自噬相關(guān)基因LC3、Beclin1及mTOR與乳腺癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后的相關(guān)性

楊燕 張毓

(錦州醫(yī)科大學(xué)，遼寧 錦州 121000)

乳腺癌的發(fā)病率和死亡率逐年增加〔1〕。雖然目前乳腺癌的治療有很多選擇，如外科手術(shù)、激素治療、放療、化療、靶向治療〔2〕，但也存在諸多局限，如狹窄的治療范圍，增加的感染風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)正常組織的非選擇性毒性作用及嚴(yán)重的副作用可能在治療完成后持續(xù)數(shù)月或數(shù)年等〔3〕。乳腺癌的特征是異常細(xì)胞的積累，可能歸因于細(xì)胞增殖失衡、細(xì)胞凋亡及自噬調(diào)節(jié)紊亂〔1〕。自噬是一種進(jìn)化上保守并依賴(lài)溶酶體降解缺陷細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器的過(guò)程，被認(rèn)為是一種重要的程序性細(xì)胞死亡，由至少15個(gè)基因?qū)ζ溥M(jìn)行高度復(fù)雜的表達(dá)調(diào)控，協(xié)調(diào)完成誘導(dǎo)、成核、延伸和自噬溶酶體的動(dòng)態(tài)過(guò)程。微管相關(guān)蛋白輕鏈(LC)3、Beclin1(一種哺乳動(dòng)物的酵母Atg6基因同源物)及哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)在該過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，三者處于不同的自噬階段,mTOR作用于自噬誘導(dǎo)期，通過(guò)去磷酸化后激活細(xì)胞內(nèi)泛素樣激酶復(fù)合物誘導(dǎo)自噬的起始；Beclin1涉及自噬小體形成的早期階段(成核階段)，它與Ⅲ型磷酸肌醇3激酶(PI3KC3)形成復(fù)合體，調(diào)節(jié)其他自噬相關(guān)基因表達(dá)蛋白在自噬前體中的結(jié)構(gòu)定位，從而促進(jìn)自噬體形成，被認(rèn)為是自噬起始的重要組成部分，LC3以LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種形式存在并參與自噬的后期，LC3-Ⅰ在正常情況下定位于細(xì)胞質(zhì)，當(dāng)自噬被誘導(dǎo)，LC3的胞質(zhì)形式LC3-Ⅰ通過(guò)與脂質(zhì)分子磷脂酰乙醇胺(PE)結(jié)合轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)C3-Ⅱ，靶向定位于自噬體膜介導(dǎo)自噬溶酶體的形成〔1,4～6〕。自噬具有雙面性，在正常細(xì)胞中，自噬可作為腫瘤抑制機(jī)制，消除有毒物質(zhì)、受損的細(xì)胞器、錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)、減少氧化應(yīng)激和保護(hù)細(xì)胞免受遺傳損傷；在腫瘤細(xì)胞中，自噬可能在饑餓、缺氧和治療性應(yīng)激等條件下成為一種生存途徑〔6,7〕。在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中，自噬被認(rèn)為起著矛盾的作用，它是抑癌還是促癌取決于應(yīng)激刺激的性質(zhì)、遺傳背景、腫瘤發(fā)生階段等〔1〕，一些研究表明自噬減少會(huì)導(dǎo)致乳腺癌進(jìn)展〔8～10〕，而其他研究表明自噬活性增加與乳腺癌預(yù)后較差相關(guān)〔11,12〕。本研究擬探討乳腺癌組織中自噬相關(guān)基因LC3、Beclin1及mTOR的表達(dá)情況及其與乳腺癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料 2010年1月至2013年1月在錦州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院行手術(shù)治療的乳腺癌組織為乳腺癌組，同時(shí)取癌旁組織(距癌組織邊緣>5 cm)為對(duì)照組。入組標(biāo)準(zhǔn)：①初診患者，有手術(shù)指征，無(wú)手術(shù)禁忌；②術(shù)前未行放療、化療、生物免疫等抗腫瘤治療；③術(shù)后病理診斷確診為乳腺癌；④術(shù)后按乳腺癌診療規(guī)范根據(jù)病情完成相應(yīng)治療；⑤臨床及病理資料完整，依從性好，隨訪內(nèi)容完整可靠。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤；②確診后需首選其他抗腫瘤治療，而非手術(shù)治療；③合并嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病、認(rèn)知障礙或精神類(lèi)疾病。共有92例符合標(biāo)準(zhǔn)的乳腺癌患者入組，年齡23～65〔平均(41.2±2.5)〕歲。按美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)乳腺癌分期第6版標(biāo)準(zhǔn)〔13〕：ⅠA期11例，ⅠB期26例，ⅡA期34例，ⅡB期21例；細(xì)胞分化程度：高分化29例，中分化33例，低分化30例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者31例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者61例。患者術(shù)后隨訪時(shí)間為11～60個(gè)月，平均47.2個(gè)月，隨訪方式為入院、門(mén)診或電話，隨訪期間定期復(fù)查血常規(guī)、肝腎功、心電圖、腫瘤標(biāo)記物、CT、骨掃描，隨訪截止于2018年1月，總生存期(OS)計(jì)算從術(shù)后病理確診至患者死亡或隨訪結(jié)束。本研究經(jīng)錦州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，入組患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2試劑與方法 兔抗人LC3A/B單克隆抗體 (4599T、3868T) 購(gòu)自Cell Signaling公司，羊抗人Beclin1(3663-100)購(gòu)自艾美捷科技，兔抗人mTOR(T2949)購(gòu)自Sigma公司，HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(BHR101)購(gòu)自博爾西公司。

