轉(zhuǎn)OsALS基因浮萍的抗除草劑活性分析

馮國棟 劉 菲 胡建立 張融雪 孫 玥 朱曄榮 王 勇 蘇京平 劉學軍

摘? ? 要：以乙酰乳酸合成酶為靶標的除草劑具有用量少、選擇性強、殺草譜廣等特點，在田間被廣泛應用。本研究前期篩選到一株抗咪唑啉酮類除草劑“普施特”的水稻植株，并通過克隆獲得了目的基因OsALS，序列分析發(fā)現(xiàn)OsALS基因的第627位點發(fā)生了突變。本研究為進一步研究突變的OsALS基因與水稻抗除草劑活性之間的關系，將OsALS構(gòu)建到了pCAMBIA1301載體上，獲得了轉(zhuǎn)OsALS基因的浮萍并進行了轉(zhuǎn)基因浮萍對除草劑的活性分析。研究結(jié)果表明，OsALS基因中627位點的突變很可能是導致轉(zhuǎn)基因浮萍對除草劑“普施特”產(chǎn)生抗性的重要原因，研究結(jié)果為水稻種質(zhì)資源和除草劑的開發(fā)提供了重要支持。

關鍵詞：OsALS基因;浮萍;載體構(gòu)建;除草劑

中圖分類號：Q789? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2020.01.003

Analysis of Herbicide Resistance Activity of Transgenic OsALS Duckweed

FENG Guodong1， LIU Fei2， HU Jianli1，2， ZHANG Rongxue2， SUN Yue2， ZHU Yerong1， WANG Yong1， SU Jingping2， LIU Xuejun2

（1.Nankai University， Tianjin 300071， China;2.Crop Research Institute of Tianjin Academy of Agricultural Sciences， Tianjin 300112， China）

Abstract：The herbicides targeting at acetolactate synthase are widely used in the field， because their low dosage， high selectivity and wide herbicide spectrum. In the previous study， we screened one line of rice，which has resistance to "Pursuit"， an imidazoline ketone herbicide，and cloned the OsALS gene. Analysis of sequencing found that OsALS gene had a mutation in 627 site. Here， we successfully constructed OsALS into plant expression vector pCAMBIA1301， and got OsALS transgenic duckweed. In addition， we analyzed the activity of herbicide in transgenic duckweeds. The results showed that the transgenic strains had resistance to Pursuit， probably resulted from the 627 site mutation in OsALS gene. These results provided important support for the rice germplasm creation and the exploitation of herbicides.

Key words： OsALS gene;duckweed;vector construction;herbicide

水稻是世界上重要的糧食作物之一，但雜草和雜草稻的出現(xiàn)嚴重影響了其生物學產(chǎn)量和經(jīng)濟產(chǎn)量，而雜草和雜草稻的防治也是非常棘手的問題[1-3]。目前，利用除草劑防治雜草和雜草稻是最佳手段。但隨著除草劑的廣泛使用，導致田間雜草和雜草稻的抗藥性越來越強，這對田間除草工作提出了更高的要求。

乙酰乳酸合成酶（acetolactate synthase， ALS）在植物體中是催化支鏈氨基酸合成的重要催化酶[4]。以ALS為靶標的除草劑能與植物體內(nèi)的ALS蛋白結(jié)合，抑制一些側(cè)鏈氨基酸的合成，如纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸，從而抑制細胞的分裂，影響植物生長。咪唑啉酮類除草劑就是以ALS為靶標設計的一類除草劑，通過抑制乙酰乳酸合成酶的活性，從而抑制側(cè)鏈氨基酸的合成[5]。水稻對咪唑啉酮類除草劑表現(xiàn)的抗性主要是某些氨基酸位點的改變，導致ALS蛋白結(jié)構(gòu)改變。目前，已報道位點包括Gly 95、Ala 96、Ala 122、Pro 197、Asp 376、Trp 548、Ser 627、Ser 653 和 Gly 654，不同位點突變產(chǎn)生了抗除草劑水平的差異[6-10]。

浮萍（Lemna minor L.）廣泛存在于世界各地，經(jīng)常被作為模式植物進行植物生理學研究。此外，浮萍也是一種有效的環(huán)境監(jiān)測植物。早在20世紀50年代，就有浮萍被用于檢測苯氧類除草劑的報道，隨后不同屬種的浮萍被廣泛用于除草劑的篩選和作用效果的評估[11]。如鄭麗英[12]、梁衛(wèi)玲等[13]、田延輝等[14]、汪傳剛等[15]先后分別研究了雙草醚、乙草胺、丁草胺和二甲戊靈等除草劑對浮萍的影響。

