胚胎嵌合的發(fā)生機(jī)制及結(jié)局

戴旭，賈苗苗，柏海燕

(西安醫(yī)學(xué)院，西北婦女兒童醫(yī)院，西安 710003)

在輔助生殖臨床實(shí)踐中，胚胎嵌合(mosaic embryos)是指植入前胚胎包含兩種或兩種以上染色體核型不同細(xì)胞系的現(xiàn)象。按照細(xì)胞類型嵌合體胚胎分為二倍體-非整倍體細(xì)胞系嵌合和非整倍體-非整倍體細(xì)胞系嵌合，在無整倍體胚胎可移植的情況下，我們僅考慮移植二倍體-非整倍體細(xì)胞系嵌合胚胎。國際胚胎植入前遺傳學(xué)診斷協(xié)會(PGDIS)規(guī)定異常細(xì)胞占比20%～80%為嵌合體胚胎，>80%為非整倍體胚胎，<20%為整倍體胚胎[1]。

一、嵌合體胚胎的起源

嵌合體胚胎是胚胎有絲分裂過程中染色體異常分離所致[2]。卵母細(xì)胞異常、精子異常以及胚胎體外培養(yǎng)過程中的外源性干擾因素均可導(dǎo)致胚胎細(xì)胞染色體異常分離。精卵結(jié)合時(shí)卵母細(xì)胞提供早期胚胎發(fā)育所需的線粒體、mRNA以及適宜的細(xì)胞環(huán)境。精子僅頭部進(jìn)入卵母細(xì)胞，并以其中心體為中心形成精星體，介導(dǎo)雌雄原核融合以及第一次卵裂。與非整倍體的發(fā)生率主要受母方年齡影響不同[3]，嵌合體胚胎的發(fā)生率與父方因素更加相關(guān)。有研究顯示不育男性的精星體通常會延遲形成，其介導(dǎo)的胚胎有絲分裂更易發(fā)生染色體異常分離[4]。Palmerola等[5]也證實(shí)，嵌合體胚胎的發(fā)生與精液參數(shù)相關(guān)，少弱精子癥患者嵌合體胚胎的發(fā)生率較其他精子活力差的病人更高。在有關(guān)嵌合體的研究中，各個(gè)生殖中心報(bào)道的嵌合體胚胎發(fā)生率不同，提示體外受精(IVF)過程中各個(gè)技術(shù)環(huán)節(jié)，如促排方案、卵泡抽吸方式、培養(yǎng)室環(huán)境及培養(yǎng)液等均可能與嵌合體胚胎發(fā)生率相關(guān)[3]。

二、嵌合體胚胎的形成機(jī)制

染色體異常分離導(dǎo)致嵌合體胚胎形成的主要機(jī)制有：染色體不分離、分裂后期延遲、內(nèi)復(fù)制。這幾種機(jī)制本質(zhì)都是細(xì)胞分裂過程中染色體異常分離的主要機(jī)制，并不是嵌合體胚胎形成所特有的機(jī)制。

1.染色體不分離(non-disjunction)：染色體不分離是指姐妹染色單體在有絲分裂中未分離，被紡錘絲牽引至同一子代細(xì)胞，在同一胚胎內(nèi)形成三體-單體-二倍體三種細(xì)胞系嵌合。性染色體在胚胎發(fā)育的早期階段最常發(fā)生不分離[6]，而常染色體發(fā)生不分離后丟失的單體細(xì)胞有致死性，在胚胎發(fā)育過程中會被選擇性清除，最終會形成三體-二倍體細(xì)胞系嵌合胚胎。若不分離發(fā)生在胚胎細(xì)胞分化之前則會形成普遍性嵌合胚胎，其異常分離細(xì)胞分布于全身各個(gè)組織和器官，異常細(xì)胞占比在65%～70%之間[7]。若不分離發(fā)生在胚胎細(xì)胞分化之后特定的細(xì)胞譜系內(nèi)則形成局限性嵌合。局限性嵌合的異常細(xì)胞僅分布于特定的某一個(gè)組織器官中，如限制性胎盤嵌合(confined placental mosaicism，CPM)，其異常細(xì)胞僅分布于胎盤組織，胎兒組織內(nèi)無異常細(xì)胞。染色體不分離的分子機(jī)制還尚不清楚，有研究顯示聚合蛋白對維持正常的有絲分裂有重要作用，它保證了姐妹染色單體之間的凝聚力。Singh等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠模型中敲除聚合蛋白基因可以導(dǎo)致染色體錯(cuò)誤分離概率升高，繼而引起早期胚胎發(fā)育阻滯。

