非酒精性脂肪性肝病飲食相關(guān)動(dòng)物模型研究進(jìn)展

薛麗君，肖琨珉，彭紅葉，周元琛，李鴻，姚樹(shù)坤*

1北京航空航天大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，北京 100191；2中日友好醫(yī)院消化內(nèi)科，北京 100029；3中日友好醫(yī)院臨床研究所，北京 100029

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指除外酒精和其他明確的損肝因素所致的、以彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪變性為主要特征的臨床病理綜合征，主要包括單純性脂肪性肝病及其演變的脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)、脂肪性肝纖維化和肝硬化。NAFLD與代謝綜合征之間關(guān)系密切，其中飲食模式是最基本最重要的因素。目前，NAFLD的發(fā)病機(jī)制尚未明確。基于NAFLD臨床特征的復(fù)雜性，為了更好地闡明其發(fā)病機(jī)制，尋找潛在的治療靶點(diǎn)，評(píng)估單獨(dú)或聯(lián)合用藥的治療潛力，亟須開(kāi)發(fā)有效、安全的臨床前體外和體內(nèi)模型?，F(xiàn)就NAFLD飲食相關(guān)動(dòng)物模型的研究進(jìn)展及建立新型NAFLD飲食相關(guān)模型的重要性綜述如下。

1 NAFLD概述

NAFLD是目前全球最常見(jiàn)的慢性肝病之一，其患病率和病死率呈逐年上升趨勢(shì)。國(guó)外流行病學(xué)調(diào)查顯示，成人NAFLD的患病率達(dá)20%～30%，2型糖尿病患者NAFLD患病率則高達(dá)42%～70%[1-3]，預(yù)估全球約2000萬(wàn)NAFLD患者最終死于NAFLD相關(guān)的肝病[4]。NAFLD的臨床特征復(fù)雜，環(huán)境與宿主易感基因之間的相互作用決定了其疾病表型，并影響其進(jìn)展。目前，NAFLD的發(fā)病機(jī)制由“二次打擊”理論發(fā)展為“多重打擊”理論，即在具有遺傳傾向的個(gè)體中，炎癥的發(fā)生往往先于脂肪變性，且多種因素共同誘導(dǎo)NAFLD，包括胰島素抵抗、脂肪組織分泌的激素、營(yíng)養(yǎng)因子、腸道微生物群釋放的內(nèi)毒素(脂多糖)、氧化應(yīng)激損傷，以及遺傳和表觀遺傳因子等，這些因素通過(guò)Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)作用于肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)NASH的進(jìn)展。研究者普遍認(rèn)為，腸道微生物群、氧化應(yīng)激和線粒體損傷在NASH的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用，肝-腸軸在肥胖及NAFLD的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。腸道微生物群與宿主免疫系統(tǒng)相互作用，調(diào)節(jié)腸道通透性，促進(jìn)炎癥發(fā)生和胰島素抵抗[5]。腸道通透性增加致使細(xì)菌和內(nèi)毒素移位，引起促炎分子脂多糖和具有肝毒性的細(xì)胞因子產(chǎn)生，這可能與胰島素抵抗和NASH的進(jìn)展有關(guān)[6]。脂多糖可與TLR4相互作用，誘導(dǎo)全身性慢性低度炎癥狀態(tài)，促進(jìn)胰島素抵抗、肥胖、糖尿病和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[7]。近年研究顯示，代謝性疾病的主要危險(xiǎn)因素為肥胖、胰島素抵抗、久坐的生活方式、不良飲食模式以及遺傳因素和腸屏障功能紊亂等[8-9]，其中飲食模式在代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展中起著極其重要的作用。因此，尋找符合人類(lèi)飲食模式的動(dòng)物模型對(duì)進(jìn)一步研究NAFLD具有重要意義。

