以線粒體為靶點治療新生兒缺氧再灌注損傷的研究進展

林澤璇，杜江，王斌

(1.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院兒科中心，廣州 510000； 2.廣州市炎癥與免疫性疾病重點實驗室，廣州 510000)

新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic ence-phalopathy，HIE)主要是指圍生期窒息引起的腦損傷，可導(dǎo)致新生兒腦癱、視聽覺障礙、運動行為損傷，甚至死亡[1-2]。HIE在發(fā)達國家的發(fā)病率為1.5/1 000活產(chǎn)嬰兒[3]，但在發(fā)展中國家的發(fā)病率可達26/1 000活產(chǎn)嬰兒[4]。目前除常規(guī)支持療法外,亞低溫是治療HIE安全有效的方法,但僅限于晚期早產(chǎn)兒或足月新生兒。為減少外源性凋亡的非靶向作用，達到有效的神經(jīng)保護目的，有必要探索線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡機制。HIE腦損傷包括兩個基本病理生理事件，即缺氧和再灌注。再灌注導(dǎo)致氧化應(yīng)激，從而介導(dǎo)腦損傷，這種腦損傷機制包括由小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)、線粒體損傷、細(xì)胞凋亡以及自噬[5]。

在結(jié)構(gòu)上，線粒體外膜含有線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)，參與調(diào)控線粒體膜的通透性[6]；線粒體內(nèi)膜的膜蛋白復(fù)合物構(gòu)成復(fù)合體Ⅰ～Ⅳ，稱電子傳遞鏈，參與氧化磷酸化和質(zhì)子梯度的形成[7-8]；線粒體基質(zhì)是發(fā)生三羧酸循環(huán)的重要場所，參與能量的產(chǎn)生[9]；ATP合酶線性排列于線粒體嵴膜，促進ATP合成和MPTP的形成[10]。此外，線粒體外膜與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜相互作用，形成類突觸結(jié)構(gòu)，稱線粒體相關(guān)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，Ca2+可經(jīng)線粒體相關(guān)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移至線粒體[11]。線粒體是HIE新生兒炎癥級聯(lián)反應(yīng)的起源和主要場所，HIE的發(fā)病率較高且后遺癥嚴(yán)重，目前尚無針對性治療的有效藥物，現(xiàn)對HIE的線粒體相關(guān)機制和研究進展予以綜述。

1 線粒體介導(dǎo)再灌注損傷的信號通路

新生兒缺氧缺血引起的腦損傷本質(zhì)上是再灌注損傷。缺氧會導(dǎo)致機體尤其是大腦因血管收縮而缺血，此階段機體活動減弱、能量生成減少，一旦機體獲得氧氣供應(yīng)，血管舒張，大腦血供恢復(fù)發(fā)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致再灌注損傷。在此階段，機體釋放興奮性氨基酸、N-甲基-D-天冬氨酸型谷氨酸受體門控通道開放、細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載、線粒體功能障礙、線粒體通透性增加，其中線粒體是新生兒缺氧再灌注損傷的主要靶點，在細(xì)胞凋亡中起核心作用[12]。再灌注損傷后線粒體通透性增加，細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，這種現(xiàn)象在未成熟腦中尤為突出[12-13]。關(guān)于新生鼠的研究表明，再灌注損傷后，未成熟腦出現(xiàn)的細(xì)胞凋亡主要由線粒體介導(dǎo)，損傷因子激活細(xì)胞的促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路，導(dǎo)致線粒體功能障礙，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其中MAPK包括3條信號通路，即c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)、p38 MAPK[14]。近期研究發(fā)現(xiàn)，線粒體還可通過p53、聚二磷酸腺苷核糖聚合酶-1[poly(ADP-ribose) polymerase-1，PARP-1]通路激活凋亡[15-16]。