2.后期延遲(anaphase lagging)：后期延遲是指姐妹染色單體未能與紡錘體有效結(jié)合，或姐妹染色單體與紡錘體結(jié)合但沒能正常進(jìn)入子代細(xì)胞最終丟失，在同一胚胎內(nèi)形成單體-二倍體細(xì)胞系嵌合[7]。后期延遲是嵌合體胚胎形成的主要機(jī)制，Ioannou等[9]通過對廢棄的第5天胚胎研究發(fā)現(xiàn)，單體-二倍體細(xì)胞系嵌合的嵌合體胚胎發(fā)生率是三體-二倍體細(xì)胞系嵌合的7倍，這一結(jié)果也得到了Coonen等[10]和Capalbo等[11]人的證實(shí)。此外，后期延遲機(jī)制還是三體-二倍體細(xì)胞系嵌合胚胎自我修正的機(jī)制，三倍體細(xì)胞通過后期延遲機(jī)制清除多余的一條染色體恢復(fù)至正常二倍體細(xì)胞，稱之為“三體營救”[11]。

3.內(nèi)復(fù)制(endoreplication)：內(nèi)復(fù)制是指細(xì)胞周期功能障礙，有絲分裂開始后迅速結(jié)束，染色體復(fù)制完成但胞質(zhì)分裂未完成，或是一次有絲分裂剛剛結(jié)束，子代細(xì)胞的一條或多條染色體又再次復(fù)制但不分裂。內(nèi)復(fù)制會導(dǎo)致多倍體-二倍體細(xì)胞系嵌合的胚胎出現(xiàn)，這類胚胎在通過“三體營救”機(jī)制自我糾正后還會出現(xiàn)染色體數(shù)目正常但表型異常的單親二倍體(uniparental disomy，UPD)胚胎。UPD即同一胚胎內(nèi)兩條同源染色體均來自于同一親本。UPD最常見于15、7、11和16號染色體[12]，人群發(fā)生率低，但會導(dǎo)致嚴(yán)重的發(fā)育遲緩和智力障礙，給家庭和社會帶來沉重負(fù)擔(dān)。

4.斷裂-融合-橋循環(huán)(breakage-fusion-bridge)：這種異常分離會導(dǎo)致復(fù)雜的染色體重排而出現(xiàn)嵌合[13]，即染色體片段融合形成雙著絲粒染色體。有絲分裂過程中每個(gè)著絲粒被拉向相反的紡錘體兩極形成橋狀物，然后染色體在新的位置斷裂，斷裂染色體片段復(fù)制后再融合開始新的循環(huán)[7]。

三、嵌合體胚胎的發(fā)生率

嵌合體胚胎的檢出率依賴于不同的檢測方法和檢測平臺，既往文獻(xiàn)報(bào)道的嵌合體胚胎的檢出率差異較大，從30%到90%不等[14]。歐洲人類生殖與胚胎學(xué)會指南(ESHRE)提到嵌合體胚胎的發(fā)生率為40%～60%[15]，這與各個(gè)中心早期使用熒光原位雜交技術(shù)(FISH)進(jìn)行胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(PGT)檢測有關(guān)。FISH可以對單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行遺傳學(xué)檢測，是最早應(yīng)用于PGT的檢測方法，其依賴于特定的檢測探針，無法對全部染色體進(jìn)行篩查，且操作方法復(fù)雜、錯(cuò)誤率高，不同生殖中心的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境(溫度、PH值、濕度等)也會影響其檢測結(jié)果，現(xiàn)在除了滿足平衡異位等特殊的檢測需求，已經(jīng)很少在PGT中使用。隨著全染色體篩查(comprehensive chromosome screening，CCS)技術(shù)的發(fā)展，單核苷酸多態(tài)性分析微陣列(single nucleotide polymorphism array，SNP arrays)、微陣列比較基因組雜交(array comparative genomic hybridization，aCGH)以及二代測序技術(shù)(next generation sequencing，NGS)等檢測技術(shù)可以同時(shí)對24條染色體進(jìn)行檢測，其中NGS相較于其它檢測方法具有高敏感度和準(zhǔn)確性的優(yōu)勢[16]。其與aCGH檢測技術(shù)相比較，aCGH將囊胚期活檢的5～10個(gè)細(xì)胞作為一個(gè)整體分析，對整倍體細(xì)胞和非整倍體細(xì)胞混合檢測；而NGS技術(shù)可對單個(gè)細(xì)胞的24條染色體進(jìn)行逐一檢測，更有利于嵌合體胚胎的檢出。

