FTO基因敲低對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)Th細(xì)胞的影響

王舟 祁春梅

(徐州礦務(wù)集團(tuán)總醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇 徐州 221000)

根據(jù)各項(xiàng)統(tǒng)計(jì)資料的結(jié)果，不論是按各大主要城市還是按全國(guó)分類，心血管病死亡率都居于第一〔1〕。其中動(dòng)脈粥樣硬化(AS)斑塊的形成是心血管疾病發(fā)病的主要病理基礎(chǔ)。AS斑塊形成的因素機(jī)制主要包括：①炎癥-免疫反應(yīng)；②氧化-應(yīng)激反應(yīng)；③細(xì)胞凋亡-自噬；④血管正性重構(gòu)；⑤新生血管和淋巴管；⑥斑塊應(yīng)力和剪切力等。其中，核心機(jī)制是炎癥免疫反應(yīng)，貫穿整個(gè)AS斑塊形成的始終。細(xì)胞的免疫作為炎癥免疫反應(yīng)的主要部分，其機(jī)制復(fù)雜，Th在免疫應(yīng)答中充當(dāng)了中間介質(zhì)作用。通過(guò)自我增生擴(kuò)散，間接激活其他類型免疫細(xì)胞，使其直接作用于炎癥反應(yīng)〔2〕。生物體內(nèi)，甲基化過(guò)程涉及重金屬修飾、基因表達(dá)調(diào)控、蛋白質(zhì)功能調(diào)節(jié)及核糖核酸(RNA)加工。大量研究表明m6A在各種基本生物過(guò)程中具有重要的功能，m6A修飾的T細(xì)胞特異性遞送可能是緩解各種自身免疫疾病的有效治療途徑〔3〕。其中FTO基因起到去m6A RNA甲基化作用。Li等〔4〕首次闡明了m6A修飾在T細(xì)胞介導(dǎo)的相關(guān)發(fā)病機(jī)制中的體內(nèi)生物學(xué)作用。證實(shí)了m6A mRNA甲基化通過(guò)靶向白細(xì)胞介素(IL)-7/信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白(STAT)5/細(xì)胞因子信號(hào)抑制物(SOCS)途徑控制T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而抑制腸炎的發(fā)生〔4〕。最新研究表明FTO在衰竭的哺乳動(dòng)物心臟和缺氧的心肌細(xì)胞中表達(dá)減少，從而增加了RNA中的m6A表達(dá)，降低了心肌細(xì)胞的收縮功能〔5〕。本研究通過(guò)敲低AS兔的FTO基因， 觀察其病理變化及輔助性T細(xì)胞(Th)的變化。

1 材料和方法

1.1動(dòng)物 3月齡健康純種雌性新西蘭大白兔，于徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)買，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)經(jīng)徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，許可證號(hào)：SYXK(蘇)2015-0029，合格證編號(hào)201904540。

1.2病毒 FTO腺相關(guān)病毒(AAV9-FTO)由蘇州吉瑪基因公司提供。病毒位點(diǎn)的shRNA靶點(diǎn)信息：FTO-兔-146 GCAGCTGAAATATCCTAAACT、FTO-兔-236 GCACAAGATGGCTGCTTATT、FTO-兔-524 GCCAGTGCATGGCAGAATT；CD3+,CD4+抗體由BIO-RAD公司提供。

1.3AS模型的建立 兔先稱重，然后放在固定的兔欄中經(jīng)耳緣靜脈注射 1%戊巴比妥鈉(10 mg/ml)麻醉。麻醉成功后，固定在動(dòng)物手術(shù)臺(tái)上。選取右側(cè)股動(dòng)脈(搏動(dòng)最強(qiáng)點(diǎn))上方為手術(shù)部位，先行剃毛、消毒，然后解剖，逐層分離皮下組織和肌肉，鈍性分離出股動(dòng)脈約3 cm。股動(dòng)脈遠(yuǎn)端使用止血夾夾閉，使用7號(hào)針頭穿刺出小口，放入引導(dǎo)針。松開止血夾，觀察引導(dǎo)針中動(dòng)脈出血明顯，送入 0.014英寸(0.036 cm)導(dǎo)絲，抽出引導(dǎo)針，然后沿導(dǎo)絲將直徑3.5 mm、長(zhǎng)15 mm的球囊導(dǎo)管(用 1∶15 稀釋的肝素鈉生理鹽水浸潤(rùn))送入腹主動(dòng)脈約 20 cm，推注蒸餾水達(dá)8個(gè)大氣壓以充盈球囊，然后回拉球囊至髂總動(dòng)脈，反復(fù)回拉 3 次以確保造成腹主動(dòng)脈內(nèi)皮損傷，退出球囊導(dǎo)管后壓迫局部傷口止血，股動(dòng)脈兩端扎上細(xì)線標(biāo)記(未結(jié)扎)，局部和肌肉給予青霉素預(yù)防感染。A 組為假手術(shù)組, B組于股AS處理射病毒空載體(GFP),C 組為 FTO敲低組。 均行高脂喂養(yǎng)9 w。