1.1JNK信號通路 在缺氧缺血損傷后的再灌注損傷階段，JNK通路激活，促凋亡蛋白Bid從胞質(zhì)易位進入線粒體，線粒體釋放大量細(xì)胞色素C和第2線粒體衍生的胱天蛋白酶激活劑(second mitochondria-derived activator of caspase，Smac)，Smac進一步激活胱天蛋白酶(caspase)級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]。早期動物研究發(fā)現(xiàn)，生理狀態(tài)下Bax、Bim分別以14-3-3蛋白、dynein蛋白作為細(xì)胞質(zhì)的錨定蛋白，并處于非活性狀態(tài)；氧化應(yīng)激時，JNK通過錨定蛋白的磷酸化，促使Bax、Bim從錨定蛋白解離，并以游離、活化的形式易位進入線粒體，從而觸發(fā)線粒體凋亡信號通路[17]。JNK的激活還可通過c-Jun/激活蛋白-1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，形成激活蛋白-1轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物，增強caspase-9的表達，促進細(xì)胞凋亡[18]。線粒體JNK通路的磷酸化將促進神經(jīng)炎癥和細(xì)胞凋亡，抑制線粒體的JNK磷酸化有助于保持缺氧缺血損傷后線粒體的完整性[19]。

1.2ERK1/2通路 早期研究表明，ERK磷酸化激活可保護新生鼠的大腦[19]。在氧化應(yīng)激早期，ERK1/2磷酸化激活并上調(diào)核因子E2相關(guān)因子2的表達[20]。核因子E2相關(guān)因子2是一種轉(zhuǎn)錄因子，活化的核因子E2相關(guān)因子2進入細(xì)胞核調(diào)控蛋白表達，發(fā)揮抗凋亡作用；在應(yīng)激中晚期，ERK1/2持續(xù)激活，誘導(dǎo)Bax及caspase級聯(lián)反應(yīng)和線粒體功能障礙[20]。線粒體功能障礙主要包括兩個主要事件，即線粒體膜通透性改變和隨后發(fā)生的去極化，線粒體相關(guān)蛋白包括細(xì)胞色素C、凋亡蛋白酶激活因子1及細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子等，從線粒體釋放入胞質(zhì)，誘導(dǎo)凋亡[21]。

1.3p38 MAPK通路 新生兒再灌注損傷時，線粒體釋放大量活性氧類(reactive oxygen species，ROS)，ROS是細(xì)胞凋亡的早期信號，直接參與caspase和MAPK的激活[22]，而ROS在持續(xù)激活p38 MAPK通路的同時，可抑制細(xì)胞生存通路磷脂酰肌醇-3-激酶/p85和蛋白激酶B的磷酸化，使原本存在于胞質(zhì)的Bax易位到線粒體[23]，同時減少抗凋亡因子Bcl-2及Bcl-xL的表達[21]，Bax在線粒體外膜形成單聚體，MPTP開放，細(xì)胞色素C、凋亡誘導(dǎo)因子、內(nèi)切酶G及Smac釋放到胞質(zhì)中，激活caspase級聯(lián)反應(yīng)[23]。

1.4p53通路 應(yīng)激條件下，p53激活且表達增加，下游的p53 Ser15磷酸化，細(xì)胞周期蛋白B1、周期蛋白依賴性激酶1及細(xì)胞分裂周期蛋白25同源蛋白C的表達下降，通過細(xì)胞周期檢驗點激酶1、ATM與Rad3相關(guān)蛋白激酶、磷酸化組蛋白H2AX等DNA損傷檢查點誘導(dǎo)線粒體有絲分裂的G2/M期阻滯，使線粒體DNA碎裂分解；同時p53可上調(diào)促凋亡因子Bax的表達，下調(diào)抗凋亡因子Bcl-2的表達，促進細(xì)胞色素C釋放，激活caspase級聯(lián)反應(yīng)，降低線粒體膜電位，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[24-25]。對新生鼠的研究發(fā)現(xiàn)，缺氧缺血損傷后3 h或6 h，p53基因易位進入線粒體并在線粒體內(nèi)蓄積，參與誘導(dǎo)線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，抑制p53可有效抑制細(xì)胞色素C和Smac/低等電點IAP直接結(jié)合蛋白進入細(xì)胞質(zhì)中，并可在缺氧缺血損傷后24 h內(nèi)幾乎完全阻止caspase-3的激活，減少線粒體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，減少梗死體積，并改善功能和預(yù)后[26]。但近期對新生鼠的研究顯示，p53通過線粒體膜間空間蛋白即含有卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)4易位進入線粒體，缺氧缺血損傷對p53通路相關(guān)基因的表達并無明顯影響，因此p53通路是否參與新生大鼠缺氧缺血腦損傷的發(fā)生仍存在爭議[27]。