筆者在前期工作中，對合作單位天津市農(nóng)作物研究所篩選到的抗咪唑啉酮類除草劑“普施特”水稻（命名為‘選一）中的ALS基因進行了克隆。通過測序顯示‘選一中的ALS基因序列1880位點的G突變成了A，導致編碼的氨基酸由絲氨酸變成了天冬酰胺。該突變導致“選一”水稻在實驗室條件下對咪唑啉酮類除草劑“甲氧咪草煙”產(chǎn)生非常強的抗性，同時對兩種嘧啶水楊酸類除草劑“雙草醚”和“嘧啶肟草醚”、兩種磺酰脲類除草劑“甲基二磺隆”和“煙嘧磺隆”都有不同程度的抗性。這些結(jié)果說明，‘選一中的ALS基因關鍵位點的突變與抗除草劑活性密切相關[16]。為進一步驗證OsALS位點突變與“選一”水稻產(chǎn)生抗性之間的關系，我們將該基因在浮萍中進行了遺傳轉(zhuǎn)化，并開展了相關的抗性試驗。

1 材料和方法

1.1 供試植物

浮萍（Lemna turionifera），取材于天津市西青區(qū)淡水湖內(nèi)，脫菌后在實驗室無菌環(huán)境中培養(yǎng)。浮萍葉狀體的繼代培養(yǎng)采用DATKO培養(yǎng)液，培養(yǎng)溫度為（23±2） ℃，光照周期為16L/ 8D，光照強度為4 000 Lx。浮萍愈傷組織的培養(yǎng)條件為溫度（19±1） ℃，光照強度和光周期與葉狀體相同。

供試載體：含有“選一”水稻中克隆基因OsALS的pGEM-T載體和植物雙元表達載體pCAMBIA1301，由本實驗室保存。亞克隆中間載體pEXP-DR，是在pSK載體基礎上改造為pEXP載體后，經(jīng)過本試驗進一步改造成為pEXP-DR。

1.2 主要試劑（盒）與儀器

詳細見表1和表2 。

1.3 OsALS表達載體構(gòu)建

首先將在水稻中克隆出的OsALS基因，構(gòu)建到pEXP-DR載體上，獲得pEXP-OsALS，然后通過限制性內(nèi)切酶獲得由35S驅(qū)動、ployA終止的OsALS基因表達盒與pCAMBIA1301表達骨架，經(jīng)過酶連反應獲得pCAMBIA1301-OsALS基因的雙元表達載體，構(gòu)建流程如圖1所示，并轉(zhuǎn)化到EHA105農(nóng)桿菌中保存。其中大腸桿菌質(zhì)粒提取參照康為世紀生物科技有限公司PurePlasmid Mini Kit說明書進行，提取的質(zhì)粒于-20 ℃保存;質(zhì)粒對大腸桿菌感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化參照大連寶生物公司DH5α使用說明書進行;土壤農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化參照上海唯地生物技術有限公司EHA105 Chemically Competent Cell說明書進行。

酶切反應參照TaKaRa公司限制性內(nèi)切酶的說明書進行。瓊脂糖凝膠電泳回收參照康為Gel Extraction Kit使用方法說明書進行。連接體系中各個組分的用量，按照TaKaRa公司T4連接酶的說明書進行。本文中涉及到其他修飾酶的反應均嚴格參照TaKaRa公司的說明書進行。

1.4 浮萍的遺傳轉(zhuǎn)化與篩選

用構(gòu)建好的pCAMBIA1301-OsALS質(zhì)粒侵染浮萍愈傷組織，經(jīng)過再生和篩選等步驟獲得轉(zhuǎn)基因浮萍，并進行除草劑抗性試驗。該部分試驗方法參照Yang等[17]建立的浮萍遺傳轉(zhuǎn)化體系并由魏瑩等[18]進行優(yōu)化，侵染后的愈傷組織的篩選方法由武鳳潔等[19]優(yōu)化。

1.5 抗除草劑活性試驗

用DMSO將除草劑粉末完全溶解，加水定容至最終濃度即為母液。用于浮萍篩選和鑒定的試驗在6孔板中進行，總體積為10 mL，按照終濃度加入培養(yǎng)基和除草劑母液。通過比較浮萍生長狀態(tài)和生長速率，以分析轉(zhuǎn)基因浮萍的抗除草劑活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 pCAMBIA1301-OsALS質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定

為了研究OsALS基因?qū)Τ輨┛剐缘挠绊?，筆者使用35S啟動子驅(qū)動OsALS基因，使其過量表達，將其連入雙元表達載體pCAMBIA1301中獲得完整的表達盒35S：ALS：ployA，并將該雙元載體導入農(nóng)桿菌EHA105中。使用農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化浮萍，以達到在浮萍中過表達OsALS基因的目的。

