HTK液3種不同灌注方法對(duì)兔心臟保存移植后心肌組織ICAM和IL-17表達(dá)的影響

韋雪梅，郭義龍，徐志新

供體心臟通常需要經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的保存才能進(jìn)行移植，此時(shí)離體心臟的保存技術(shù)可能對(duì)受體心臟發(fā)生缺血再灌注損傷和急性排斥反應(yīng)產(chǎn)生重要影響[1]。再灌注損傷和急性排斥反應(yīng)也是導(dǎo)致心臟移植失敗、受體心臟復(fù)跳欠佳和失能的主要機(jī)制[2-3]。低溫和HTK停搏保護(hù)液是目前應(yīng)用最成熟的離體心臟保存技術(shù)，可顯著降低心肌能耗，保護(hù)心肌功能[4]。其中HTK液?jiǎn)渭兊蜏亟輵?yīng)用最廣泛，簡(jiǎn)單、安全，缺點(diǎn)是不能及時(shí)清除停搏期間心肌組織代謝產(chǎn)物和氧自由基，補(bǔ)充心肌代謝需要，導(dǎo)致鈣超載、細(xì)胞水腫、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、免疫損傷等[5]。研究發(fā)現(xiàn)[6-7]，持續(xù)灌注或間斷2 h灌注可明顯改善復(fù)跳效果，降低心律失常和心肌損傷風(fēng)險(xiǎn)，提高受體心臟存活率。細(xì)胞間黏附分子(intercellular adhesion molecule, ICAM)-1和白細(xì)胞介素(interleukin, IL)-17的表達(dá)在同種異體心臟移植早期再灌注損傷和急性排斥反應(yīng)過(guò)程中表達(dá)明顯上調(diào)，可能參與受體心臟存活和功能恢復(fù)過(guò)程[8-9]。既往關(guān)于HTK液不同灌注方式對(duì)移植心臟受體心肌免疫損傷和炎癥反應(yīng)的研究較少，因此，該研究通過(guò)比較HTK液3種不同灌注方法對(duì)同種異體兔心保存移植后心肌組織ICAM-1和IL-17表達(dá)的影響，探討HTK液灌注方式對(duì)心臟移植后急性排斥反應(yīng)的影響機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 18對(duì)36只2個(gè)月大小雌雄不限的健康新西蘭兔購(gòu)于長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，供受體配對(duì)，平均體質(zhì)量(2.15±0.33)kg，合格證號(hào)43006700016096數(shù)量10只，合格證號(hào)43006700016142數(shù)量10只，合格證號(hào)43006700016249數(shù)量16只。由我院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心購(gòu)買(mǎi)和飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境：通風(fēng)透氣，除添水、添料、清掃衛(wèi)生和觀察健康的時(shí)間外，兔舍內(nèi)均保持黑暗。兔舍溫度保持25 ℃左右，濕度55%～65%。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 HTK灌注液和KH緩沖液(德國(guó)科勒化學(xué)制藥公司)，TRIzol提取試劑和反轉(zhuǎn)錄試劑(美國(guó)Sigma公司)，HE染色試劑和ECL顯色液(南京碧云天有限公司)，BCA蛋白提取試劑(美國(guó)Invitrogen 公司)，鼠抗兔ICAM-1、IL-17和GAPDH一抗和二抗(美國(guó)R&D公司)，TUNEL試劑(美國(guó)Santa Cruz公司)。顯微外科手術(shù)器械(上海醫(yī)用器械廠)，離體心臟灌流系統(tǒng)(上海奧爾科特生物公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法18對(duì)實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)抓取分為3組，分別是單純低溫浸泡組(單純組)5對(duì)、持續(xù)灌注組(持續(xù)組)5對(duì)和間斷2 h灌注組(間斷組)8對(duì)。腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，氣管插管人工呼吸，靜脈肝素化，開(kāi)胸阻斷主動(dòng)脈，灌注HTK保護(hù)液，剪斷上下腔靜脈及肺動(dòng)脈充分引流，離體取出心臟，經(jīng)主動(dòng)脈根部灌注HTK停跳液保護(hù)心臟，懸掛于Langendorff灌注模型上。首先對(duì)離體心臟進(jìn)行平衡灌注，采用KH緩沖液(37 ℃、pH 7.4)經(jīng)95% O2+5% CO2預(yù)處理，灌注壓力為7.35 kPa，5～10 min后心臟搏動(dòng)處于穩(wěn)定狀態(tài)，然后進(jìn)行停跳灌注。單純組灌注HTK保護(hù)液(4 ℃、5～6 ml)后靜置保存，間斷組間隔2 h灌注HTK保護(hù)液(30 ml/kg)，持續(xù)組采用微量泵，灌注速度0.025 ml/(g·h)；處理完成后于4 ℃保存8 h。建立移植心臟模型參照改良Ono術(shù)式[10]，即分別將供心升主動(dòng)脈與受體腹主動(dòng)脈端端吻合，供心肺動(dòng)脈與受體下腔靜脈吻合，建立在體動(dòng)靜脈循環(huán)。