1.5PARP-1通路 PARP-1是一種高度保守的核酶，通過與斷裂的DNA單鏈或雙鏈結(jié)合而促進堿基修復(fù)。氧化應(yīng)激時大量DNA斷裂，導(dǎo)致PARP-1過度活化，PARP-1通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子ATF4，下調(diào)絲裂原活化的蛋白激酶磷酸酶-1的蛋白表達量，而絲裂原活化的蛋白激酶磷酸酶-1負(fù)反饋調(diào)節(jié)MAPK(主要是JNK和p38 MAPK)，并使其失活[15]。因此，絲裂原活化的蛋白激酶磷酸酶-1表達的下降可激活更多的JNK和p38 MAPK信號通路，破壞線粒體膜電位，增加ROS及細(xì)胞色素C的釋放，促進細(xì)胞凋亡[16]。

2 線粒體釋放ROS介導(dǎo)再灌注損傷的機制

2.1線粒體復(fù)合體Ⅰ是產(chǎn)生ROS的主要場所 復(fù)合體Ⅰ即NADH脫氫酶復(fù)合體，是線粒體氧化呼吸鏈的主要入口，位于呼吸鏈電子傳遞的起始部位。生理狀態(tài)下，線粒體復(fù)合體Ⅰ為活躍的A型構(gòu)象；當(dāng)發(fā)生缺氧損傷時，線粒體功能受到抑制，復(fù)合體Ⅰ大多轉(zhuǎn)變?yōu)樾菝叩腄型構(gòu)象(為生理狀態(tài)下的8倍)，復(fù)合體Ⅰ失活。再灌注能迅速將D型構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)锳型構(gòu)象，使線粒體中電子傳遞鏈依賴的ROS釋放增加，促進細(xì)胞氧化應(yīng)激[7-8]。此外，缺氧缺血損傷時，線粒體有氧呼吸明顯減少，琥珀酸大量蓄積，其水平在未成熟腦中可升高至原來的30倍[9]。再灌注早期，琥珀酸優(yōu)先氧化，在線粒體膜電位存在的情況下，驅(qū)動線粒體反向電子傳遞，蓄積的琥珀酸的電子可向上游傳遞給復(fù)合體Ⅰ，在復(fù)合體Ⅰ生成超氧陰離子，大量ROS釋放[8-9,22]。

2.2離子穩(wěn)態(tài)失衡促使大量ROS產(chǎn)生 缺氧缺血損傷時，線粒體內(nèi)的離子穩(wěn)態(tài)失衡。生理狀態(tài)下，Zn2+和Ca2+主要儲存于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中[28-29]。鈣超載是線粒體功能障礙的中心事件。氧化應(yīng)激時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放Ca2+，鈣調(diào)激酶Ⅱ磷酸化激活并增強線粒體內(nèi)膜鈣單向轉(zhuǎn)運體的功能，介導(dǎo)線粒體對Ca2+的快速、高容量攝取[29]，缺氧缺血時機體釋放谷氨酸增多，激活鈣離子高滲透性的N-甲基天冬氨酸受體，大量Ca2+進入細(xì)胞[30]，導(dǎo)致Ca2+超載，MPTP形成并開放，線粒體腫脹、能量耗竭[11,29]。同時，細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載使丙酮酸脫氫酶磷酸化失活，丙酮酸無法進入三羧酸循環(huán)，只能經(jīng)乳酸脫氫酶進入糖酵解，生成乳酸，促進細(xì)胞的能量衰竭[31]。

近期研究表明，ROS與Zn2+的水平在缺氧缺血過程中各有兩個階段的升高[28]。缺氧缺血初期，機體緩慢產(chǎn)生ROS，Zn2+經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Zn2+轉(zhuǎn)運體釋放并被線粒體攝取，此時Zn2+的緩沖穩(wěn)態(tài)機制仍存在，細(xì)胞損傷可逆；隨著缺氧時間的延長，線粒體攝取的Zn2+過多，Zn2+超載，抑制電子傳遞鏈、激活MPTP，導(dǎo)致線粒體膜去極化、線粒體膜電位喪失、ROS釋放量急劇增加且持續(xù)升高，導(dǎo)致細(xì)胞不可逆損傷；再灌注時，細(xì)胞內(nèi)蓄積的Zn2+可激活還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶并與其相互作用，導(dǎo)致ROS爆發(fā)式增加，靶向細(xì)胞凋亡信號級聯(lián)通路[28]。