有文獻(xiàn)報(bào)道，嵌合體胚胎的發(fā)生率在卵裂期最高，為15%～75%[17]；囊胚期有所下降，在20%～33%之間[3]。由于囊胚期嵌合體發(fā)生率較低，且囊胚期活檢對胚胎發(fā)育潛能的損傷較小，目前各生殖中心傾向于選擇第5天或第6天的囊胚進(jìn)行滋養(yǎng)外胚層活檢。囊胚期活檢相較于卵裂期活檢的優(yōu)勢在于，囊胚期時(shí)對滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞進(jìn)行活檢不損傷內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，對胚胎的發(fā)育潛能損傷小，且大量的文獻(xiàn)指出活檢細(xì)胞控制在5～10個(gè)之間對胚胎的種植率幾乎沒有影響。囊胚期嵌合體檢出率下降與胚胎的自我糾正有關(guān)，在胚胎組基因激活后非整倍體細(xì)胞占比越大的胚胎死亡越快，存活的嵌合體胚胎通過凋亡和丟失等方式清除異常細(xì)胞。對鼠胚的研究發(fā)現(xiàn)，在囊胚成熟的過程中，位于內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的非整倍體細(xì)胞在發(fā)育過程中逐漸凋亡，而位于滋養(yǎng)層細(xì)胞的非整倍體細(xì)胞表現(xiàn)為生長發(fā)育受阻[18]。因此選擇囊胚期活檢不僅可以減少對胚胎的損傷還可以增加對胚胎的利用率。

不同染色體異常在嵌合體胚胎中的發(fā)生率不同，21和22號染色體最短且是端著絲粒染色體最易發(fā)生染色體異常分離，嵌合體胚胎的檢出率分別是4.01%和3.81%。1、2和6號染色體較減數(shù)分裂在有絲分裂過程中更易發(fā)生錯(cuò)誤，嵌合體胚胎的發(fā)生率(分別為3.23%、3.62%和3.04%)高于非整倍率發(fā)生率(分別為1.29%、1.55%和1.62%)。1、2、5、9號和X等染色體的著絲粒在有絲分裂過程中不穩(wěn)定，易出現(xiàn)結(jié)構(gòu)畸變，產(chǎn)生部分非整倍體-二倍體細(xì)胞系嵌合胚胎[16]，特殊的部分非整倍體嵌合胚胎在卵裂期的發(fā)生率為24.3%，囊胚期略低為15.6%[19]。

四、嵌合體胚胎研究中的難點(diǎn)