2 NAFLD飲食相關(guān)動(dòng)物模型

NAFLD營(yíng)養(yǎng)動(dòng)物模型可分為兩類(lèi)[10]：第一類(lèi)是指肝臟中脂質(zhì)輸入或合成增加的模型，主要包括高脂飲食或包含膽固醇的高脂飲食模型、高果糖/蔗糖飲食模型，以及二者的復(fù)合飲食模型；第二類(lèi)指減少脂質(zhì)輸出或分解代謝的模型，主要包括蛋氨酸和膽堿缺乏(methionine and choline-deficiency diet，MCD)飲食模型、膽堿缺乏的L-氨基酸定義(choline-deflcient L-aminoacid-defined，CDAA)飲食模型。僅少數(shù)NAFLD患者表現(xiàn)出明顯的遺傳缺陷，表明NAFLD飲食模型與人類(lèi)疾病的相關(guān)性高于遺傳模型[11]。人類(lèi)肝損傷是由復(fù)合因素引起的，因此，可采用復(fù)合因素制備肝損傷動(dòng)物模型。目前的肝損傷動(dòng)物模型多是單因素或雙因素造模，即使存在復(fù)合因素，也與人類(lèi)肝損傷不完全相同，易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果與人類(lèi)不符，因此，亟須建立多因素復(fù)合刺激、符合人類(lèi)病因和疾病機(jī)制的肝損傷動(dòng)物模型。

2.1 高脂飲食或包含膽固醇的高脂飲食模型Lieber等[12]用液態(tài)高脂飲食(71%脂肪、11%碳水化合物、18%蛋白質(zhì))喂養(yǎng)雄性SD大鼠，3周后，大鼠肝小葉脂肪變性，表現(xiàn)出胰島素抵抗、炎性因子表達(dá)增加、氧化應(yīng)激水平升高以及早期纖維化等。另有研究發(fā)現(xiàn)，采用強(qiáng)飼法飼喂雄性SD大鼠高脂肪乳劑，6周后，大鼠表現(xiàn)出肥胖、胰島素抵抗、高脂血癥、肝脂肪變性及壞死、炎癥和線粒體損傷等[13]。Xu等[14]制備了一個(gè)簡(jiǎn)單實(shí)用、精確度較高的NASH大鼠模型，即飼喂大鼠高脂飲食(88%正常飼料、10%豬油、2%膽固醇)，第4周大鼠肝臟重量和肝重指數(shù)開(kāi)始增加，伴肝脂肪變性；第8周大鼠體重和附睪脂肪重量開(kāi)始增加，伴單純性脂肪肝；第12周大鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)水平開(kāi)始升高；第12～48周大鼠發(fā)生脂肪性肝炎。高脂飲食12周后，大鼠NASH開(kāi)始進(jìn)展，但其脂肪變性和炎癥程度較蛋氨酸和膽堿缺乏飲食大鼠輕[15]。

比較飼喂的脂肪類(lèi)型發(fā)現(xiàn)，6～8周后，標(biāo)準(zhǔn)高脂飲食小鼠體重增加較反式脂肪飲食小鼠明顯；8～16周后，反式脂肪飲食小鼠肝脂肪變性、ALT水平升高、胰島素敏感性降低均較標(biāo)準(zhǔn)高脂飲食小鼠明顯[16]。高脂飲食模型成功復(fù)制了人類(lèi)NASH的組織病理學(xué)特征和代謝綜合征表現(xiàn)：組織病理學(xué)顯示肝脂肪變性，小葉炎性浸潤(rùn)，肝細(xì)胞壞死和凋亡，肝細(xì)胞氣球樣變和腺泡3區(qū)纖維化；同時(shí)觀察到NAFLD代謝綜合征的其他特征，如中心性肥胖、胰島素抵抗、血脂異常、氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過(guò)氧化、血清ALT水平升高，以及脂聯(lián)素和PPAR-α表達(dá)降低[17-20]。綜上，高脂飲食模型肝臟炎癥和纖維化程度較輕，存在持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、強(qiáng)制過(guò)量喂養(yǎng)、與人類(lèi)飲食結(jié)構(gòu)不符等缺點(diǎn)。

2.2 高糖飲食模型 果糖是一種單糖，主要由肝臟代謝[21]，過(guò)量攝入果糖與NAFLD的發(fā)展及嚴(yán)重程度有關(guān)。果糖可加劇肝臟脂肪沉積，促進(jìn)炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致胰島素抵抗和纖維化[22]。有研究在Wistar大鼠飲食中添加含20%果糖的飲用水，8周后，大鼠出現(xiàn)肝臟單純脂肪變性，體重增加，血清三酰甘油、葡萄糖水平明顯升高，表現(xiàn)出代謝綜合征，如中心性肥胖、血脂異常、高血壓和高血糖等，但未表現(xiàn)出NASH的病理學(xué)特征[23]。

