AST參考方法的不同測(cè)定模式對(duì)測(cè)量結(jié)果精密度的影響

羅曉旭，秦大鵬，申 彬，梁轉(zhuǎn)霞，杜怡青，楊澤華△

(1.山西醫(yī)科大學(xué)，山西太原 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)第六醫(yī)院檢驗(yàn)科，山西太原 030008)

精密度是指在規(guī)定條件下對(duì)同一或類似被測(cè)對(duì)象重復(fù)測(cè)量所得示值或測(cè)得值間的一致程度，是臨床生物化學(xué)方法學(xué)性能評(píng)價(jià)的關(guān)鍵指標(biāo)之一[1]，可反映測(cè)定結(jié)果的離散程度。天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)作為臨床酶學(xué)常測(cè)定的指標(biāo)之一，對(duì)于心臟與肝臟等多種疾病的診斷具有重要的臨床意義[2]?，F(xiàn)在臨床實(shí)驗(yàn)室在多數(shù)情況下為單次檢測(cè)發(fā)出報(bào)告，因而提高實(shí)驗(yàn)室AST測(cè)量結(jié)果的精密度就尤為重要。國(guó)際臨床化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)已于2002年發(fā)布了關(guān)于酶學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化程序的七部系列文件，其中第五部分即AST的參考方法[3]，該方法對(duì)影響AST活性的因素進(jìn)行了詳細(xì)規(guī)定，如試劑的種類、緩沖液的性質(zhì)、反應(yīng)體系的溫度、酸堿度、波長(zhǎng)等[4-5]，但其在讀點(diǎn)時(shí)間周期方面僅表述為“檢測(cè)時(shí)間180 s，讀點(diǎn)≥6”、在混勻時(shí)間方面僅表述為“充分混勻”[5]，并未作具體說(shuō)明。AST參考測(cè)量過(guò)程分為3個(gè)階段：溫育期、延遲期、測(cè)定期。在溫育期，由于還未加入啟動(dòng)試劑，酶促反應(yīng)還未開(kāi)始，此時(shí)的反應(yīng)體系理論上不需要混勻。在測(cè)定期即在比色時(shí)進(jìn)行混勻會(huì)使反應(yīng)曲線有一定程度上的“漂移”，并對(duì)測(cè)定結(jié)果造成影響[7]。因此本實(shí)驗(yàn)將從延遲期的混勻時(shí)間及讀點(diǎn)時(shí)間周期方面設(shè)計(jì)不同的AST測(cè)定模式，對(duì)AST參考方法的最佳測(cè)定模式進(jìn)行探討，優(yōu)化參考方法的測(cè)定模式，提高AST測(cè)定結(jié)果的穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1樣本 Randox質(zhì)控血清，批號(hào)為1092UN；嚴(yán)格按照質(zhì)控血清復(fù)溶說(shuō)明溶解及混勻質(zhì)控品。

1.2儀器與試劑 紫外分光光度計(jì)及其配套比色皿、比色杯恒溫電子控制裝置、電子天平均購(gòu)自日本Shimadzu公司；恒溫水浴箱、pH計(jì)、Finnpipette移液器、電子溫度計(jì)、秒表、容量瓶及各種高精密度玻璃器皿等購(gòu)自中國(guó)北京化工公司；按照國(guó)際臨床化學(xué)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)聯(lián)合會(huì)(IFCC)推薦的AST參考測(cè)量程序配制試劑。還原型-β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸二鈉鹽(NADH)、乳酸脫氫酶(LDH)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；氯化鈉(NaCl)、疊氮鈉(NaN3)、氫氧化鈉(NaOH)、鹽酸(HCl)購(gòu)自中國(guó)北京化工公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris)、L-天門冬氨酸、α-酮戊二酸二鈉鹽、乳酸脫氫酶(LDH)、蘋果酸脫氫酶(MDH)、丙酮酸鈉、牛血清白蛋白均購(gòu)自中國(guó)上海生工有限公司。配制成反應(yīng)液R1，啟動(dòng)液R2。

