建立天舒片指紋圖譜分析方法

劉琴，梁瑩瑩，陳美玲

（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222047）

0 引言

指紋圖譜能較全面反映中藥制劑成分信息。有效保證中藥的安全性、有效性和穩(wěn)定性。天舒片原有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅從單一化學(xué)指標(biāo)的變化情況來(lái)控制制劑，并不能全面控制產(chǎn)品質(zhì)量。天麻、川芎為該藥的主要有效成分，所以為較全面的反映天舒片的內(nèi)在質(zhì)量，實(shí)現(xiàn)對(duì)該產(chǎn)品質(zhì)量的精確全面的控制。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料。高效液相色譜儀（Agilent 1200），用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱（柱長(zhǎng)為250 mm，柱內(nèi)徑為4.6 mm，粒徑為5μm），電子天平（Mettler 公司），數(shù)顯恒溫水浴鍋，水為自制超純水，甲醇為分析純和色譜純，磷酸為分析純。天舒片由江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司提供（批號(hào)分別為161001、161002、161003、161004、161005、161006、161101、161102、161103、161104）；天麻、川芎購(gòu)自河南省皖西制藥股份有限公司；阿魏酸對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110773-201614）。

1.2 方法與結(jié)果

1.2.1 色譜條件[1]：色譜柱：以C18為填充劑（柱長(zhǎng)為250 mm，柱內(nèi)徑為4.6 mm，粒徑為5μm），紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為276 nm。柱溫為30℃。流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為0.1%磷酸溶液，按下表中的方法進(jìn)行梯度洗脫；流速為1.0 mL/min。如表1。

表1 色譜條件

1.2.2 參照物溶液的制備：精密稱取阿魏酸對(duì)照品，用50%甲醇溶液溶解并制成每1 mL含20μg的溶液。

1.2.3 供試品溶液的制備：取本品研細(xì)，精密稱取約1g，精密加入50%甲醇25 mL，超聲處理（功率：250W，頻率40 kHz）30分鐘，取出，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得[2]。

1.2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

（1）精密度試驗(yàn)：取天舒片（批號(hào)為：161003），按1.2.3供試品溶液的制備方法制備，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，以阿魏酸峰為S峰，計(jì)算供試品中各共有峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值，結(jié)果小于0.9%，表明精密度良好。

（2）重復(fù)性試驗(yàn)：取天舒片（批號(hào)為：161003），按供試品溶液的制備方法制備6份供試品溶液，分別進(jìn)樣分析，計(jì)算供試品中各共有峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值，結(jié)果小于0.9%，表明該方法重復(fù)性良好。

（3）穩(wěn)定性試驗(yàn)：取天舒片供試品溶液，分別于0小時(shí)，2小時(shí)，4小時(shí)，8小時(shí)，12小時(shí)，24小時(shí)進(jìn)樣分析，以阿魏酸峰為S峰，計(jì)算各共有峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果小于1.5%，表明該溶液在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定，樣品溶液的穩(wěn)定性較好。

1.2.5 指紋圖譜的建立

（1）共有峰的確定：取天舒片樣品10批，分別按1.2.3項(xiàng)下制備供試品溶液，分別精密吸取10μl，注入液相色譜儀，記錄60分鐘色譜圖。采用相對(duì)保留時(shí)間標(biāo)定共有峰，以色譜圖中阿魏酸峰為S峰，將各色譜峰保留時(shí)間與同一圖譜中S峰的保留時(shí)間比較，其比值為各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間，計(jì)算10批樣品指紋圖譜中各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間。其中7個(gè)色譜峰為10批樣品所共有，故確定他們?yōu)楣灿蟹錥3-5]。

（2）指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)：采用最新《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)》軟件進(jìn)行相似度計(jì)算。設(shè)置批號(hào)161003的樣品圖譜為參照?qǐng)D譜，多點(diǎn)校正后自動(dòng)匹配，生成標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜見(jiàn)圖1。結(jié)果10批天舒片（161001、161002、161003、

161004、161005、161006、161101、161102、161103、161104）的相似度分別為0.973、0.979、0.970、0.989、0.996、0.979、0.990、0.992、0.953、0.978。表明建立的指紋圖譜的方法穩(wěn)定、重復(fù)性好。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜

2 討論

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定。取阿魏酸對(duì)照品在200-800 nm進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描。結(jié)果：在276 nm下有最大吸收。分別在271 nm、276 nm、281 nm下進(jìn)行分析。結(jié)論：在276 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行測(cè)定，得到的共有峰個(gè)數(shù)最多。最終選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為276 nm。

2.2 色譜柱考察。取Phenomenex和Kromasil兩種不同品牌的C18柱進(jìn)行色譜分離試驗(yàn)。結(jié)論：兩者色譜峰信息相同，分離效果相當(dāng)，但是Phenomenex色譜柱購(gòu)買(mǎi)困難，最終選擇了Kromasil色譜柱[6-8]。

3 結(jié)論

色譜條件的分析，根據(jù)指紋圖譜的建立標(biāo)準(zhǔn)對(duì)樣品進(jìn)行分析表明，60分鐘前，樣品的主要成分得到良好的分離。符合的相關(guān)要求。

本實(shí)驗(yàn)照《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求》采用HPLC法對(duì)天舒片中主要成分及色譜條件進(jìn)行研究，從相對(duì)保留時(shí)間可以看出，10批樣品色譜圖中各個(gè)色譜峰保留時(shí)間匹配較好，確定了7個(gè)共有峰。方法學(xué)驗(yàn)證表明其精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性均良好，證明所建立的指紋圖譜方法可行性高[9]。并采用指紋圖譜相似度軟件對(duì)天舒片指紋圖譜進(jìn)行了相似度計(jì)算，結(jié)果10批不同批次的天舒片的指紋圖譜均具有較高的相似度，表明各批次成分無(wú)明顯差異，為天舒片的質(zhì)量評(píng)價(jià)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高提供了重要依據(jù)。