1.3免疫組化Envision法檢測(cè)LC3、Beclin1及mTOR表達(dá) 手術(shù)組織標(biāo)本使用10%甲醛固定、石蠟包埋、4 μm切片，60℃溫箱烘烤30 min，二甲苯脫蠟3次，每次5 min，遞減梯度乙醇復(fù)水，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后將切片放入檸檬酸鹽緩沖液中高溫修復(fù)暴露抗原，待自然冷卻再次使用PBS沖洗，將切片置于3%H2O2中恒溫孵育10 min封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，使用蒸餾水及PBS沖洗，蛋清封閉后在室溫中放置10 min，分別滴加羊抗人一抗(LC3工作濃度1∶25；Beclin1工作濃度1∶50；mTOR工作濃度1∶25)后將切片置于4℃冰箱過(guò)夜，次日使用蒸餾水及PBS沖洗后在切片上滴加辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗羊二抗(工作濃度1∶100)，37℃恒溫箱孵育30 min，蒸餾水及PBS液沖洗切片后使用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒染色2～5 min，顯色完成后蒸餾水沖洗切片中止顯色并使用蘇木素復(fù)染3～5 min，蒸餾水沖洗后1%鹽酸酒精分化3～5 s，充分沖洗后遞增梯度乙醇反向脫水、烤片、中性樹(shù)膠封片。

1.4結(jié)果判定 免疫組化染色結(jié)果按染色強(qiáng)度和腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性細(xì)胞比例進(jìn)行判定〔14〕，將每張染色切片的染色深淺與背景著色對(duì)比后按染色強(qiáng)度分級(jí)計(jì)分:無(wú)色計(jì)0分,淡黃計(jì)1分,棕黃計(jì)2分,棕褐計(jì)3分；按腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性比例計(jì)分:陰性計(jì)0分,≤10%計(jì)1分，11%～50%計(jì)2分,51%～75%計(jì)3分,>75%計(jì)4分。雙盲法評(píng)分，以染色強(qiáng)度及腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性比例分?jǐn)?shù)相乘得到的積分作為最后判定結(jié)果,≤3分為陰性，>3分為陽(yáng)性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism5軟件繪制生存曲線圖。采用SPSS17.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、Fisher精確概率檢驗(yàn)及Log-rank檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1兩組LC3、Beclin1及mTOR表達(dá)情況 兩組標(biāo)本中均有LC3、Beclin1及mTOR表達(dá)，乳腺癌組LC3、Beclin1及mTOR表達(dá)陽(yáng)性率〔41.30%(38例)、32.60%(30例)、45.65%(42例)〕顯著低于對(duì)照組〔10.87%(10例)、13.04%(12例)、11.96%(11例)〕(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 兩組LC3、Beclin1及mTOR的免疫組化(DAB染色，×40)

