納米細(xì)菌在骨關(guān)節(jié)疾病中的研究進(jìn)展

彭偉秋，張祥洪

(廣西科技大學(xué)附屬柳州市人民醫(yī)院關(guān)節(jié)骨病科，廣西 柳州 545006)

納米細(xì)菌(nanobacteria NB)是時(shí)20世紀(jì)80年代Kajander等發(fā)現(xiàn)并命名以來，在生命科學(xué)領(lǐng)域引起了科學(xué)家們廣泛的研究熱情，是近30年來飽受關(guān)注和爭(zhēng)議的研究課題[1]。研究者對(duì)NB的關(guān)注主要有三個(gè)方面：其一認(rèn)為NB分布廣泛，可感染任何生物組織和細(xì)胞，具有較大的毒性。NB可能是地球上最小的細(xì)胞形式，也可能是地球和地外細(xì)胞生命起源的細(xì)胞前體[2]。其二認(rèn)為NB與人類病理性鈣化類疾病和結(jié)石類疾病密切相關(guān),生物體內(nèi)的結(jié)石和病理鈣化性組織內(nèi)都可以檢測(cè)出NB的存在，NB可能是引起這些疾病的病原體[3]。其三是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中利用NB已經(jīng)成功研制出膽囊結(jié)石和腎結(jié)石的動(dòng)物模型，并用這些動(dòng)物模型開始結(jié)石類疾病的形成機(jī)制和治療方法探討[4-5]。對(duì)NB爭(zhēng)議的焦點(diǎn)是截然不同的兩個(gè)方面：支持者認(rèn)為NB是一種新型的微生物，屬革蘭陰性菌,呈球狀或球桿狀,體積極小，基因序列分析表明NB含16SrRNA序列[6]。Martel等反對(duì)者卻認(rèn)為NB不是一種新型的微生物，現(xiàn)有生物體的所必須的大分子蛋白和DNA的體積最小直徑必須至少在200納米以上，NB體積太小不可能容納這些大分子物質(zhì)，多聚酶鏈反應(yīng)檢測(cè)沒有發(fā)現(xiàn)NB中有確定DNA或RNA[7-9]。

盡管關(guān)于NB是否是微生物的爭(zhēng)議還在繼續(xù)，但是NB與人類結(jié)石類疾病和病理性鈣化類疾病的相關(guān)性探索研究一直是研究熱點(diǎn)。骨是人體內(nèi)主要鈣化組織，近年來的一些研究發(fā)現(xiàn)表明，NB可能與人的骨質(zhì)疏松癥、骨性關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等骨科疾病發(fā)生有關(guān)，NB與骨科疾病的一些相關(guān)性研究也引起大家的關(guān)注。本文擬從NB的特性以及NB在骨科疾病中的作用進(jìn)行綜述。

1 NB特性

1.1NB生物特性：Kajander等認(rèn)為NB是一種新發(fā)現(xiàn)的古老生物，屬革蘭陰性菌,呈球狀或球桿狀,細(xì)胞壁厚,無莢膜與鞭毛結(jié)構(gòu)[1]。NB體積極小,約50～500 nm,可通過直徑<0.1 μm的細(xì)菌濾膜,高分辨率的原子顯微鏡可檢測(cè)到NB菌體周圍有羥基磷灰石碳酸鹽結(jié)晶外殼。NB耐高溫和強(qiáng)酸，普通的微生物培養(yǎng)和檢測(cè)不適用于NB,必須用細(xì)胞培養(yǎng)方式和特殊檢測(cè)方法。NB生長(zhǎng)非常緩慢,每次分裂增殖周期約3～6 d。PCR基因序列分析認(rèn)為NB與α2亞群的布魯菌和巴爾通體菌屬具有相似的16SrRNA序列。