載體構(gòu)建是先采用PCR擴增得到的2 000 bp左右的目的OsALS基因條帶，用凝膠回收試劑盒回收該片段后，用T4連接酶與pEASY-T1 Simple vector載體相連，經(jīng)PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)化子標記為pT-ALS（圖2a）。

對陽性轉(zhuǎn)化子pT-ALS提質(zhì)粒后用BglⅡ、NdeⅠ雙酶切，得到2 000 bp左右的目的基因條帶。同時用BglⅡ、NdeⅠ雙酶切中間載體pEXP-35S-Tp-pA獲得載體骨架（圖2b），經(jīng)凝膠電泳切膠回收后，與膠回收的OsALS基因通過連接酶連接，得到pEXP-ALS。經(jīng)PCR鑒定得到的陽性轉(zhuǎn)化子標記為pEXP-ALS（圖2c）。

為進一步獲得植物表達載體，以限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和XbaⅠ共同對pEXP-ALS和pCAMBIA1301載體進行雙酶切，將酶切后的35S-ALS-pA和pCAMBIA1301載體骨架利用瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒進行回收純化，并利用T4連接酶進行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞后，獲得轉(zhuǎn)化子pCAMBIA1301-35S-OsALS。通過質(zhì)粒PCR和限制性內(nèi)切酶Bgl II和Nde I對質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，結(jié)果與預期相符，說明成功獲得最終的表達載體pCAMBIA1301-35S-OsALS（圖2d）。

將pCAMBIA1301-35S-OsALS質(zhì)粒利用凍融法導入農(nóng)桿菌EHA105中，通過對獲得的轉(zhuǎn)化子進行PCR 和酶切鑒定，發(fā)現(xiàn)目的條帶的大小與預期相符，同時通過對目的片段的測序，結(jié)果顯示所獲EHA105-pCAMBIA 1301-ALS菌株為陽性菌株。

2.2 轉(zhuǎn)OsALS基因浮萍的再生與鑒定

按照課題組建立的遺傳轉(zhuǎn)化方法，用EHA105-pCAMBIA 1301-ALS菌株對浮萍愈傷組織進行了侵染，經(jīng)恢復和再生培養(yǎng)等過程，獲得5個再生株系，筆者對其中4個進行了鑒定和抗性篩選。完整的再生過程如圖3所示。

為獲得轉(zhuǎn)化株系，首先采用潮霉素（Hyg）進行了抗性篩選，使用不同濃度的Hyg對再生植株進行篩選，并用非轉(zhuǎn)基因浮萍（WT）作為對照。結(jié)果顯示，當濃度為1.0 mg·L-1時，WT幾乎全部死亡。隨著Hyg濃度升高，再生植株的生長狀態(tài)越來越差，對Hyg的抗性越來越低，當Hyg濃度為2.5 mg·L-1及以上時，再生植株對Hyg幾乎沒有抗性。由此，筆者確定了Hyg的最佳篩選濃度為1.0～1.5 mg·L-1。經(jīng)過篩選獲得4株抗性株系，分別標記為ALS2、ALS3、ALS4和ALS5，抗性結(jié)果如圖4所示。

2.3 轉(zhuǎn)OsALS基因浮萍分子生物學鑒定

為進一步對抗性株系進行鑒定，采用了基因組PCR檢測及測序驗證。首先，用SDS法提取野生型株系和轉(zhuǎn)基因抗性株系總基因組DNA。PCR結(jié)果顯示，4個抗性株系均有目的基因條帶，而WT株系未有擴增條帶，結(jié)果如圖5所示，并將4個株系DNA擴增產(chǎn)物進行測序。測序結(jié)果中，錯誤匹配點為克隆ALS基因中的突變位點（圖6），因此初步推斷OsALS基因已經(jīng)插入到浮萍基因組中。

同時為了鑒定OsALS基因在浮萍中是否真正表達，又進行了RT-PCR鑒定。首先使用RNA試劑盒提取WT和4株抗性株系的RNA，然后用NanoDrop2000檢測RNA質(zhì)量和濃度，并進行瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA是否降解。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，再以cDNA為模板，進行PCR檢測。PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果顯示，得到的4個抗性株系的基因都有不同程度表達，由此推測4個抗性株系都為ALS的轉(zhuǎn)基因株系，如下圖7所示。