總之，線粒體攝取的Ca2+、Zn2+過多，細(xì)胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)失衡，導(dǎo)致線粒體膜通透性改變，MPTP不可逆開放，線粒體功能障礙，超載的離子從線粒體流出至胞質(zhì)中，使大量ROS生成，激活氧化應(yīng)激，導(dǎo)致再灌注損傷。

2.3線粒體釋放的ROS導(dǎo)致細(xì)胞膜去極化 在新生鼠上模擬HIE的病理生理時發(fā)現(xiàn)，缺氧缺血損傷后線粒體釋放大量ROS，ROS轉(zhuǎn)化為H2O2后導(dǎo)致細(xì)胞膜去極化，細(xì)胞膜通透性增加將導(dǎo)致更多炎癥物質(zhì)釋放，形成再灌注損傷的惡性循環(huán)[32-33]。線粒體攝取大量Ca2+，導(dǎo)致細(xì)胞外Ca2+水平降低，胞內(nèi)ATP分解產(chǎn)生大量腺苷，腺苷隨后通過核苷轉(zhuǎn)運體釋放到細(xì)胞外并激活A(yù)1受體，磷酸化激活JNK和p38 MAPK信號通路，GluA2胞吞增多、表達減少，導(dǎo)致突觸抑制[34]、K+通道激活、細(xì)胞膜超極化、細(xì)胞放電率下降[35]，腦細(xì)胞損傷。此外，細(xì)胞外Ca2+水平降低，Ca2+依賴的胞吐等過程將被阻滯，電壓門控Na+通道開放，胞外K+水平暫時性升高，導(dǎo)致電位爆發(fā)[35]。因Na+通道開放，神經(jīng)元細(xì)胞膜明顯去極化，導(dǎo)致閾值下降、振幅升高的動作電位，細(xì)胞膜興奮性升高[30,35]。生理狀態(tài)下細(xì)胞膜的K+通道被Mg2+等阻塞封鎖，導(dǎo)致靜息狀態(tài)下膜電流很小，在缺氧缺血時細(xì)胞膜去極化，Mg2+的封鎖作用解除后，N-甲基天冬氨酸受體激活并與谷氨酸結(jié)合，Ca2+通道打開，細(xì)胞膜電位爆發(fā)[36-37]。癲癇發(fā)作本質(zhì)上是大腦神經(jīng)元過度放電引起的癥狀，這可能是HIE易導(dǎo)致癲癇后遺癥的機制。

3 以線粒體為靶點治療HIE的藥物研究進展

新生兒大腦易受氧化應(yīng)激影響，這可能是因為缺氧缺血損傷后線粒體呈低代謝狀態(tài)，且磷酸戊糖途徑活性降低。大腦發(fā)育早期，星形膠質(zhì)細(xì)胞中谷氨酸轉(zhuǎn)運體較少，對谷氨酸的攝取能力較低，這可能是新生兒大腦對興奮性毒性高度敏感的一個重要原因[38]。目前臨床上尚無治療HIE的有效藥物，只能通過亞低溫治療改善癥狀，但療效尚存在爭議。一項關(guān)于新生兒輕度腦病的Meta分析發(fā)現(xiàn)，嬰兒采用亞低溫治療的不良反應(yīng)發(fā)生率為19.6%(11/56)，而普通護理不良反應(yīng)發(fā)生率為19.7%(12/61)，風(fēng)險比為1.11[39]。該研究認(rèn)為目前的證據(jù)不足以推薦對患有輕度腦病的嬰兒常規(guī)進行亞低溫治療，不能排除明顯的益處或危害。此外，全身給藥也存在藥物利用率低、難以達到有效治療濃度、毒副作用大等問題，因此有必要探索線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡機制、尋找HIE的針對性治療藥物。