1.4病毒的注入 9 w末所有兔1%戊巴比妥鈉經(jīng)耳緣靜脈完全麻醉，C組動(dòng)脈斑塊上將滴度為 8×109pfu/ml 的AAV9 (FTO敲低)病毒注入，上下兩端暫時(shí)阻斷該處血流10 min后恢復(fù)血供完成后關(guān)閉腹腔，局部及肌肉給予青霉素預(yù)防感染。

1.5蘇木素-伊紅(HE)染色 染色步驟:脫蠟，覆水，蘇木染色，伊紅染色，脫水，透明，中性樹膠封固。10 w 末3組各取兔3只提取組織總蛋白。取組織，研磨,加入放射免疫沉淀(RIPA)蛋白裂解液。 置于超聲波細(xì)胞裂解儀內(nèi)裂解 10 min。 將裂解好的組織置于低溫高速離心機(jī)內(nèi),4°C,12 000 r/min,離心15 min,離心后取上清,置于-80°C冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?測(cè)定蛋白凝膠電泳： 裝板，配膠，上樣，裁膠，鋪膜，封閉，孵育，顯色。結(jié)果以圖像軟件 image plus pro 分析處理。

1.6兔動(dòng)脈斑塊中淋巴細(xì)胞的提取 空氣法處死兔,取標(biāo)記部位動(dòng)脈, 置于滅菌磷酸鹽緩沖液(PBS)；取組織塊稱重后,用眼科剪刀無(wú)菌操作,將組織剪成小塊； 將組織塊放在 70 μm細(xì)胞篩網(wǎng)上, 用研磨器反復(fù)研磨,加入勻漿沖洗液,使細(xì)胞全部通過(guò)篩網(wǎng)滴到離心管中；棄去篩網(wǎng),組織研磨液經(jīng)900 r/min,離心 10 min,棄上清； 用樣本稀釋液重懸組織細(xì)胞, 備用； 取一支離心管,加入與組織單細(xì)胞懸液等量的分離液。 用吸管小心吸取組織單細(xì)胞懸液加于分離液液面上,800～1 000 r/min,離心20～30 min；離心后,第二層為環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層；用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層到另一15 ml 離心管中,向離心管中加入 10 ml 洗滌液,混勻細(xì)胞； 500 r/min,離心 10 min。棄上清。用吸管以 5 ml 清洗液重懸所得細(xì)胞。500 r/min,離心 10 min。 棄上清后以0.5 ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。

1.7細(xì)胞流式檢測(cè) 細(xì)胞表面分子標(biāo)記:細(xì)胞大約1×106,經(jīng) PBS 洗滌 2 次,每個(gè)反應(yīng)加入 100 μl(含1 μg的抗兔的CD3、CD4 抗體) 反應(yīng)液,室溫反應(yīng)1 h,PBS 洗滌2次,避光加入反應(yīng)液,室溫反應(yīng)30 min,PBS 洗滌2次,即可上機(jī)檢測(cè)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)及Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一般情況及模型建立 整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中30只新西蘭大白兔共死亡4只，A組1只死于感染，1只死于麻醉；B組1只死于麻醉；C組1只死于感染，最終存活26只。根據(jù)兔子的血管粗細(xì)、體重差異，在壓力的選擇上，除了單純地根據(jù)之前的經(jīng)驗(yàn)外，還應(yīng)根據(jù)拉動(dòng)球囊時(shí)的阻力適當(dāng)調(diào)整壓力大小，一般在8～10個(gè)大氣壓之間。通過(guò)血管彩超可以明顯判別斑塊的生成。見圖1。

圖1 兔AS模型及斑塊生成前后

2.2病理學(xué)結(jié)果 10 w末處死兔并取粥樣斑塊組織行HE染色圖片，C組斑塊炎癥反應(yīng)更為明顯。A組、B組明顯可見大量泡沫細(xì)胞，血管壁變薄，內(nèi)皮剝落，管腔明顯變窄。C組可見斑塊內(nèi)出血，內(nèi)皮剝脫伴表面血小板聚集。見圖2。

