外周神經(jīng)促進創(chuàng)傷后組織異位礦化的研究進展

覃文聘，高鵬，牛麗娜，焦凱

(軍事口腔醫(yī)學國家重點實驗室 口腔疾病國家臨床醫(yī)學研究中心 陜西省口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)院黏膜病科，西安 710032)

異位礦化是指在肌肉、肌腱和韌帶等軟組織內(nèi)快速形成異位骨的疾病[1]，大多由創(chuàng)傷性因素引起，常發(fā)生在髖、肘及肩等關(guān)節(jié)周圍的囊外組織中，導致關(guān)節(jié)強直或血管和神經(jīng)受壓，嚴重限制關(guān)節(jié)活動并引起運動疼痛，從而影響患者生存質(zhì)量[2]。目前，異位礦化主要采取輻射預防和外科切除治療[3]，然而治療后復發(fā)率較高[4]。此外，上述治療也會導致關(guān)節(jié)運動永久性受限、組織局部缺陷等并發(fā)癥。因此，需進一步研究異位礦化的發(fā)生機制，以達到優(yōu)化預防及治療的目的。以往研究顯示，多種發(fā)病機制參與了異位礦化的發(fā)生，如軟組織損傷導致的反復出血機化、局部微循環(huán)缺氧、遺傳因素及神經(jīng)調(diào)節(jié)異常等[5]。研究表明，骨基質(zhì)損傷后釋放的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)具有誘導異位礦化的能力，損傷區(qū)BMP-2可促進感覺神經(jīng)分泌P物質(zhì)和降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)等感覺神經(jīng)肽，這些感覺神經(jīng)肽的釋放導致活化的血小板、肥大細胞和中性粒細胞聚集到損傷部位，最終啟動軟骨成骨過程；另外，活化的血小板、肥大細胞和中性粒細胞等的功能也與神經(jīng)的重構(gòu)有關(guān)[5]?，F(xiàn)就外周神經(jīng)促進創(chuàng)傷后組織異位礦化的研究進展予以綜述。

1 神經(jīng)炎癥的作用

神經(jīng)炎癥機制在誘發(fā)異位成骨中的關(guān)鍵作用已被證明[2,6]。神經(jīng)炎癥是由感覺神經(jīng)釋放感覺神經(jīng)肽(P物質(zhì)[7]和CGRP[8])介導，并作用于周圍的靶細胞(如肥大細胞)而產(chǎn)生的炎癥級聯(lián)。BMP-2常在創(chuàng)傷后釋放入血，其已被證明能直接誘導感覺神經(jīng)元釋放神經(jīng)炎癥相關(guān)蛋白P物質(zhì)和CGRP等，并能誘導新生血管[9]。Salisbury等[10]利用腺病毒轉(zhuǎn)染的BMP-2過表達細胞建立小鼠異位礦化模型，在病毒轉(zhuǎn)染細胞后24 h開始，每間隔一天從組織中分離出蛋白，通過酶聯(lián)免疫吸附測定對組織內(nèi)P物質(zhì)和CGRP進行定量檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種炎癥介質(zhì)的表達水平在誘導異位礦化后24 h內(nèi)明顯升高，在誘導后72 h和6 d再次升高。另有體外研究顯示，在加入重組BMP-2后，感覺神經(jīng)元培養(yǎng)基中的P物質(zhì)和CGRP水平快速升高[11]。為了進一步證明P物質(zhì)在誘導異位礦化中的作用，Kan等[12]用P物質(zhì)受體——神經(jīng)激肽-1受體拮抗劑RP-67580和對照溶劑磷酸鹽緩沖液分別處理Nse-BMP-4異位礦化模型小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RP-67580處理組的異位礦化誘導率顯著低于對照組，表明P物質(zhì)對于誘導異位礦化具有重要作用。由于感覺神經(jīng)元末梢均有瞬時受體電位香草酸亞型1(transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1)，TRPV1作為一種受到多種微環(huán)境因素刺激后釋放疼痛調(diào)節(jié)劑的疼痛離子通道，在異位礦化中起作用。Salisbury等[10]以TRPV1敲除小鼠及野生小鼠為研究對象，建立BMP-2誘導的異位礦化模型。結(jié)果顯示，與野生小鼠相比，TRPV1敲除小鼠異位骨形成量減少，且由BMP-2介導的P物質(zhì)和CGRP增加也顯著受到抑制，表明BMP-2能通過激活感覺神經(jīng)TRPV1，促進其釋放P物質(zhì)和CGRP，進而誘導神經(jīng)炎癥的發(fā)生，從而促進異位礦化[10]。