2.4 轉(zhuǎn)OsALS基因浮萍除草劑抗性試驗

2.4.1 抗除草劑“普施特”篩選及鑒定? ?“普施特”是咪唑啉酮類除草劑之一，實驗室早期初步探索出了“普施特”抑制WT生長的大致濃度范圍，因此本試驗設置了0.1，0.5，1.0，2.0，4.0，10 mg·L-1共6個濃度進行篩選。每個處理最初放入3株兩葉的浮萍，于16 L，23 ℃： 8D，21 ℃環(huán)境中培養(yǎng)，6 d后進行表型比對，并統(tǒng)計葉片數(shù)量及生長狀態(tài)。

由圖8可知，WT在普施特濃度為0.1 mg·L-1時，可以緩慢生長，生長速率明顯低于4個轉(zhuǎn)基因株系，而在0.5 mg·L-1及以上濃度時未見到明顯擴繁現(xiàn)象，但即使在10.0 mg·L-1時WT株系也沒有全部變白或死亡現(xiàn)象。隨著普施特篩選濃度的增加，ALS轉(zhuǎn)基因株系表現(xiàn)出了越來越低的抗性。ALS 2在2.0 mg·L-1范圍內(nèi)可以進行不同程度的擴繁，長出的葉片大多呈淺綠色。 ALS 3、ALS 4和ALS 5三個株系在4.0 mg·L-1時仍有生長。但轉(zhuǎn)基因株系在普施特濃度為10.0 mg·L-1時，生長受到的影響遠高于WT，另外轉(zhuǎn)基因株系之間受普施特影響程度也存在差異。

2.4.2 抗除草劑“二甲戊靈”篩選及鑒定? ?筆者為了驗證ALS基因突變位點與水稻抗藥性間的關系，我們用非ALS類除草劑對轉(zhuǎn)基因株系進行鑒定。設定了0.5，1.0，5.0，10.0，20.0 mg·L-1 共5個終濃度梯度進行試驗，每個處理最初接入浮萍數(shù)量均為3株，12 d后拍照記錄，結(jié)果如圖9所示。

由圖9可知，無論WT還是轉(zhuǎn)基因株系，對于低濃度的二甲戊靈均有一定抗性。隨著濃度增加，浮萍受“二甲戊靈”影響加劇。通過葉狀體數(shù)目的比較，發(fā)現(xiàn)WT和轉(zhuǎn)基因株系在不同濃度時無明顯差異。因此我們推斷轉(zhuǎn)ALS基因沒有改變浮萍對“二甲戊靈”的抗性。

3 結(jié)論與討論

本研究在前期克隆抗咪唑啉酮類除草劑水稻‘選一OsALS基因的基礎上，通過植物表達載體pCAMBIA1301-35S-OsALS的成功構(gòu)建以及對浮萍的遺傳轉(zhuǎn)化，篩選獲得4個OsALS轉(zhuǎn)基因浮萍株系。同時，通過對轉(zhuǎn)基因株系的ALS類除草劑“普施特”和非ALS類除草劑“二甲戊靈”的抗性分析，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因浮萍對“普施特”有一定的抗性，而對“二甲戊靈”沒有顯著抗性;另外，課題組通過對OsALS基因進行定點突變，獲得了突變基因OsALSC512A，實現(xiàn)了第171位脯氨酸殘基變?yōu)榻M氨酸殘基（Pro171His），并將該基因轉(zhuǎn)化了擬南芥，突變基因OsALSC512A的過表達可以賦予轉(zhuǎn)基因擬南芥一定的雙草醚、甲基二磺隆和五氟磺草胺抗性， 但是不能改變擬南芥對普斯特的抗性[20]，與文獻報道相似，即OsALS基因的Pro171位點的突變，可以導致對磺酰脲類除草劑的抗性，但在某些植物中還可以同時對其他的一種或多種 ALS靶標除草劑產(chǎn)生抗性[21-23]，進一步證明了OsALS基因中關鍵位點的突變和抗除草劑活性之間存在一定的相關性。也為通過基因編輯創(chuàng)制抗除草劑水稻種質(zhì)的研究提供了數(shù)據(jù)支持。

參考文獻：

[1]GOULART I C G R， MATZENBACHER F O， Jr A M. Differential germination pattern of rice cultivars resistant to imidazolinone herbicides carrying different acetolactate synthase gene mutations[J]. Weed research， 2012， 52（3）：224-232.

[2]溫廣月， 沈國輝， 錢振官， 等. 雜草稻對水稻生長及產(chǎn)量的影響[J]. 雜草學報， 2011， 29（2）：51-53.