Martel等認(rèn)為NB雖然具有一些仿生物特性，但NB不是活的生物體，而是一種鈣化的納米顆粒(calcifying nanoparticles CNPs)[10]。Young等認(rèn)為CNPs是生物體內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的生理性殘留物和細(xì)胞培養(yǎng)的副產(chǎn)品[11-12]。CNPs主要由白蛋白、胎蛋白-A和載脂蛋白A1與鈣和其他離子的結(jié)合形成有機(jī)礦物復(fù)合物。免疫印跡實(shí)驗(yàn)顯示特定于NB的抗體與白蛋白、Fetuin-A都有反應(yīng)；在含有血清的細(xì)胞培養(yǎng)基中加入析出的鈣離子時(shí)可快速形成在形態(tài)學(xué)和化學(xué)上都與NB相同的礦化有機(jī)納米顆粒CNPs。生理狀態(tài)時(shí)，人體液內(nèi)的Fetuin-A和少量白蛋白是納米顆粒形成的抑制劑。病理?xiàng)l件下，F(xiàn)etuin-A和白蛋白的抑制納米顆粒形成由于各種原因減弱時(shí)，不但不能抑制納米顆粒形成，還與鈣或磷灰石結(jié)晶以某種方式結(jié)合，在體液中形成所謂的NB。這些CNPs可以在含血清的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)、增多，類似單細(xì)胞生物的生長(zhǎng)，分裂和傳代培養(yǎng)。

1.2NB的致病性：Hjelle等認(rèn)為NB可感染任何生物體的組織細(xì)胞，具有細(xì)胞毒性[13]。人體感染NB后不能將NB徹底清除，普通的試驗(yàn)方法不能檢測(cè)診斷，對(duì)細(xì)菌有效的常用抗生素對(duì)NB無效，臨床上常用的化學(xué)消毒措施也不能殺滅NB。NB在感染的細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)繁殖數(shù)目大于100個(gè)細(xì)菌時(shí)可引起細(xì)胞凋亡；NB的毒性分泌物為鈣化的脂多糖,它可以殺死T-6淋巴細(xì)胞，也可刺激感染組織和細(xì)胞發(fā)生炎性反應(yīng)因子反應(yīng),介導(dǎo)炎性反應(yīng)因子形成和分泌增加，最終引起被感染細(xì)胞死亡和組織病理性鈣化；NB周圍形成的鈣化生物膜,機(jī)體的免疫細(xì)胞不能識(shí)別,NB依靠自己鈣化外殼的保護(hù)可以在生物體內(nèi)長(zhǎng)期存在。

Wong等認(rèn)為NB不是致病微生物，而是鈣化的有機(jī)納米微粒CNPs，低濃度的CNPs在生理狀態(tài)下沒有毒性和致病性，高濃度的CNPs可以引起和加速細(xì)胞凋亡[14]。CNPs具有生物細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育和傳代繁殖的特性。生理狀態(tài)下，CNPs參與骨骼和牙齒發(fā)育，是骨組織和牙組織的生理性鈣化前體成份，CNPs還是腸道細(xì)菌和食物抗原的礦化免疫耐受機(jī)制形成的參與者。Shook等認(rèn)為病理狀態(tài)時(shí)，CNPs不但在異位鈣化和腎結(jié)石中可以檢測(cè)到，還在心血管疾病，慢性腎病和特發(fā)性早產(chǎn)兒也發(fā)現(xiàn)有CNPs參與相關(guān)[15]。NB的這一特性可為我們防治病理性鈣化提供新方法。

1.3NB的分離、培養(yǎng)與檢測(cè)：NB的分離常用濾膜濾菌法。該法取含NB標(biāo)本溶液用0.22 μm濾膜反復(fù)過濾離心后取濾液培養(yǎng)。NB培養(yǎng)時(shí)需要使用胎牛血清,培養(yǎng)需在溫度為37℃,含5%～10%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行。NB的檢測(cè)有電鏡下觀察法，免疫熒光檢測(cè)法和免疫抗體檢測(cè)法。Smith 等認(rèn)為PCR檢測(cè)NB結(jié)果的準(zhǔn)確性不高[16]。