對(duì)心臟移植供、受體進(jìn)行血型、HLA抗原、淋巴細(xì)胞毒及群體反應(yīng)性抗體等檢測(cè)，采用氨基酸三聯(lián)體及交叉反應(yīng)方法對(duì)供、受者匹配程度進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.3 觀察指標(biāo)與檢測(cè)方法根據(jù)改良Ono術(shù)式完成心臟移植模型，取出供體心臟。常規(guī)制作心肌切片，厚度5 μm，石蠟包埋，用于HE染色觀察組織和細(xì)胞的病理改變；分別采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR和蛋白印跡法檢測(cè)組織ICAM-1和IL-17水平，TUNEL試劑檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡主要步驟：石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化、H2O2封閉抗體、蛋白酶消化、緩沖液保濕等處理后；根據(jù)說(shuō)明書(shū)提示，首先取出Td T和DIG-d-UTP各1 μl，與緩沖液混勻，濕盒內(nèi)37 ℃反應(yīng)2 h；洗滌后滴加生物素-抗地高辛抗體反應(yīng)30 min，洗滌后滴加SABC反應(yīng)30 min，DAB顯色。凋亡細(xì)胞的判斷以胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性，凋亡率計(jì)算方法：每例標(biāo)本隨機(jī)挑選5張切片，每張切片隨機(jī)挑選4個(gè)高倍鏡視野(400×)人工計(jì)數(shù)，凋亡細(xì)胞占所有視野下細(xì)胞百分比即凋亡率，取平均值。

RT-PCR法主要步驟：根據(jù)試劑操作提示提取總RNA，測(cè)定濃度和純度，合成cDNA；由專(zhuān)業(yè)生物公司設(shè)計(jì)目的引物序列，ICAM-1:(F)5′-GGAATTGGAGGAGAGCA-3′,(R)5′-ACAGATCCTCAATCTT-3′,123 bp;IL-17:(F)5′-AACGGCTCTTGGCT-3′,(R)5′-GTTAAGGCAGACCGCA-3′,252 bp;GAPDH:(F):5′-CGAGCCGATGACAG-3′,(R):5′-GCTGTGCGCGTAT-3′, 69 bp。PCR擴(kuò)增體系為Master Mix 10 μl+上下游引物各0.5 μl+cDNA模板1 μl，加反應(yīng)水至20 μl。擴(kuò)增條件為95 ℃、5 min，(95 ℃、25 s、60 ℃、30 s)共30個(gè)循環(huán)，60 ℃、40 s終止反應(yīng)，電泳擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得融解曲線(xiàn)，系統(tǒng)軟件自動(dòng)計(jì)算Ct值，結(jié)果以2-△△Ct法表示。

Western blot主要步驟：加入細(xì)胞裂解液，提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，參照蛋白GAPDH作標(biāo)準(zhǔn)化處理；各組分別取30 μg樣品蛋白，經(jīng)8% SDS-PAGE上樣加熱，分離電泳并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，搖床室溫封閉；洗滌后滴加鼠抗兔ICAM-1、IL-17和GAPDH抗體(1 ∶2 000)靜置過(guò)夜，洗滌后滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠二抗(1 ∶500)室溫孵育4 h，ECL顯色，結(jié)果行半定量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理以SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)計(jì)量資料作單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法檢驗(yàn)，3組間比較采用F檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組HE染色結(jié)果比較HE染色發(fā)現(xiàn)，3組大部分心肌組織結(jié)構(gòu)完整，伴細(xì)胞水腫、黏液樣變性或壞死、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、脂肪化生及小血管生成。見(jiàn)圖1。半定量分析發(fā)現(xiàn)，間斷組細(xì)胞水腫、炎性細(xì)胞和小血管數(shù)目明顯少于持續(xù)組，單純組最多(P<0.05)。見(jiàn)表1。