在神經(jīng)炎癥過程中釋放的P物質(zhì)和CGRP兩種感覺神經(jīng)肽，已被證明能分別招募肥大細胞定位于周圍神經(jīng)和促進肥大細胞脫顆粒[13]。Salisbury等[10]分別使用肥大細胞脫顆粒抑制劑色甘酸和對照試劑磷酸鹽緩沖液對小鼠進行預處理后，再采用BMP-2誘導異位礦化，10 d后對兩組的新生骨進行量化比較，結(jié)果顯示，色甘酸處理小鼠的異位成骨體積較對照小鼠顯著減小，表明肥大細胞脫顆粒在誘導異位礦化發(fā)生中具有重要作用。肥大細胞脫顆粒后釋放多種降解酶，包括乳糜酶、胰蛋白酶、組織蛋白酶等，促進了包括神經(jīng)在內(nèi)的多種類型的組織重構(gòu)。此外，許多神經(jīng)末梢均有各種肥大細胞釋放的蛋白受體，在肥大細胞脫顆粒后被激活，進一步促進P物質(zhì)和CGRP的釋放，構(gòu)成一個促進神經(jīng)炎癥的正反饋環(huán)路[5]。另外，肥大細胞脫顆粒釋放的血清素(5-羥色胺)與骨重建有密切聯(lián)系[14]。血清素與其受體的結(jié)合會導致去甲腎上腺素的釋放，去甲腎上腺素可激活β腎上腺素能受體信號通路并促進棕色脂肪組織在神經(jīng)周圍的迅速發(fā)生，從而進一步促進骨生成[15]。

基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)是一種能降解細胞外基質(zhì)的明膠酶，其被證明與神經(jīng)炎癥和血神經(jīng)屏障的開放有關(guān)[13]。Rodenberg等[16]在BMP誘導異位礦化的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，誘導后48 h內(nèi)異位礦化部位的神經(jīng)血管周圍MMP-9高表達，7 d后微計算機斷層成像檢測到MMP-9定位的異位礦化形成部位，說明MMP-9在異位礦化形成中十分重要。Suehiro等[17]分別于傷后即刻與傷后1 d測定7例腦創(chuàng)傷患者全身動脈和頸內(nèi)靜脈血中的MMP-9和白細胞介素-6水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)頸內(nèi)靜脈中的MMP-9和白細胞介素-6水平與腦外傷炎癥嚴重程度顯著相關(guān)。Hackel等[18]運用高滲鹽水處理大鼠，使MMP-9的非催化性血栓素結(jié)構(gòu)域與低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白-1結(jié)合，觸發(fā)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2的磷酸化，誘導形成血神經(jīng)屏障的緊密連接蛋白claudin-1下調(diào)，提示MMP-9與血神經(jīng)屏障開放有關(guān)。Davis等[19]建立了腺病毒轉(zhuǎn)染的BMP-2過表達細胞誘導異位礦化的大鼠和小鼠模型并進行對比研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MMP-9無論在大鼠還是小鼠的異位礦化部位48 h內(nèi)均有較高的表達，但在小鼠體內(nèi)，MMP-9被激活，而在大鼠體內(nèi)，MMP-9未被激活。同時，該研究在骨骼遠端直接將腺病毒轉(zhuǎn)染的BMP-2過表達細胞注入肌肉中，小鼠體內(nèi)會出現(xiàn)異位礦化而大鼠體內(nèi)不會出現(xiàn)。上述結(jié)果提示，MMP-9的激活對異位礦化至關(guān)重要。

可見，組織創(chuàng)傷導致局部BMP的大量釋放，其可直接促進感覺神經(jīng)肽釋放，導致肥大細胞脫顆粒和神經(jīng)炎癥介質(zhì)的釋放，從而促進局部神經(jīng)炎癥發(fā)生，同時通過促進MMP-9的表達開放血神經(jīng)屏障。