2.3Western印跡結(jié)果 A組與B組FTO蛋白表達(dá)(0.991±0.053 vs 0.979±0.310)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。A組與C組FTO蛋白表達(dá)(0.261±0.082)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。B組與C組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)。見圖3。

2.4細(xì)胞流式結(jié)果 各組斑塊淋巴細(xì)胞、CD3+CD4+T細(xì)胞數(shù)量見表1。A組與B組CD3+CD4+T細(xì)胞比例(43.6% vs 46.8%)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；A組與C組(53.0%)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；B組與C組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見圖4。

圖2 各組10 w末斑塊組織(HE)

圖3 各組FTO蛋白Western印跡

表1 各組斑塊淋巴細(xì)胞數(shù)量(n=3，個(gè)/ml)

圖4 各組CD3+CD4+T細(xì)胞流式結(jié)果

3 討 論

FTO 作為第一RNA脫甲基酶〔6〕，其發(fā)現(xiàn)及探索恢復(fù)了RNA甲基化研究，表明m6A是一種可逆的動(dòng)態(tài)RNA修飾，存在影響生物調(diào)節(jié)的可能，類似于可逆DNA和組蛋白修飾〔7〕。2012年，m6A RNA免疫沉淀的全轉(zhuǎn)錄組方法被報(bào)道，緊接著出現(xiàn)了下一代測(cè)序(m6A-seq或MeRIP-seq)，并在人類和小鼠細(xì)胞的7 000多個(gè)mRNA轉(zhuǎn)錄本和數(shù)百個(gè)長(zhǎng)非編碼RNA中檢測(cè)到m6A峰，其中許多m6A峰在人類和小鼠之間存在相似性〔8〕。因此，這些研究表明mRNAs中m6A甲基化是一種普遍的修飾，可能具有功能重要性。最近的研究表明，mRNA或非編碼RNA中m6A的修飾在組織發(fā)育、干細(xì)胞自我更新和分化、熱休克反應(yīng)控制和晝夜節(jié)律控制及RNA命運(yùn)和功能，如mRNA穩(wěn)定性、剪接、轉(zhuǎn)運(yùn)、定位和翻譯、初級(jí)microRNA加工和RNA-蛋白質(zhì)相互作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用〔9〕。FTO和ALKBH5(2013年鑒定的第二種RNA去甲基化酶)都屬于AlkB家族，并以Fe(Ⅱ)-和α-酮戊二酸依賴的方式催化m6A脫甲基，被稱為m6A“擦除物”。甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白(METTL)3和METTL14被鑒定為m6A“寫入者”，它們?cè)赪TAP的支持下形成異二聚體以催化m6A甲基化。YTHDF1/2/3被鑒定為m6A“讀取器”，其優(yōu)先結(jié)合G〔G>A〕 m6ACU共有序列中含有m6A的RNA，并導(dǎo)致不同的生物學(xué)后果，如誘導(dǎo)RNA衰變和促進(jìn)mRNA翻譯。已知FTO與人體體重增加和肥胖密切相關(guān)〔10〕。動(dòng)物模型研究表明，F(xiàn)TO缺乏可以防止肥胖并導(dǎo)致生長(zhǎng)遲緩〔11〕，而FTO的過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致食物攝入增加和肥胖。在人類中，F(xiàn)TO的功能喪失突變也導(dǎo)致嚴(yán)重的生長(zhǎng)遲緩。作為第一個(gè)被鑒定的RNA去甲基化酶，F(xiàn)TO調(diào)節(jié)靶mRNA的去甲基化，F(xiàn)TO調(diào)節(jié)大腦中多巴胺能信號(hào)并且還調(diào)節(jié)成脂調(diào)節(jié)因子的mRNA剪接，因此在成脂過(guò)程中起關(guān)鍵作用。

2016年，何川教授在Nature Reviews Genetics上發(fā)表關(guān)于m6A RNA綜述，全面解析了m6A的作用機(jī)制〔12〕。作為真核生物mRNA上最常見的轉(zhuǎn)錄后修飾，超過(guò)80%的RNA堿基甲基化與其相關(guān)。其研究發(fā)現(xiàn)，m6A加速了細(xì)胞mRNA代謝和翻譯的修飾；在細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育和免疫應(yīng)答等過(guò)程中起重要生理作用。綜上可以推斷敲低FTO基因可以升高組織m6A mRNA水平進(jìn)而影響T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。本研究反向驗(yàn)證了甲基化對(duì)T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的作用。