2.2乳腺癌組LC3、Beclin1及mTOR表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 乳腺癌組中LC3及mTOR表達(dá)與細(xì)胞分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(均P<0.05)，分化程度差、臨床分期晚、伴有淋巴轉(zhuǎn)移的患者LC3及mTOR陽(yáng)性表達(dá)率明顯增高。Beclin1表達(dá)與腫瘤直徑、分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(均P<0.05)。腫瘤直徑≤2 cm、分化程度好、臨床分期早、不伴有淋巴轉(zhuǎn)移的患者Beclin1陽(yáng)性表達(dá)率增高。見(jiàn)表1。

2.3乳腺癌組LC3、Beclin1及mTOR表達(dá)與生存期的關(guān)系 乳腺癌組LC3陽(yáng)性表達(dá)組5年OS(62.63%)顯著低于LC3陰性表達(dá)組(93.94%，χ2=6.391，P=0.012)；乳腺癌組Beclin1陽(yáng)性表達(dá)組5年OS(94.44%)顯著高于Beclin1陰性表達(dá)組(71.26%，χ2=4.352，P=0.037)；乳腺癌組mTOR陽(yáng)性表達(dá)組5年OS(66.76%)顯著低于mTOR陰性表達(dá)組(93.59%，χ2=4.538，P=0.033)。見(jiàn)圖2。

表1 LC3、Beclin1及mTOR表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系〔n(%)〕

圖2 乳腺癌組LC3、Beclin1及mTOR表達(dá)對(duì)OS的影響

3 討 論

自噬是一個(gè)降解細(xì)胞內(nèi)成分以緩沖饑餓條件下代謝壓力的過(guò)程，其失調(diào)與癌癥的進(jìn)展有關(guān)，基于基因表達(dá)譜的研究發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)基因與乳腺癌有關(guān)，但自噬是抑制或促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)一直是爭(zhēng)論的焦點(diǎn)〔15〕。研究認(rèn)為，自噬具有維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要作用，在乳腺癌發(fā)生早期，自噬能夠通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)、控制細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)、破壞基因突變等方式阻止腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔7,16,17〕。本研究提示乳腺癌中LC3、Beclin1及mTOR的表達(dá)與乳腺癌的發(fā)生有關(guān)。LC3是自噬體膜上的標(biāo)記蛋白，存在于自噬溶酶體的降解過(guò)程中，被廣泛視為自噬標(biāo)志物，自噬溶酶體形成后，自噬體通過(guò)吞噬消除細(xì)胞中的有害因子并為正常細(xì)胞提供能量〔1,7〕，LC3表達(dá)水平的降低提示自噬體形成減少，細(xì)胞自噬下調(diào)；Beclin1于1999年被確認(rèn)為是一種抑癌基因，在正常的乳腺上皮細(xì)胞中呈高表達(dá)，在人乳腺癌上皮組織中，Beclin1 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低，而過(guò)表達(dá)Beclin1可增強(qiáng)自噬從而抑制人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的細(xì)胞增殖和腫瘤形成〔18〕，40%～75%的散發(fā)性乳腺癌中存在Beclin1一個(gè)等位基因的缺失，被認(rèn)為是導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞自噬缺陷及自噬活性降低的原因〔6〕；mTOR是一個(gè)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，能夠在細(xì)胞水平上將影響營(yíng)養(yǎng)利用的生長(zhǎng)信號(hào)進(jìn)行整合從而調(diào)控細(xì)胞內(nèi)能量代謝和細(xì)胞自噬等過(guò)程，mTOR對(duì)自噬有誘導(dǎo)作用，但營(yíng)養(yǎng)不良的細(xì)胞外環(huán)境也會(huì)抑制mTOR的活性，因此惡性腫瘤中mTOR多為低表達(dá)，同時(shí)，乳腺癌的發(fā)生與磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路的激活關(guān)系密切，在超過(guò)30%的浸潤(rùn)性乳腺癌中可發(fā)現(xiàn)該通路中基因分子的改變〔1,7〕。三者作為作用不同自噬階段的自噬相關(guān)基因，其表達(dá)水平的下調(diào)可能抑制正常乳腺細(xì)胞的自噬活性,從而導(dǎo)致乳腺癌的發(fā)生。