Wu等通過對(duì)人和動(dòng)物的血液、唾液、尿液和關(guān)節(jié)液等體液中發(fā)現(xiàn)NB存在[17]。Ansari等在人腎結(jié)石、膽囊結(jié)石和口腔結(jié)石等結(jié)石中檢測(cè)到NB[18]。Richards等在心瓣膜、血管和胎盤等多種病理性的鈣化組織中發(fā)現(xiàn)NB的存在[19]。

2 NB與骨科疾病

2.1NB與骨質(zhì)疏松：Sommer等研究艾滋病患者骨密度(Bone Minal Density BMD)的減少和腎結(jié)石的形成趨勢(shì)的相關(guān)性發(fā)現(xiàn),NB可以導(dǎo)致BMD減少，其可能的原因是NB需要從血液中攝取鈣和磷酸鹽，影響人體內(nèi)的鈣和磷酸鹽的穩(wěn)態(tài)，進(jìn)一步可能影響B(tài)MD而發(fā)生骨質(zhì)疏松癥[20]。

張名均等研究發(fā)現(xiàn)NB對(duì)人成骨細(xì)胞C3H10具有細(xì)胞毒性作用，主要機(jī)制是通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)揮細(xì)胞毒作用。同時(shí)NB能促進(jìn)鈣化相關(guān)蛋白BMP-2的表達(dá)，也能引起凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達(dá)升高，研究中羥基磷灰石對(duì)人成骨細(xì)胞C3H10無細(xì)胞毒性作用，羥基磷灰石雖然也能促進(jìn)鈣化相關(guān)蛋白BMP-2的表達(dá)，但不能促進(jìn)凋亡相關(guān)蛋白Bax分泌[21]。研究證實(shí)NB具有羥基磷灰石完全不一樣的特性。

郭亞楠等從鈣化的胎盤中分離和培養(yǎng)出NB，認(rèn)為NB可感染母親的胎盤和胎兒[22]。NB感染胎盤可引起胎盤細(xì)胞結(jié)節(jié)和小葉纖維索性壞死，導(dǎo)致胎盤鈣化。胎盤鈣化和壞死可導(dǎo)致胎兒營(yíng)養(yǎng)障礙和發(fā)育異常。NB感染胎兒可導(dǎo)致維生素D和鈣磷離子代謝紊亂，認(rèn)為NB可能與先天性佝僂病發(fā)病有關(guān)。

2.2NB與骨關(guān)節(jié)炎：骨關(guān)節(jié)炎是骨科常見的退行性疾病，發(fā)病的因素很多，具體機(jī)制不詳。Tsuramoto等在膝骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)液中檢測(cè)到NB，證實(shí)骨關(guān)節(jié)炎患者存在NB，作者推測(cè)NB與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病可能有關(guān)[23]。彭偉秋等發(fā)現(xiàn)膝骨關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)液中NB檢測(cè)陽性率100%，而正常膝關(guān)節(jié)的NB檢測(cè)陽性率僅為4.5%，認(rèn)為二者關(guān)系密切[24]。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NB可以損傷軟骨細(xì)胞，NB損傷軟骨細(xì)胞時(shí),沒有氧自由基的參與，但有一氧化氮參與，一氧化氮介導(dǎo)的細(xì)胞損傷可能是軟骨細(xì)胞壞死的機(jī)制。納米細(xì)菌可能與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病有關(guān),但尚須進(jìn)一步加以證實(shí)。

Tsurumoto等研制出一種生物傳感器用來檢測(cè)NB，發(fā)現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎患者的滑膜液中NB陽性檢測(cè)率100%，證實(shí)NB在骨關(guān)節(jié)患者的關(guān)節(jié)液中普遍存在。但NB是否是骨關(guān)節(jié)炎的病因作者并沒有進(jìn)一步研究證實(shí)[25]。