褪黑素、促紅細(xì)胞生成素、干細(xì)胞治療等也可作為HIE的治療方法，但安全性及有效性尚存在爭議。褪黑素具有抗氧化應(yīng)激的作用，為親脂性，可透過血腦屏障。有研究認(rèn)為褪黑素對神經(jīng)元代謝無保護作用，在缺氧缺血腦損傷后的早期階段，所給劑量的褪黑素不能保護神經(jīng)元線粒體[40]。一項關(guān)于HIE的Ⅱ期臨床試驗顯示，促紅細(xì)胞生成素治療組中/重度腦損傷、皮質(zhì)下?lián)p傷以及小腦損傷的發(fā)生率低于安慰劑組，認(rèn)為大劑量促紅細(xì)胞生成素(1 000 U/kg，靜脈注射)聯(lián)合亞低溫治療HIE可降低腦損傷的MRI評分，改善出生后1年的運動功能[41]。也有研究提出，亞低溫及干細(xì)胞聯(lián)合治療可導(dǎo)致新生乳鼠長期運動認(rèn)知障礙增加、腦損傷加重，并伴有內(nèi)皮細(xì)胞活化、周圍免疫細(xì)胞浸潤增強、促炎細(xì)胞因子增加，生長因子表達降低，這可能是因為早期亞低溫治療改變了大腦微環(huán)境，調(diào)節(jié)了間充質(zhì)干細(xì)胞的功能[42]。

缺氧損傷時機體啟動的自噬可能有神經(jīng)保護作用，抑制自噬可促進細(xì)胞色素C、活化的caspase-3和caspase-9表達，線粒體超氧化物增多，線粒體膜電位降低，加重線粒體功能障礙和細(xì)胞凋亡[32]。ROS的產(chǎn)生可激活大腦谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化物質(zhì)并使其上調(diào)，提高神經(jīng)元的存活率[43]。這可能是機體的自我保護機制。

缺氧缺血損傷后使用異氟醚可抑制MPTP開放，降低缺氧缺血損傷導(dǎo)致的長期空間學(xué)習(xí)和記憶功能障礙，發(fā)揮腦保護作用[6]；異氟醚可抑制再灌注初始階段復(fù)合體Ⅰ依賴性線粒體呼吸的恢復(fù)，限制自由基釋放，并減少琥珀酸依賴的H2O2的釋放，減輕氧化應(yīng)激，如同時應(yīng)用機械通氣，可改善腦循環(huán)，對腦再灌注損傷起保護作用[44]。抑制鈣單向轉(zhuǎn)運體或MPTP的形成，可通過阻斷線粒體Ca2+超載，減少梗死體積，減輕腦損傷，不促進糖酵解，進而保護線粒體功能[29,31]。有研究表明，腦卒中時使用環(huán)孢霉素A治療可上調(diào)DJ-1的表達，穩(wěn)定MPTP，并使線粒體釋放的細(xì)胞色素C減少[45]。線粒體復(fù)合體Ⅰ的構(gòu)象變化是線粒體功能障礙的重要過程，抑制復(fù)合體Ⅰ活性或延緩復(fù)合體Ⅰ活性恢復(fù)可減輕腦損傷程度。有研究表明，在再灌注初始階段給予線粒體靶向硝化劑，可延緩復(fù)合體Ⅰ構(gòu)象從D型轉(zhuǎn)變?yōu)锳型，D型構(gòu)象復(fù)合體Ⅰ酶不能驅(qū)動反向電子傳遞，ROS生成明顯減少，氧化應(yīng)激減輕，且不影響琥珀酸依賴的氧化呼吸鏈[7-8]。有研究顯示，低劑量血紅素可上調(diào)神經(jīng)球蛋白的表達，減少細(xì)胞色素C釋放，從而阻斷內(nèi)源性抗凋亡通路[46]。

4 小 結(jié)

線粒體是缺氧再灌注損傷的主要靶點，新生大鼠腦缺氧缺血損傷1 h后，糖酵解和星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體代謝恢復(fù)，而神經(jīng)元線粒體代謝嚴(yán)重受損，這強調(diào)了神經(jīng)元線粒體的脆弱性，其可能成為神經(jīng)保護治療的新靶點[40]。目前HIE靶向治療藥物仍處于動物實驗或臨床試驗階段，如促紅細(xì)胞生成素、褪黑素、干細(xì)胞等，但因作用靶點廣泛、治療機制尚未完全明確，可能具有較大的毒副作用。線粒體在HIE中起著至關(guān)重要的作用，能促進二次能量衰竭、驅(qū)動氧化應(yīng)激，導(dǎo)致腦損傷。如能找到靶向線粒體的抑制劑，在減少氧化應(yīng)激的同時不影響細(xì)胞的能量代謝，將有望改善HIE的預(yù)后。