自噬具有雙面性，在消除細(xì)胞有害因子抑制腫瘤發(fā)生的同時(shí)也可能促進(jìn)腫瘤的發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)，在惡劣環(huán)境中，自噬將會(huì)通過(guò)降解細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和細(xì)胞器為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)提供能量，從而維持其在營(yíng)養(yǎng)缺乏條件下的生存，導(dǎo)致腫瘤進(jìn)行性發(fā)展〔7,18〕。Beclin1是抑癌基因，有研究證實(shí)Beclin1在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移陽(yáng)性及Ki67陽(yáng)性的乳腺癌組織中表達(dá)更低〔5〕，同時(shí)，AKT和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)的磷酸化水平在Beclin1缺失的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中升高，Beclin1與生長(zhǎng)因子受體信號(hào)通路持續(xù)的強(qiáng)度及時(shí)間存在負(fù)相關(guān)，提示Beclin1可以抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移〔19〕，這或許是本研究中發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者Beclin1表達(dá)與腫瘤負(fù)荷呈負(fù)相關(guān)的原因。此外，癌癥基因組圖譜(TCGA)和乳腺癌國(guó)際聯(lián)盟(METABRIC)兩個(gè)大型數(shù)據(jù)庫(kù)中乳腺癌患者的mRNA表達(dá)模式顯示，與乳腺癌中惡性程度比較低的亞型(LuminalA/B)相比，Beclin1低表達(dá)在乳腺癌惡性程度比較高的亞型人類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子(HER)-2和基底細(xì)胞樣(多為三陰性)中更常見(jiàn)，并且與晚期腫瘤級(jí)別密切相關(guān)〔9〕。腫瘤直徑、細(xì)胞分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況均是體現(xiàn)腫瘤負(fù)荷和惡性程度的臨床病理指標(biāo)，對(duì)乳腺癌患者的預(yù)后具有一定的預(yù)測(cè)作用，而本研究的生存分析結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)。由于自噬在乳腺癌中的矛盾性，LC3、Beclin1及mTOR對(duì)乳腺癌預(yù)后的預(yù)測(cè)作用尚不明確，TCGA和METABRIC兩個(gè)大型數(shù)據(jù)庫(kù)中乳腺癌患者的mRNA表達(dá)模式顯示LC3和mTOR高表達(dá)量的患者生存率顯著低于低表達(dá)量者，與本研究結(jié)果一致〔9〕。有研究從幾個(gè)獨(dú)立隊(duì)列的mRNA和蛋白水平上驗(yàn)證得出LC3是三陰性乳腺癌不良預(yù)后的可靠標(biāo)記的結(jié)論，抑制自噬是三陰性乳腺癌一種有前途的治療策略，而LC3對(duì)乳腺癌其他亞型的預(yù)后無(wú)預(yù)測(cè)價(jià)值〔20〕；而針對(duì)23項(xiàng)不同癌癥的研究進(jìn)行系統(tǒng)審查和薈萃分析則顯示Beclin1可能是胃癌、乳腺癌和淋巴瘤有利預(yù)后的預(yù)測(cè)因素，LC3可能預(yù)示乳腺癌的不良預(yù)后(HR=1.98,95%CI=1.25～3.13)〔21〕，Tang等〔9〕也發(fā)現(xiàn)Beclin1的低表達(dá)與預(yù)后不良有關(guān)，其表達(dá)是生存的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。當(dāng)前大部分研究還是傾向于Beclin1的表達(dá)下降與預(yù)后不良和整體生存率降低有關(guān)，在乳腺癌中，Beclin1表達(dá)越高其預(yù)后越好〔22〕。

綜上，LC3、Beclin1及mTOR在乳腺癌中表達(dá)均降低，與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后相關(guān)。自噬的失活與乳腺癌患者的生存期縮短有關(guān)，自噬信號(hào)的預(yù)后價(jià)值獨(dú)立于已知的臨床預(yù)后因素，包括年齡、腫瘤大小、級(jí)別、雌激素受體狀態(tài)、孕激素受體狀態(tài)、酪氨酸激酶受體(ERBB)2狀態(tài)、淋巴結(jié)狀態(tài)和腫瘤蛋白53突變狀態(tài)，同時(shí)，自噬信號(hào)也可以預(yù)測(cè)乳腺癌無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的存活率〔15〕，但由于自噬過(guò)程調(diào)控的復(fù)雜性，尚需針對(duì)不同的乳腺癌亞型進(jìn)行大樣本的前瞻性研究并深入探討基因?qū)用娴臋C(jī)制調(diào)控，以尋找到針對(duì)乳腺癌的特異性自噬信號(hào)開(kāi)發(fā)新的治療策略。