Agarwal等運(yùn)用NB仿生物特性制備攜帶白細(xì)胞介素受體拮抗劑的有機(jī)納米微粒治療骨關(guān)節(jié)炎研究中，發(fā)現(xiàn)這些新型的自組裝納米微粒在血清溶液中具有很好的細(xì)胞相容性和穩(wěn)定性，可有效避免白細(xì)胞介素受體拮抗劑被人體在短時(shí)間內(nèi)清除，局部高濃度的白細(xì)胞介素受體拮抗劑可增強(qiáng)抗炎強(qiáng)度和作用時(shí)間[26]。將攜帶白細(xì)胞介素受體拮抗劑的有機(jī)納米微粒注射到骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)腔內(nèi)，關(guān)節(jié)間隙局部高濃度白細(xì)胞介素受體拮抗劑可阻止IL-1信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞介導(dǎo)的炎性反應(yīng)，從而控制和減輕骨關(guān)節(jié)炎病情，幫助軟骨組織的再生和修復(fù)。

2.3NB與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎：石慶新等在探討類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者和正常人群血清標(biāo)本中NB分布情況時(shí)，對(duì)正常人群和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的血清進(jìn)行NB培養(yǎng)，用鈣染色技術(shù)對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行NB檢測(cè)，采用間接免疫熒光法進(jìn)行納米細(xì)菌鑒定。結(jié)果30例正常人血清NB的陽性檢出率分別為6.7%，30例類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清NB的陽性檢出率為30.0%，提示類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病和NB感染可能有關(guān)[27]。

石慶新等用PCR技術(shù)對(duì)正常人群和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)液標(biāo)本進(jìn)行NB檢測(cè),發(fā)現(xiàn)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)液中存在NB,認(rèn)為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者發(fā)病與NB感染關(guān)系密切。PCR法可以用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者NB感染快速檢[28]。

Tsuramoto等也報(bào)道在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)液中培養(yǎng)和檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)NB存在，推測(cè)NB可能與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病有關(guān)[25]。

陳琳等認(rèn)為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者呈慢性發(fā)病。年齡越大,累及的中、大關(guān)節(jié)的越多;年紀(jì)越輕,關(guān)節(jié)滑膜血管增生越多、越明顯[29]。NB與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)是不是受年齡有關(guān)需進(jìn)一步研究證實(shí)。

2.4NB與骨的礦化：脊柱動(dòng)物的骨和牙等礦化器官的形成機(jī)制仍是不解之謎。Olszt等在研究骨礦化形成時(shí)發(fā)現(xiàn)NB微粒存在，在骨形成早期,NB是大小不等的圓形礦化微粒，它們是散在依附在未骨化膠原纖維中的無定形礦化微粒，隨著骨發(fā)育，這些NB無定形礦化微粒增多融合成片，形成納米水晶礦物，增多的納米水晶礦物再融合成片形成類似平板的納米晶體，大量的納米晶體充填滿骨膠原纖維網(wǎng)時(shí)，骨的礦化就完成[30]。在骨形成過程中，NB的形成、增殖、融合、結(jié)晶和納米水晶平板的形成發(fā)生異常，骨的礦化可能發(fā)生異常而發(fā)生骨病。NB可能是生理性骨礦化形成時(shí)的有機(jī)礦化前體，在NB的濃度異?；蛘{(diào)節(jié)NB的因子異常時(shí)，才可能發(fā)生病理性鈣化。

Bongio等用富含鈣磷的NB微粒的膠原蛋白水凝膠為支架，將人臍內(nèi)皮細(xì)胞植入培養(yǎng)檢測(cè)支架的血管化變化，同時(shí)將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞前體一起培養(yǎng)檢測(cè)支架的成骨情形。研究發(fā)現(xiàn)臍內(nèi)皮細(xì)胞在支架上可形成一個(gè)巨大的微血管網(wǎng)絡(luò)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化附壁參與血管化。成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞前體的分化為成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞，二者分化速度受鈣磷的NB微粒濃度的影響，也受聯(lián)合培養(yǎng)的臍內(nèi)皮細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞前體共同調(diào)節(jié)。四種細(xì)胞在富含鈣磷的NB微粒的膠原蛋白水凝膠支架中成功的培育出血管化三維骨形成模型，為骨科疾病研究提供了新方法[31]。