1.3方法

1.3.1質(zhì)控品的溶解方法 按照質(zhì)控品復(fù)溶要求將Randox凍干粉質(zhì)控品用5 mL去離子水在室溫下溶解混勻呈均一態(tài)，以每0.5 mL分裝于小型離心管中，-20 ℃保存；室溫復(fù)溶且復(fù)溶1次；開(kāi)啟瓶塞時(shí)應(yīng)嚴(yán)格避免凍干粉的丟失[8]。

1.3.2測(cè)定模式的設(shè)計(jì) 按照讀點(diǎn)時(shí)間周期及混勻時(shí)間的不同將AST共設(shè)計(jì)為A～I(xiàn)共9種不同的測(cè)定模式。模式A：讀點(diǎn)時(shí)間周期15 s，混勻時(shí)間30 s；模式B：讀點(diǎn)時(shí)間周期15 s，混勻時(shí)間45 s；模式C：讀點(diǎn)時(shí)間周期15 s，混勻時(shí)間60 s；模式D：讀點(diǎn)時(shí)間周期30 s，混勻時(shí)間30 s；模式E：讀點(diǎn)時(shí)間周期30 s，混勻時(shí)間45 s；模式F：讀點(diǎn)時(shí)間周期30 s，混勻時(shí)間60 s；模式G：讀點(diǎn)時(shí)間周期18 s，混勻時(shí)間30 s；模式H：讀點(diǎn)時(shí)間周期18 s，混勻時(shí)間45 s；模式I：讀點(diǎn)時(shí)間周期18 s，混勻時(shí)間60 s。

1.3.3樣本檢測(cè)方法 依照IFCC參考測(cè)量程序建立AST改良參考方法，為不加磷酸吡哆醛方法，依照上述測(cè)定模式對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)，每天對(duì)每種模式重復(fù)測(cè)定2次，間隔時(shí)間大于2 h，連續(xù)測(cè)定20 d[9]。樣本在規(guī)定的反應(yīng)條件下進(jìn)行測(cè)定：溫度(37.0±0.1)℃；波長(zhǎng)340 nm；頻帶寬度≤2 nm；光路10.00 mm；孵育時(shí)間360 s；延遲時(shí)間90 s；檢測(cè)時(shí)間180 s。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 匯總不同測(cè)定模式的全部數(shù)據(jù)，利用Excel軟件計(jì)算在每種測(cè)定模式下的AST測(cè)定結(jié)果及總不精密度(CV總)并進(jìn)行比較，判斷測(cè)量結(jié)果精密度是否符合參考方法精密度要求[10]。

2 結(jié) 果

圖1 AST 動(dòng)力學(xué)反應(yīng)曲線

表1 不同測(cè)定模式下AST測(cè)量結(jié)果及其精密度

2.2不同條件下的AST測(cè)量結(jié)果及其精密度 結(jié)果發(fā)現(xiàn)：測(cè)定模式B即讀點(diǎn)時(shí)間周期為15 s、混勻時(shí)間為45 s的測(cè)定模式的AST測(cè)量總不精密度最小，且小于1%，符合參考方法精密度要求；讀數(shù)時(shí)間周期相同時(shí)，延遲期混勻時(shí)間為45 s的測(cè)定模式下測(cè)量總不精密度最??；延遲期混勻時(shí)間相同時(shí)，讀數(shù)時(shí)間周期為15 s的測(cè)定模式下測(cè)量總不精密度最小。見(jiàn)表1～3。