2 神經(jīng)干細胞的作用

在異位礦化的形成過程中，關(guān)于骨祖細胞的來源有多種說法，包括來源于骨髓中的間充質(zhì)干細胞[20]、肌肉纖維之間的間質(zhì)細胞[21]、經(jīng)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的內(nèi)皮細胞[22]等。Lazard等[23]通過給小鼠肌內(nèi)注射腺病毒轉(zhuǎn)染的BMP-2過表達細胞誘導異位礦化，然后通過免疫組織化學方法追溯骨祖細胞來源，并用熒光激活細胞分類和免疫細胞化學方法對其進行定量和進一步表征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，24 h內(nèi)存在于外周神經(jīng)內(nèi)膜的claudin-5陽性細胞同時表達成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Osterix，又稱SP7，一種成骨標志物)抗體、血小板源性生長因子受體(參與神經(jīng)膠質(zhì)-內(nèi)皮細胞相互作用的神經(jīng)干或祖細胞標志物)、musashi家族蛋白(一種在完全分化的細胞中不表達，但對神經(jīng)干細胞具有高度特異性的RNA結(jié)合蛋白)和酪氨酸激酶受體2(內(nèi)皮標志物)；48 h后這些細胞在神經(jīng)內(nèi)消失，隨后出現(xiàn)在血液和新骨形成處，證明骨祖細胞來源于周圍神經(jīng)內(nèi)膜的祖細胞。Olmsted-Davis等[24]通過建立三苯氧胺調(diào)控的Wnt1-Cre重組酶與td番茄紅(Tomato red，TR)受體基因雜交的譜系追蹤小鼠，即一種由三苯氧胺調(diào)控的TR系追蹤小鼠來追蹤細胞的神經(jīng)內(nèi)膜起源，同時使用抗體PS(phosphoSmad)1、 5和8檢測對BMP-2有反應(yīng)的細胞。在運用腺病毒轉(zhuǎn)染的BMP-2過表達細胞誘導異位礦化模型中觀察到，少量的PS陽性細胞存在神經(jīng)內(nèi)膜內(nèi)；在周圍神經(jīng)的神經(jīng)內(nèi)膜中發(fā)現(xiàn)表達成骨細胞的特異性因子——SP7陽性細胞，在空腺病毒載體轉(zhuǎn)導模型的周圍神經(jīng)中未觀察到SP7陽性細胞；且觀測到SP7、Dlx5(一種成骨細胞特異性因子)和PS在Wnt1+(TR+)細胞中表達。另外，Olmsted-Davis等[24]還對異位礦化患者標本進行了研究，發(fā)現(xiàn)異位礦化部位附近的神經(jīng)內(nèi)膜含有大量的PS陽性細胞，異位礦化患者的神經(jīng)和骨組織中均存在SP7陽性細胞。上述結(jié)果表明，異位礦化的祖細胞來源于神經(jīng)內(nèi)膜。

骨祖細胞在發(fā)生后如何到達新骨形成部位并最終發(fā)揮作用引起了科研工作者的廣泛興趣。骨祖細胞要離開神經(jīng)就必須穿過血神經(jīng)屏障，研究發(fā)現(xiàn)循環(huán)中的祖細胞表面表達緊密連接分子claudin-5，但卻不參與構(gòu)成任何緊密連接結(jié)構(gòu)，推測claudin-5的表達很可能為其穿過血神經(jīng)屏障提供了一種方式[23]。祖細胞進入循環(huán)后會在幾秒鐘之內(nèi)遍布全身，研究證實在機體受到創(chuàng)傷后，血液循環(huán)中會很快出現(xiàn)神經(jīng)來源的骨祖細胞[13,25]。骨祖細胞最終定位在新骨形成部位，從循環(huán)滲出到特定部位的過程要通過一種特殊分化的血管，這些血管被鑒定為H血管，其特征為標志物CD31和內(nèi)皮黏蛋白的高表達[26]。Ramasamy等[27]研究發(fā)現(xiàn)，骨祖細胞選擇性地定位在H型毛細血管附近，但在骨干L型毛細血管(表達較低水平的CD31和內(nèi)皮黏蛋白)周圍不存在，進一步證實了H血管在骨祖細胞到達新骨形成部位的重要作用。

3 外周神經(jīng)對棕色脂肪組織的調(diào)節(jié)作用

在BMP-2誘導的異位礦化模型中，神經(jīng)、血管和肌肉等軟組織也發(fā)生了一系列變化，其中棕色脂肪組織(brown adipose tissue,BAT)的出現(xiàn)是最早變化之一[5]。BAT是一種由冷暴露引起的獨特脂肪組織，其特征為表達解偶聯(lián)蛋白1(uncoupling protein 1，UCP1)和血管內(nèi)皮生長因子。與電子傳遞鏈中的標準ATP酶不同，UCP1能將ATP酶從電子傳遞鏈復合物中解離出來，使用于ATP合成的能量會以熱能的形式釋放。周圍神經(jīng)中的小直徑傳入神經(jīng)對熱刺激做出反應(yīng)，誘導信號轉(zhuǎn)導并最終促進神經(jīng)炎癥發(fā)生[14]。此外，UCP1具有非常高的催化效率，能迅速消耗氧氣，加之局部熱量產(chǎn)生導致微環(huán)境中氧氣的溶解度下降，最終造成細胞缺氧，從而有效促進了形成軟骨凝結(jié)[28]。同時缺氧的BAT會激活缺氧誘導因子-1α通路，上調(diào)BMP、血管內(nèi)皮生長因子和神經(jīng)纖毛蛋白-1等的表達[29-30]，促進成骨與成血管在異位礦化過程中的耦合[31]。