[3]劉興林， 孫濤， 付聲姣， 等. 水稻田除草劑的應用及雜草抗藥性現(xiàn)狀[J]. 西北農(nóng)林科技大學學報（自然科學版）， 2015， 43（7）： 115-126.

[4]WEBSTER E P， MASSON J A. Acetolactate synthase-inhibiting herbicides on imidazolinone-tolerant rice[J]. Weed science， 2001， 49（5）： 652-657.

[5]GASTON S， ZABALZA A， GONZALEZ E M， et al. Imazethapyr， an inhibitor of the branched-chain amino acid biosynthesis， induces aerobic fermentation in pea plants[J]. Physiologia plantarum， 2010， 114（4）： 524-532.

[6]HAN H， YU Q， PURBA E， et al. A novel amino acid substitution Ala-122-Tyr in ALS confers high-level and broad resistance across ALS-inhibiting herbicides[J]. Pest management?science， 2012， 68（8）： 7.

[7]ENDO M， OSAKABE K， ONO K， et al. Molecular breeding of a novel herbicide-tolerant rice by gene targeting[J]. The Plant?journal， 2007， 52（1）： 10.

[8]POWLES S B， YU Q. Evolution in Action： Plants Resistant to Herbicides[J]. Annual review of plant biology， 2010， 61（1）： 317-347.

[9]RAJGURU S N， BURGOS N R， SHIVRAIN V K， et al. Mutations in the red rice ALS gene associated with resistance to imazethapyr[J]. Weed science， 2005， 53（5）： 567-577.

[10]張微， 王良群， 劉勇，等. 高粱遺傳轉(zhuǎn)化研究進展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學， 2015， 43（27）： 387-389，392.

[11]朱曄榮， 馬榮， 劉清岱，等. 浮萍相關研究的幾方面重要進展[J]. 生物學通報， 2010， 45（4）： 4-6.

[12]鄭麗英. 雙草醚和Cu對浮萍的毒性效應[J]. 廣州化工，?2012， 40（19）： 54-55.

[13]梁衛(wèi)玲， 唐美珍， 王艷娜. 乙草胺、丁草胺及其復合污染對浮萍的毒性效應研究[J]. 綠色科技， 2012（11）： 130-133.

[14]田延輝， 姜輝， 黃繼光， 等. 兩種除草劑對紫背浮萍的生長抑制活性研究[J]. 農(nóng)藥科學與管理， 2015， 36（3）： 61-65.

[15]汪傳剛， 龔道新， 施翔， 等. 噻吩磺隆對三葉浮萍生長的影響[J]. 農(nóng)藥科學與管理， 2007， 28（1）： 24-27.

[16]李燕燕， 劉菲， 張紅磊， 等. 水稻對幾種除草劑的抗性及其相關性基因的克隆[J]. 南開大學學報， 2019， 52（1）： 44-49.

[17]YANG L， HAN J， ZUO Z J， et al. Enhanced plant regeneration in lemna minor by amino acid[J]. Pakistan journal of botany， 2014， 46（3）： 939-943.

[18]魏瑩， 李紅雅， 王勇，等. L-半胱氨酸、L-色氨酸和L-天冬氨酸對浮萍愈傷組織再生影響的探索[J]. 蘭州大學學報（自然科學版）， 2018， 54（2）： 267-271.

[19]武鳳潔， 朱曄榮， 姬曉櫞， 等. 浮萍遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立和優(yōu)化[J]. 生物學通報， 2017 （1）： 53-55.

[20]辛潔，胡健立，張紅磊，等. 過表達OsALS C512A基因擬南芥對幾種除草劑抗性的研究[J]. 南開大學學報，2019，52（4）：15-22.

[21]DUGGLEBY R G， McCOURT J A， GUDDAT L W. Structure and mechanism of inhibition of plant acetohydroxyacid synthase[J]. Plant physiol biochem， 2008， 46： 309-324.

[22]YU Q， POWLES S B. Resistance to AHAS inhibitor herbicides： current understanding[J]. Pest manag sci， 2014， 70： 1340-1350.

[23]FARTYAL D， AGARWAL A， JAMES D， et al. Developing dual herbicide tolerant transgenic rice plants for sustainable weed management[J]. Sci rep， 2018， 8： 11598-11562.

收稿日期：2019-10-29

基金項目：國家重點研發(fā)計劃子課題（2017YFD01005050103）;天津市2018年現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系創(chuàng)新團隊建設（ITTRRS2018003）

作者簡介：馮國棟（1993—），男，河北黃驊人，在讀碩士生，主要從事植物生理技術方面的研究。

通訊作者簡介：朱曄榮（1973—），女，內(nèi)蒙古人，副教授，博士，主要從事生物技術方面的研究。