。結(jié)果表明所分離病毒為偽狂犬野毒。命名為YF株。

圖1 M:Trans 2k Maker

2.2 PRV TK基因的擴(kuò)增 PRV TK基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外觀察可見一條大小約為1400bp的特異性條帶，大小與預(yù)期相符（圖2）。

圖2 M:Trans 2k Maker

2.3 PRV TK基因序列分析 經(jīng)測序，擴(kuò)增的此株TK基因片段長為1400bp,包含一個963bp的開放閱讀框（ORF），編碼320個氨基酸。用DANMAN將該ORF序列同GenBank上發(fā)表的其他毒株的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行同源性比較分析（表1、2）。結(jié)果顯示，此株與其他毒株核苷酸的同源性為98.4%-100%，而各毒株氨基酸的同源性為96.6%-100%，并且根據(jù)YF株氨基酸與其他株間的關(guān)系見進(jìn)化樹（表3）。

表1 核苷酸同源性比較

3 小結(jié)與分析

隨著養(yǎng)豬生產(chǎn)向規(guī)模化、集約化方向發(fā)展，豬偽狂犬病在國內(nèi)流行日趨廣泛，臨床癥狀各豬場表現(xiàn)不一，有的豬場輕微、病死率高；有的則出現(xiàn)典型的偽狂犬癥狀，哺乳仔豬的病死率高；母豬出現(xiàn)大規(guī)模流產(chǎn)。但引起母豬繁殖障礙的原因很多，除遺傳因素外主要有病毒、布魯氏桿菌、弓形蟲、衣原體、鉤端螺旋體引起，且其臨床癥狀均表現(xiàn)流產(chǎn)、木乃伊死胎，不易確診，所以實(shí)驗(yàn)室診斷是目前確診病毒的最可靠方法。

表2 氨基酸同源性比較

表3 進(jìn)化樹分析

本試驗(yàn)從某豬場的病料中分離出1株病毒，經(jīng)PCR擴(kuò)增試驗(yàn)證實(shí)分離的病毒為偽狂犬病毒，并命名YF株。在規(guī)?；i場仍暴發(fā)此類疾病，使養(yǎng)豬生產(chǎn)蒙受了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，這表明豬偽狂犬病仍是危害養(yǎng)豬生產(chǎn)的一個重大隱患，特別是在春季和夏季，發(fā)病率和死亡率都比較高，所以，早期預(yù)防是非常關(guān)鍵的。