2.5NB與異位骨化：疾病狀態(tài)時(shí)，NB可參與異位骨化、結(jié)石類疾病和病理性鈣化，NB與異位骨化相關(guān)的研究也引人關(guān)注。Orriss等認(rèn)為焦磷酸鹽可以抑制成骨細(xì)胞的異常骨化[32]。磷酸鹽-焦磷酸比微環(huán)境是骨礦化的基本調(diào)節(jié)因子，它通過影響成骨細(xì)胞分泌NPP因子影響骨化。組織非特異性堿性磷酸酶(TNAP)參與焦磷酸鹽分解，NPP和TNAP決定局部細(xì)胞外磷酸鹽和焦磷酸鹽水平。生理狀態(tài)下，NB是骨組織的生理性鈣化的前體成分。病理狀態(tài)時(shí)，NB參與異位骨化的形成，焦磷酸鹽作為影響生物礦化重要因子，有望成為抑制NB引起的異位骨化和病理性鈣化。

Wu等認(rèn)為Fetuin-A蛋白是調(diào)節(jié)生物礦化的重要子。在低濃度鈣和磷酸鹽液體中，F(xiàn)etuin-A蛋白和白蛋白也可形成納米樣顆粒，這些顆粒進(jìn)一步形成紡錘體、薄膜和聚合體復(fù)合物[33]。Fetuin-A蛋白作為礦化抑制劑比白蛋白強(qiáng)。礦物質(zhì)-蛋白質(zhì)濃度較高時(shí)，F(xiàn)etuin-A作為引物引導(dǎo)白蛋白形成NB樣復(fù)合物。在胎牛a蛋白的存在時(shí)形成的NB微粒更小，更傾向于多層環(huán)狀的形態(tài)。Fetuin-A蛋白和白蛋白形成的NB樣礦物顆粒在化學(xué)、光譜和形態(tài)學(xué)上與血清顆粒和NB相似。這些粒子可以從非晶態(tài)到晶體的轉(zhuǎn)變，蛋白質(zhì)與礦物質(zhì)的比例低的微粒更有利于轉(zhuǎn)化為晶體。Fetuin-A蛋白質(zhì)和其他抑制因子的存在，阻礙磷灰石核的穩(wěn)定形成，促使初生無定形細(xì)胞核或半晶球形納米粒子逐漸長(zhǎng)大，合并成晶體紡錘體和薄膜。這一特性為NB的異位骨化提供了新方法。

Pasch 等認(rèn)為異位鈣化患者血液中存在較高的異位鈣化病理因素[34]。由于鈣和磷酸鹽結(jié)合鈣化抑制蛋白Fetuin-A形成無定形含磷酸鈣的蛋白顆粒(CPPs)，無定形CPPs可自發(fā)轉(zhuǎn)化為含有結(jié)晶鈣的次生CPP磷酸，通過血清CPP-Fetuin-A法測(cè)定可沉積Fetuin-A的數(shù)量和T50法測(cè)定無定形CPPs轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)晶CPPs的時(shí)間可綜合評(píng)估異位鈣化風(fēng)險(xiǎn)，為改善全身性的鈣化傾向提供依據(jù)。

3 展望

NB發(fā)現(xiàn)至今，經(jīng)歷了生物與非生物和致病菌與非致病菌的廣泛爭(zhēng)議與科學(xué)研究。最新的研究認(rèn)為NB屬非生物的鈣化有機(jī)納米顆粒，具有仿生特性，在形態(tài)、生長(zhǎng)、增殖和傳代培養(yǎng)特性上有著類似于細(xì)菌的生物生命形式。盡管圍繞NB的爭(zhēng)議還在繼續(xù)，越來越多的研究表明，這樣一個(gè)以納米級(jí)存在,可以自我復(fù)制的礦化納米顆粒具有極其大的潛在意義，它獨(dú)特的生物礦化性質(zhì),為解釋多種疾病的發(fā)生、發(fā)展提供新的依據(jù),為我們治療疾病提供新的方案,甚至為利用生物礦化提供了材料。對(duì)研究骨組織以外組織鈣化性疾病、結(jié)石類疾病提供了納米級(jí)視野，也為納米生理學(xué)、納米毒理學(xué)和納米醫(yī)學(xué)的未來研究提供了新思路。