嵌合體胚胎研究中面臨的最大難點(diǎn)是PGT對嵌合體胚胎診斷的準(zhǔn)確性。PGT檢測準(zhǔn)確性的影響因素包括活檢細(xì)胞的代表性和遺傳檢測技術(shù)的靈敏度和可靠性。滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞活檢的準(zhǔn)確性受諸多因素影響，如染色體嵌合的類型、異常細(xì)胞的占比、活檢過程的操作方式、活檢細(xì)胞數(shù)量及活檢部位等。目前的研究證實(shí)嵌合體胚胎中的異常細(xì)胞是隨機(jī)均勻分布于滋養(yǎng)外胚層和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)內(nèi)的，Chuang等[20]發(fā)現(xiàn)無論是活檢靠近還是遠(yuǎn)離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞，其嵌合體的檢出率與內(nèi)細(xì)胞團(tuán)本身基本一致。為了不損傷胚胎的植入潛能，滋養(yǎng)外胚層的活檢細(xì)胞數(shù)局限在5～10個(gè)之間，但Gleicher等[21]通過數(shù)學(xué)模型計(jì)算，提出假設(shè)嵌合細(xì)胞在滋養(yǎng)外胚層中分布均勻，至少需要活檢27個(gè)滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞才能代表整個(gè)囊胚染色體核型。Maxwell等[22]取不同部位的滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞進(jìn)行多次的重復(fù)檢測，發(fā)現(xiàn)兩次結(jié)果的一致率為48.3%。但也有學(xué)者證實(shí)同時(shí)利用FISH和aCGH技術(shù)對內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和3個(gè)不同位置的滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞進(jìn)行活檢，其一致率可達(dá)到97%[23]。而且我們通過滋養(yǎng)層細(xì)胞的活檢結(jié)果，來選擇整倍體胚胎進(jìn)行植入，有效地提高了妊娠率，降低了流產(chǎn)率。囊胚期滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞活檢基本可以代表內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的遺傳學(xué)狀態(tài)，但這一結(jié)論還需要更大數(shù)據(jù)量的臨床對照實(shí)驗(yàn)來證實(shí)。

此外，NGS技術(shù)對嵌合體胚胎雖具有較高的靈敏度和檢出率，但因NGS讀取數(shù)據(jù)的長度短于傳統(tǒng)的測序技術(shù)，而且在序列拼接過程中錯(cuò)誤率為0.1%～15%，對于大量數(shù)據(jù)的分析也面臨著嚴(yán)重的挑戰(zhàn)[24]。

五、嵌合體胚胎的臨床結(jié)局

嵌合體胚胎是介于整倍體和非整倍體之間的第三種胚胎類型，在無整倍體胚胎可以移植的情況下，可以考慮移植嵌合體胚胎。且隨著PGT檢測技術(shù)的發(fā)展，囊胚期嵌合體胚胎的檢出率和檢出類型都顯著增加。NGS-PGT的嵌合體檢出率可達(dá)到30%[25]。在PGT周期中，優(yōu)先為患者移植整倍體胚胎，但檢測結(jié)果只有嵌合體胚胎時(shí)，是否可以移植仍不明確，有的中心通過設(shè)置臨界點(diǎn)來規(guī)定胚胎是否可以移植，一般認(rèn)為異常細(xì)胞比例<40%的胚胎可以移植[26]，異常細(xì)胞>50%的嵌合體胚胎臨床妊娠率、植入率和活產(chǎn)率均顯著低于整倍體囊胚(分別為15.2% vs. 46.4%，24.4% vs. 54.6%和15.2% vs. 46.6%)[27]，不建議移植。嵌合體胚胎的發(fā)育潛能同時(shí)還受嵌合類型影響，例如：兩條以及兩條以上染色體嵌合的復(fù)雜嵌合體胚胎只有10%的植入率[26]，而染色體部分非整倍體嵌合的胚胎其發(fā)育潛能幾乎不受影響。Fragouli等[28]報(bào)道，經(jīng)NGS診斷為嵌合體的44枚胚胎中，染色體部分非整倍體嵌合占比為32%，它的妊娠結(jié)果與整倍體胚胎相似，活產(chǎn)率為57.1%，自然流產(chǎn)率無明顯差異。

與非整倍體胚胎不同，嵌合體胚胎也可以成功種植并獲得正?；町a(chǎn)?？赡軝C(jī)制有：(1)從嵌合體胚胎中分離活檢細(xì)胞時(shí)存在取樣誤差，滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢結(jié)果并不完全代表內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中的遺傳狀態(tài)，PGT出現(xiàn)了假陽性結(jié)果。(2)胚胎發(fā)育過程中可能存在自我糾正機(jī)制，包括：優(yōu)勢細(xì)胞選擇性分布、整倍體細(xì)胞代償以及異常細(xì)胞凋亡和丟失等。截止2018年全球有近100例嵌合體胚胎成功種植[29]，F(xiàn)ragouli等[28]移植44個(gè)嵌合體胚胎后有12個(gè)最終正?；町a(chǎn)。但與滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞活檢正常的囊胚種植率(55.8%)相比，嵌合體胚胎的種植率(30.1%)顯著降低。Besser等[30]發(fā)現(xiàn)，移植嵌合體胚胎和選擇廢棄嵌合體胚胎重新移植整倍體胚胎的兩組患者間的持續(xù)妊娠率也有顯著差異(27.6% vs. 51.2%)。