與異位礦化關(guān)系密切的棕色脂肪細胞不同于正常生理狀態(tài)下的棕色脂肪細胞，它們是短暫存在的，且來源于神經(jīng)。Salisbury等[32]對患者的異位礦化病理組織進行檢測也發(fā)現(xiàn)，異位礦化中的棕色脂肪細胞表達UCP1，且表達關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α，但對正常棕色脂肪細胞的特征性標記CD137、TBX1(T-Box 1)、HOXC9(homeobox C9)的檢測為陰性，同時也缺乏關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PRDM16(PR domain-containing protein 16)的表達。這些結(jié)果表明，異位礦化組織內(nèi)的棕色脂肪細胞與機體本身的棕色脂肪細胞起源不同。在用三苯氧胺調(diào)控的TR系追蹤小鼠來追蹤細胞起源的實驗中，Lazard等[23]采用BMP-2誘導異位礦化的小鼠模型進行研究，在誘導異位礦化5 d后，對組織進行免疫染色，證實大部分UCP陽性細胞同時TR陽性，提示棕色脂肪細胞可能來自神經(jīng)內(nèi)膜細胞。Salisbury等[15]采用BMP-2誘導異位礦化的小鼠模型進行研究發(fā)現(xiàn)，在BMP-2處理2 d后，坐骨神經(jīng)內(nèi)存在β3腎上腺素能受體陽性細胞，這些細胞也表達神經(jīng)遷移標志物CD75；在處理4 d后，坐骨神經(jīng)內(nèi)的β3腎上腺素能受體陽性細胞數(shù)目顯著減少，同時在周圍的軟組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)了β3腎上腺素能受體陽性UCP1陽性細胞，這些細胞同時表達神經(jīng)引導因子顫蛋白；在阻斷肥大細胞脫粒誘導的神經(jīng)重構(gòu)后，UCP1特異性RNA和蛋白表達完全消失，說明棕色脂肪細胞不僅起源于神經(jīng)，且受神經(jīng)炎癥調(diào)控。Salisbury等[5]認為，肥大細胞脫顆粒釋放的血清素會刺激損傷部位的交感神經(jīng)細胞，進一步影響B(tài)AT的生成。另有研究發(fā)現(xiàn)，BAT的產(chǎn)生受交感神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)[5]。Lowell和Spiegelman[33]將交感神經(jīng)在冷暴露或藥物刺激下對BAT的影響歸納為急性和慢性，UCP-1活性在幾秒鐘內(nèi)增加，而UCP-1蛋白的增加、線粒體的生物發(fā)生及BAT的增生和肥大發(fā)生在數(shù)小時或數(shù)天之內(nèi)。實驗發(fā)現(xiàn)，在犬和靈長類動物中使用β3腎上腺素能受體激動劑可以增加BAT含量[33]；臨床研究發(fā)現(xiàn)，嗜鉻細胞瘤成年患者體內(nèi)存在更多的棕色脂肪沉積，這些結(jié)果支持交感神經(jīng)在BAT的誘導、發(fā)生過程起重要作用[33]。

4 小 結(jié)

創(chuàng)傷后組織異位礦化的過程與外周神經(jīng)密切相關(guān)，主要包括神經(jīng)炎癥的作用、神經(jīng)干細胞的作用和神經(jīng)對棕色脂肪細胞的調(diào)控作用，從而導致血神經(jīng)屏障開放、骨祖細胞遷移至新骨形成部位和BAT造成周圍低氧環(huán)境并促進新生血管長入。雖然異位礦化被認為是一個異常的病理性礦化過程，但事實上其可能反映周圍神經(jīng)系統(tǒng)維持正常骨結(jié)構(gòu)和功能的重要生理機制。生理狀態(tài)下，周圍神經(jīng)系統(tǒng)將信號轉(zhuǎn)導至中樞神經(jīng)系統(tǒng)以調(diào)節(jié)正常骨骼的日常重構(gòu)；病理狀態(tài)下，BMP的釋放刺激感覺神經(jīng)，啟動了一個超過正常水平的骨和軟組織再生程序，可能導致不正確的部位出現(xiàn)骨質(zhì)沉積，即形成異位礦化。因此，通過靶向調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥、神經(jīng)干細胞和棕色脂肪細胞的作用可能成為臨床阻斷創(chuàng)傷后組織異位礦化的重要策略；此外，對異位礦化相關(guān)形成機制的研究亦可為牙、骨等硬組織缺損的治療提供參考。