2.3 復(fù)合飲食模型 果糖和脂肪結(jié)合飲食誘導(dǎo)NAFLD晚期病變的效果較高糖飲食和高脂飲食好。在營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩飲食中添加果糖，可促進(jìn)NASH模型小鼠肝細(xì)胞氣球樣變、炎癥及肝纖維化的發(fā)生發(fā)展[9,24]。另有研究報(bào)道，AMLN飲食[40%脂肪(包含18%反式脂肪)、40%碳水化合物(包含20%果糖)、2%膽固醇]可誘導(dǎo)小鼠表現(xiàn)出NASH的典型特征[25-26]。

2.4 蛋氨酸和膽堿缺乏(MCD)飲食模型 蛋氨酸和膽堿這兩種必需營(yíng)養(yǎng)素的缺乏均可導(dǎo)致肝臟β-氧化受損和極低密度脂蛋白(very low-density lipoprotein，VLDL)生成受阻[27]。MCD飲食2周后，小鼠血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、ALT水平升高；8～10周，蛋氨酸缺乏導(dǎo)致小鼠肝臟炎癥和早期纖維化[28]。MCD飲食10周后，模型動(dòng)物體重明顯減輕(高達(dá)40%)。MCD飲食的優(yōu)點(diǎn)是可在較短的喂養(yǎng)時(shí)間內(nèi)復(fù)制NASH的組織學(xué)表型，可引起嚴(yán)重的炎癥、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和纖維化；缺點(diǎn)是未表現(xiàn)出人類(lèi)NAFLD的其他代謝特征，如肥胖、外周胰島素抵抗和血脂異常。綜上所述，MCD飲食不能模擬NALFD的所有特征。

2.5 膽堿缺乏的L-氨基酸定義(CDAA)飲食模型CDAA飲食的總體組成與MCD飲食相同，僅蛋白質(zhì)被相應(yīng)的L-氨基酸混合物替代。CDAA飲食可抑制肝細(xì)胞脂肪酸氧化，促進(jìn)脂質(zhì)合成、氧化應(yīng)激和炎癥，導(dǎo)致肝纖維化，其誘導(dǎo)的NASH較MCD飲食重。研究發(fā)現(xiàn)，CDAA飲食20～22周，小鼠發(fā)生NASH，其體重、血清三酰甘油和總膽固醇水平明顯升高，胰島素抵抗增加[29]。CDAA飲食模型動(dòng)物體重?zé)o明顯減輕，無(wú)代謝綜合征表現(xiàn)。

2.6 其他模型 致動(dòng)脈粥樣硬化飲食含高劑量的膽固醇(1%～1.25%)和膽酸(0.5%)。膽酸可促進(jìn)脂肪和膽固醇吸收，抑制膽固醇向膽汁酸轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致膽固醇含量增加，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展[30]。高膽固醇是高脂飲食誘導(dǎo)的NASH模型中肝臟炎癥進(jìn)展的重要危險(xiǎn)因素[31-32]。研究發(fā)現(xiàn)，飼喂加入10%豬油和2%膽固醇的致動(dòng)脈粥樣硬化飲食可誘導(dǎo)大鼠肝脂肪變性、壞死，肝細(xì)胞氣球樣變，小葉內(nèi)炎癥和纖維化，導(dǎo)致大鼠肥胖、血脂異常、胰島素抵抗和血清轉(zhuǎn)氨酶升高[33-34]。給予小鼠含1.25%膽固醇和0.5%膽酸的致動(dòng)脈粥樣硬化飲食，6周后出現(xiàn)肝細(xì)胞脂肪變性和小葉炎癥，血清ALT、總膽固醇、三酰甘油水平升高，24周后出現(xiàn)肝細(xì)胞氣球樣變和肝纖維化[35]。致動(dòng)脈粥樣硬化飲食可誘導(dǎo)肝臟氧化應(yīng)激、血脂異常、脂質(zhì)過(guò)氧化和星狀細(xì)胞活化，不會(huì)引起體重增加及明顯的胰島素抵抗，高脂肪成分可促進(jìn)NASH的病理學(xué)進(jìn)展。綜上，致動(dòng)脈粥樣硬化飲食能夠復(fù)制人類(lèi)NASH的病理學(xué)特征，但代謝變化不同于人類(lèi)NASH。

