雞傳染性支氣管炎病毒檢測方法的初步探討

錢 坤，李春青

（天津市農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測中心 300402）

雞傳染性支氣管炎是由雞傳染性支氣管炎病毒所引發(fā)的一類高度接觸傳染性、急性、病毒性呼吸道病變。 該疾病于全球范圍內(nèi)廣泛分布，是一類嚴(yán)重威脅全球養(yǎng)殖業(yè)的重大傳染疾病。

病禽的主要特征為氣管啰音、打噴嚏、咳嗽等等[1]。 在發(fā)病之后，會(huì)侵害病禽的泌尿生殖系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等等。 該疾病的死亡率較高，會(huì)引起小雞死亡。 成年產(chǎn)蛋雞群感染之后，會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)蛋量降低，體質(zhì)下降，另外還會(huì)導(dǎo)致受到感染的幼雞群增重以及飼料報(bào)酬顯著下降。 特此，本文全面分析雞傳染性支氣管炎病毒RT-PCR 檢測方式的有效性，現(xiàn)將具體結(jié)果報(bào)告如下。

1 病原

IBV 歸屬于冠狀病毒科， 致病性較為復(fù)雜， 有著多種血清型。 在中國，雞傳染性氣管炎具體的流行株為Gray 株、Hotle 株、Mass 株以及T 株。另外也存在大量的變異菌株。臨床診斷可將其分為腸型、腎型、腺胃型以及呼吸型等幾類。 值得說明的是，單純憑借臨床解剖通常無法獲得詳細(xì)病因， 所以說有必要取得實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果。 和以往相比，當(dāng)前我國分子生物學(xué)技術(shù)有所進(jìn)展。在這種情況之下， 國內(nèi)諸多學(xué)者依然將RT-PCR 技術(shù)應(yīng)用于IBV 病毒檢測之中。

IBV 屬于不分節(jié)段單股正鏈RNA 病毒。 其中因mRNA4 編碼病毒膜蛋白為一類跨膜蛋白。 其屬于IBV 粒子內(nèi)含量最高的糖蛋白類別。于IBV 裝配成熟整體過程中，起到了不可代替的作用。

2 IBV 病毒RT-PCR 檢測具體方法

2.1 IBV 病毒RNA 提取步驟

第一，IBV 病毒RNA 提??；第二，IBV 病毒DNA 提取。

2.2 RT-PCR 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)相關(guān)步驟

第一，RT 利用20μL 體系予以完成；第二，M 基因擴(kuò)增利用50μl 體系予以完成。

在此之后實(shí)施特異性鑒定以及敏感性鑒定。

特異性鑒定利用所創(chuàng)建的PCR 方法有效擴(kuò)增相關(guān)病毒測定該類方法的特異性。 回收IBV RT-PCR 電泳條帶， 并和pMD18-T 載體相連，處理轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α。 鋪氨芐抗性LB 瓊脂平板，在37℃環(huán)境之下倒置培養(yǎng)處理，經(jīng)過鑒定之后擇取陽性菌落，實(shí)施擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行測序。

敏感性測定具體方式為：依照RT 的制備方法，制備出IBVM-cDNA。 在此之后，實(shí)施十倍比例稀釋。 取用2μL，將其視為模板。 在其余條件穩(wěn)定情況之下，開展PCR 檢測擴(kuò)增。 將發(fā)生陽性反應(yīng)條帶模板用量最高稀釋比例計(jì)算出最低IBV-M-cDNA 具體量[2]。

3 雞傳染性支氣管炎病毒RT-PCR 檢測方法取得的結(jié)果

雞傳染性支氣管屬于一種重大傳染病。 當(dāng)前獸醫(yī)臨床上并無典型的病變特點(diǎn)，所以說診斷較為困難。 現(xiàn)如今，常規(guī)化測定IBV 病毒實(shí)驗(yàn)室方法包含血清學(xué)、 病原學(xué)以及分子生物學(xué)方法。以上方式存在一定弊端， 有的方法進(jìn)行時(shí)間達(dá)到幾天以至于數(shù)周，比如說動(dòng)物接種；有的需要較高細(xì)菌培養(yǎng)條件，比如血清中和試驗(yàn)[3]；而有的方法則存在非特異性反應(yīng)以及敏感性低等等缺陷。

利用PCR 為核心的分子生物學(xué)檢測方法，于IBV 早期診斷中能夠取得滿意效果。 和常規(guī)性血清學(xué)檢測技術(shù)相比，這種方法的優(yōu)勢更多。 能夠直接把病毒基因視為研究目標(biāo)，繼而更為精準(zhǔn)可靠的鑒定病毒種類。 同時(shí)也有助于判斷病毒流行病學(xué)情況。

有實(shí)驗(yàn)依照已經(jīng)發(fā)表的IBV-M 基因序列內(nèi)設(shè)計(jì)了一對具有特異性的引物。 其有著敏感性好、特異性高的特點(diǎn)。 創(chuàng)建出快速簡便的RT-PCR 檢測方式。 利用這種RT-PCR，能夠從IBV 疫苗內(nèi)擴(kuò)增出目片段。 在相同的條件之下， 其余病毒諸如DHV、DRV、NDV 等等，均沒有出現(xiàn)擴(kuò)增出目的片段。 并且所測量的M基因全序列和發(fā)表的Mass41 中的M 基因相一致。這也在一定程度上證實(shí)了這種PCR 擴(kuò)增技術(shù)用于鑒定IBV 病毒有著良好的可靠性和特異性。 值得進(jìn)一步推廣。