AS斑塊形成的特點(diǎn)包括：①局部受損后，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為淋巴巨噬細(xì)胞，通過(guò)各種反應(yīng)生成泡沫細(xì)胞，反復(fù)炎癥反應(yīng)，最后形成各種的斑塊組織。②斑塊組織在各種其他因素的影響下，不斷發(fā)生演化。其中細(xì)胞免疫機(jī)制是其核心。本次研究的重點(diǎn)在T淋巴細(xì)胞，按T細(xì)胞表面分子T細(xì)胞受體(TCR)分類，可分為αβ+T細(xì)胞、γδ+T細(xì)胞兩類。在體內(nèi)αβ+T細(xì)胞分布廣，抗原識(shí)別受體種類繁多。αβ+T細(xì)胞之后可進(jìn)一步分為CD4+T細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞。CD4+T細(xì)胞識(shí)別外源性抗原肽〔主要組織相容性復(fù)合體(MHC)Ⅱ類分子所提呈〕，活化后主要分化為Th(CD3+CD4+)。Th在免疫應(yīng)答中充當(dāng)了中間介質(zhì)作用。通過(guò)自我增生擴(kuò)散，間接激活其他類型免疫細(xì)胞，使其直接作用于炎癥反應(yīng)〔13〕。

本次研究結(jié)果提示，表面FTO基因?qū)h的調(diào)控具有意義?；谝陨鲜聦?shí)：①FTO 調(diào)控m6A 甲基化水平。②FTO基因敲低，AS穩(wěn)定性降低。③FTO基因敲低CD3+CD4+T細(xì)胞(Th)占T細(xì)胞的比例明顯升高。可以推斷FTO基因敲低在調(diào)控m6A 甲基化水平同時(shí)，降低了T細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)。

以往治療AS更多的是從病因?qū)W的角度考慮，控制危險(xiǎn)因素。免疫因素作為危險(xiǎn)因子之一，可控制的方法并不多，假設(shè)能夠通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)因子的水平，起到控制局部炎癥反應(yīng)，穩(wěn)定AS。

本課題組在之前的研究中，已經(jīng)成功建立了兔AS模型，其基礎(chǔ)就是在動(dòng)脈內(nèi)皮球囊拉傷的基礎(chǔ)上，高脂喂養(yǎng)。本次研究選擇了之前實(shí)驗(yàn)成功的AS兔模型。此模型兔中暫無(wú)METTL3和METTL14敲低型，選擇注射AVV-FTO敲低來(lái)達(dá)到局部甲基化；按照理論，整體注射AVV9-FTO效果更加明顯，但基于經(jīng)費(fèi)和兔的體重，這個(gè)操作不切實(shí)際，選擇局部注射AVV9-FTO敲低達(dá)到甲基化的效果。

FTO基因如何調(diào)節(jié)m6A對(duì)于人體不同細(xì)胞的作用是復(fù)雜的，2018年科研成果使用了臨床人類心衰樣本、豬和小鼠心力衰竭模型及原代心肌細(xì)胞進(jìn)行研究，探索在心臟穩(wěn)態(tài)重構(gòu)及修復(fù)過(guò)程中脂肪含量和FTO依賴的m6A轉(zhuǎn)錄的生理和病理學(xué)作用，研究表明FTO在衰竭的哺乳動(dòng)物心臟和缺氧的心肌細(xì)胞中表達(dá)減少，從而增加了RNA中m6A表達(dá)，降低了心肌細(xì)胞的收縮功能〔5〕?，F(xiàn)在研究的焦點(diǎn)主要集中在甲基化過(guò)程對(duì)于不同組織器官的影響，特別是在腫瘤及血液疾病中，如①腫瘤干細(xì)胞生長(zhǎng)，自我更新和腫瘤發(fā)生〔14〕。②核糖核酸代謝，包括核糖核酸/微小核糖核酸/低核糖核酸生物發(fā)生、加工和出口〔13〕。③FTO/m6A/MYC/增強(qiáng)癌結(jié)合蛋白質(zhì)α信號(hào)通路〔15〕。④IL-7/STAT5/SOCS途徑〔4〕。本次研究著重在AS斑塊形成中FTO基因?qū)h細(xì)胞的影響，對(duì)于m6A甲基化通路研究仍待發(fā)掘。