3 高溫加工食物在NAFLD中的致病作用

食物在高溫加工過(guò)程中可產(chǎn)生大量自由基，其中活性氧可與生物膜磷脂、多不飽和脂肪酸、核酸等大分子起過(guò)氧化反應(yīng)，引起脂質(zhì)過(guò)氧化，并通過(guò)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)放大活性氧的作用，導(dǎo)致線粒體膜損傷，膜流動(dòng)性下降，引起肝臟損害。高溫烹飪?nèi)绾婵尽⒈簾?、油煎和燒烤是晚期糖化的?qiáng)效啟動(dòng)子，高溫烹飪食物過(guò)程中可生成晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)，即在沒(méi)有酶參與的條件下，蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或核酸等大分子自發(fā)與葡萄糖或其他還原性單糖反應(yīng)生成穩(wěn)定的共價(jià)加成物。體內(nèi)AGEs主要有兩個(gè)來(lái)源：一是過(guò)量的糖與蛋白質(zhì)在體內(nèi)合成AGEs；二是攝入食物中的AGEs。AGEs與糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、阿爾茨海默病等疾病及人體衰老密切相關(guān)[36]。與健康人群和單純性脂肪變性患者相比，NASH患者AGEs含量增加，且與胰島素抵抗呈正相關(guān)，與脂聯(lián)素水平呈負(fù)相關(guān)，減少AGEs的攝入可減輕胰島素抵抗和氧化應(yīng)激，減輕血管內(nèi)皮功能障礙[37-38]。此外，AGEs的可溶性受體(soluble receptor for AGEs，sRAGE)可阻止胞外AGEs與細(xì)胞表面的RAGE結(jié)合，發(fā)揮保護(hù)作用[39]。哥本哈根大學(xué)的Mark等[40]研究發(fā)現(xiàn)，高AGE飲食可增加胰島素抵抗的發(fā)生，調(diào)整烹飪方法可減少AGEs的產(chǎn)生，攝入過(guò)量高溫加工處理的食物可導(dǎo)致AGEs暴露量增加。研究發(fā)現(xiàn)，食物中提取的AGEs能夠誘導(dǎo)體外氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[41]，提示食物中的AGEs是體內(nèi)的促氧化劑。氧化應(yīng)激及其他有害刺激可引起Jun N末端激酶(JNK)激活，導(dǎo)致胰島素受體底物(IRS)失活，JNK激活是NASH中胰島素抵抗、脂質(zhì)細(xì)胞凋亡和纖維化的影響因素[42-43]。在氧化應(yīng)激過(guò)程中，隨著活性氧(ROS)的過(guò)量產(chǎn)生，細(xì)胞抗氧化能力降低。核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)[44]，激活多種抗氧化反應(yīng)元素，包括NAD(P)H、醌氧化還原酶-1、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶和谷氨酸半胱氨酸連接酶[45]。NAFLD患者肝組織中的Nrf2可上調(diào)抗氧化酶的表達(dá)。Nrf2-/-蛋氨酸和膽堿缺乏飲食小鼠脂肪沉積、肝臟谷胱甘肽水平降低、脂質(zhì)過(guò)氧化增加均較野生型小鼠明顯[46]，脂肪性肝炎較野生型小鼠嚴(yán)重，且進(jìn)展迅速，表明Nrf2可能是治療NAFLD的潛在靶點(diǎn)[47]。目前，尚未發(fā)現(xiàn)高溫加工食物導(dǎo)致NAFLD的動(dòng)物模型，結(jié)合人們的日常飲食，研究高溫加工食物誘導(dǎo)NAFLD的動(dòng)物模型對(duì)闡明NAFLD的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。

4 展 望

飲食因素在代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展中起極其重要的作用，改變生活方式是管理NAFLD及其他慢性病的最重要選擇，60%的患者可通過(guò)干預(yù)生活方式逆轉(zhuǎn)NAFLD。人體是一個(gè)復(fù)雜開(kāi)放的自組織、自調(diào)節(jié)、自穩(wěn)定的生物系統(tǒng)，對(duì)環(huán)境充分開(kāi)放并不斷獲得物質(zhì)、信息，進(jìn)行能量交換，維持動(dòng)態(tài)穩(wěn)定。人體攝入的食物承載著能量和信息，直接或間接影響人體的代謝和功能，如西方膳食(即高脂肪、高蛋白、高鹽、低纖維膳食)、精制食品等可引起營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩和過(guò)氧化(自由基)損傷，導(dǎo)致慢性代謝性炎癥、糖尿病、高血壓、高脂血癥、高尿酸血癥、痛風(fēng)等疾病，若改變飲食結(jié)構(gòu)，則可減輕或逆轉(zhuǎn)上述共患疾病。目前NAFLD的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，開(kāi)發(fā)符合人類(lèi)飲食規(guī)律的新型模型對(duì)進(jìn)一步研究NAFLD的病因、發(fā)病機(jī)制、診斷和治療具有重要意義。