目前還未有移植嵌合體胚胎后出生的兒童長期大量的隨訪結(jié)果。但有研究發(fā)現(xiàn)，除了17號染色體外，幾乎所有出現(xiàn)嵌合的染色體都有成功妊娠的報(bào)道[26]。新生兒的臨床表現(xiàn)以及嚴(yán)重程度與其染色體類型、異常細(xì)胞比例以及分布相關(guān)。嚴(yán)重的新生兒嵌合可導(dǎo)致先天畸形、自閉癥和精神發(fā)育遲緩等。例如Turner綜合征中嵌合體占比37.8%，嵌合型為45，X/46，XX的患者易發(fā)生甲狀腺功能不全，少部分嵌合型為45，X/47，XXX的Turner綜合患者還表現(xiàn)為精神異常[31]。

六、嵌合體胚胎的遺傳咨詢

移植嵌合體胚胎雖然存在種植率低、流產(chǎn)率高且有出生缺陷胎兒的風(fēng)險(xiǎn)，但經(jīng)過遺傳咨詢后并非所有患者都會選擇丟棄嵌合體胚胎。Besser等[30]對98名只有嵌合體胚胎的患者進(jìn)行遺傳咨詢后，仍有32.7%的患者選擇移植嵌合體胚胎。因單倍體胚胎不能存活(除45，X外)，而某些三倍體胚胎可導(dǎo)致胎兒身體或認(rèn)知障礙，所以對于最終選擇移植嵌合體胚胎的患者，PGDIS在關(guān)于嵌合體胚胎遺傳咨詢指南中建議：(1)相較于二倍體-三倍體細(xì)胞系嵌合，優(yōu)先移植二倍體-單倍體細(xì)胞系嵌合。(2)當(dāng)選擇移植二倍體-三倍體細(xì)胞系嵌合胚胎時(shí)，應(yīng)根據(jù)嵌合的程度以及受累染色體選擇最優(yōu)胚胎，優(yōu)先考慮轉(zhuǎn)移包括：1，3，4，5，6，8，9，10，11，12，17，19，20，22，X和Y染色體的三體嵌合；與單親二倍體(14，15)相關(guān)嵌合三體胚胎的優(yōu)先級較低；與宮內(nèi)生長遲緩(2，7，16號染色體)相關(guān)嵌合三體胚胎的優(yōu)先級較低；能夠存活(13，18，21號染色體)的嵌合三體胚胎優(yōu)先級最低[32]。同時(shí)充分告知患者嵌合體胚胎結(jié)局的不確定性和流產(chǎn)、胎兒異常、必要時(shí)終止妊娠等各種可能的風(fēng)險(xiǎn)，并需在妊娠14周時(shí)進(jìn)行產(chǎn)前診斷通過羊膜腔穿刺術(shù)(amniocentesis)確診胎兒染色體核型。

七、結(jié)語

胚胎嵌合是在胚胎發(fā)育過程中染色體異常分離所導(dǎo)致的特殊現(xiàn)象，有關(guān)其形成機(jī)制以及不同的胚胎嵌合類型對胚胎發(fā)育的具體影響尚不清楚，隨著PGT技術(shù)的發(fā)展，NGS對于嵌合體的診斷更加靈敏，檢出率更高。嵌合體胚胎具有一定的生存潛能，但其種植率、妊娠率均低于整倍體胚胎。對患者進(jìn)行PGT遺傳咨詢后，少數(shù)患者在無整倍體胚胎情況下，最終選擇移植嵌合體胚胎，成功妊娠后需接受羊水穿刺檢查，并對出生嬰兒需進(jìn)行長期隨訪，以積累更多的嵌合體胚胎數(shù)據(jù)。