表2 不同讀點(diǎn)時(shí)間周期的測(cè)定模式下AST測(cè)量結(jié)果及其精密度

表3 不同混勻時(shí)間的測(cè)定模式下AST測(cè)量結(jié)果及其精密度

注：偏倚指測(cè)定結(jié)果均值與質(zhì)控品所示目標(biāo)值的偏倚。

3 討 論

臨床生化檢驗(yàn)為臨床實(shí)驗(yàn)室工作的重要內(nèi)容，其中臨床酶學(xué)檢驗(yàn)又為臨床生化檢驗(yàn)的重要組成部分。精密度是檢驗(yàn)系統(tǒng)重要的分析指標(biāo)，是檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確度的前提[11-12]，臨床醫(yī)師看重的是同一份標(biāo)本在不同檢測(cè)時(shí)間段的重復(fù)性，如果同一份標(biāo)本在不同檢測(cè)時(shí)間段的檢測(cè)結(jié)果差異很大，臨床醫(yī)生及患者就會(huì)不相信實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)結(jié)果[13]，從而影響臨床決策、患者安全及檢驗(yàn)科自身的發(fā)展。因此，提高檢測(cè)結(jié)果的精密度，保證分析性能滿足臨床檢測(cè)要求是檢驗(yàn)室日常工作的重要一部分。

本實(shí)驗(yàn)從AST的讀點(diǎn)時(shí)間周期及延遲期的混勻時(shí)間著手，探討不同測(cè)定模式對(duì)AST測(cè)量結(jié)果精密度的影響。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，在讀點(diǎn)時(shí)間周期為15 s、延遲期混勻時(shí)間為45 s的測(cè)定模式B下，AST的測(cè)量結(jié)果不精密度最小，為0.69%，小于參考方法設(shè)定目標(biāo)值。按照讀點(diǎn)時(shí)間周期的不同將9種測(cè)定模式分為3組可以發(fā)現(xiàn)，每組中即讀點(diǎn)時(shí)間周期相同的情況下，不精密度最小的為混勻時(shí)間為45 s的混勻模式，而混勻時(shí)間為30 s和60 s時(shí)精密度不好可能是因?yàn)榛靹驎r(shí)間過(guò)短和混勻時(shí)間過(guò)長(zhǎng)?；靹驎r(shí)間過(guò)短會(huì)造成反應(yīng)體系混勻不充分，而混勻時(shí)間過(guò)長(zhǎng)影響精密度可能有兩方面原因：(1)檢測(cè)時(shí)間段一致的情況下，混勻時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則反應(yīng)體系靜止時(shí)間縮短，即在反應(yīng)體系還未穩(wěn)定時(shí)即開(kāi)始進(jìn)行比色測(cè)定，直接影響測(cè)定結(jié)果的穩(wěn)定性[5]；(2)半自動(dòng)生化分析儀加R2試劑時(shí)需開(kāi)蓋，這樣室溫就會(huì)影響比色杯內(nèi)反應(yīng)體系的溫度[14]，且混勻時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)反應(yīng)體系的影響就越大。按照延遲期混勻時(shí)間的不同將9種測(cè)定模式繼續(xù)分為3組可以看出，每組中即在延遲期混勻時(shí)間相同的情況下，讀數(shù)時(shí)間周期為15s的測(cè)定模式下AST測(cè)定不精密度最小，可能原因?yàn)樽x數(shù)時(shí)間周期越短，相同檢測(cè)時(shí)間段內(nèi)所讀取的點(diǎn)越多，采用線性回歸計(jì)算單位時(shí)間內(nèi)吸光度變化所得值就越接近。另外，參考方法為純手工操作，因此酶學(xué)測(cè)定結(jié)果還會(huì)受實(shí)驗(yàn)室環(huán)境、操作人員等的不同的影響[15-16]，不同實(shí)驗(yàn)室的酶學(xué)最佳測(cè)定模式也可能有所不同。

從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，測(cè)定模式的差異對(duì)AST測(cè)量結(jié)果精密度有明顯的影響，不同酶學(xué)指標(biāo)的精密度最好的測(cè)定模式可能不同。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)探索適合自己的酶學(xué)測(cè)定模式，對(duì)每個(gè)酶學(xué)指標(biāo)的測(cè)定模式進(jìn)行具體探討，完善參考測(cè)定程序中的測(cè)定條件，提高酶學(xué)測(cè)量結(jié)果的精密度。