圖1 HE染色觀察各組心肌組織的病理改變 ×200

表1 HE染色半定量分析各組心肌組織的

與單純組比較:aP<0.05；與持續(xù)組比較:bP<0.05

2.2 各組心肌組織ICAM-1和IL-17 mRNAs和蛋白表達(dá)水平的比較間斷組ICAM-1和IL-17 mRNAs和蛋白表達(dá)水平顯著低于持續(xù)組，單純組最高(P<0.05)。見(jiàn)表2、圖2。

表2 各組心肌組織ICAM-1和IL-17 mRNAs和

與單純組比較:aP<0.05；與持續(xù)組比較:bP<0.05

2.3 各組心肌細(xì)胞凋亡率的比較間斷組細(xì)胞凋亡率低于持續(xù)組，單純組最高(P<0.05)。見(jiàn)圖3、4。

3 討論

臨床和實(shí)驗(yàn)中需要挑選最佳的心臟停搏保護(hù)液，其中HTK液?jiǎn)未蔚蜏毓嘧⒖蓪?shí)現(xiàn)較低的心臟基礎(chǔ)代謝，提供必要的心肌代謝底物和氧氣，不增加心肌損傷和心臟移植后的功能障礙，而且易制備、操作簡(jiǎn)單、安全性高。良好的供體心臟保存技術(shù)是移植心臟得以存活的重要環(huán)節(jié)。HTK液灌注不僅持續(xù)提供停搏期間心肌代謝需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，同時(shí)可及時(shí)清除代謝產(chǎn)物，減輕酸堿失衡、細(xì)胞水腫、氧化功能障礙、炎癥反應(yīng)等損傷[10]。該研究提出HTK液不同灌注方式可能對(duì)受體移植心臟的再灌注損傷和急性排斥反應(yīng)可能產(chǎn)生不同的影響，進(jìn)而影響心臟復(fù)跳后的功能恢復(fù)。

圖2 Western blot法半定量比較各組心肌組織ICAM-1和IL-17蛋白表達(dá)水平 ×200

本研究顯示，3組大部分心肌組織結(jié)構(gòu)完整，伴細(xì)胞水腫、黏液樣變性或壞死，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、脂肪化生及小血管生成。提示停跳期間心肌細(xì)胞保持低水平的能量代謝，離體對(duì)心肌細(xì)胞產(chǎn)生一定的影響，如無(wú)氧糖酵解、細(xì)胞腫脹、鈣超載、氧自由基產(chǎn)生過(guò)多、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、新生血管等。半定量分析表明，間斷組細(xì)胞水腫、炎性細(xì)胞和小血管數(shù)目明顯少于持續(xù)組，單純組最多。提示間斷灌注對(duì)心肌損傷程度較輕。進(jìn)一步研究顯示，間斷組ICAM-1和IL-17 mRNAs和蛋白表達(dá)水平顯著低于持續(xù)組，單純組最高。急性排斥反應(yīng)是移植心臟較常見(jiàn)的并發(fā)癥，也是受體心臟復(fù)跳失敗和失能以及慢性排斥反應(yīng)的重要原因。ICAM-1主要識(shí)別白細(xì)胞表面的特定結(jié)構(gòu)，具有高度特異性，進(jìn)而趨化白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞聚集，發(fā)揮殺傷外源性分子，介導(dǎo)細(xì)胞間黏附功能，在免疫反應(yīng)、腫瘤轉(zhuǎn)移等多種生物行為中扮演重要角色[11]。在移植物免疫排斥反應(yīng)中，受體器官可高表達(dá)ICAM-1，與排斥反應(yīng)時(shí)間相一致，其升高水平與細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的功能活化程度密切相關(guān)[12]。此外，ICAM-1可協(xié)同抗原呈遞細(xì)胞共同識(shí)別異源性分子，激活細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)。具體反應(yīng)過(guò)程是在免疫識(shí)別階段，ICAM-1強(qiáng)化輔助性T細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞的黏附、聚集活性，趨化有活性T細(xì)胞向移植物內(nèi)皮細(xì)胞黏附，增加內(nèi)皮細(xì)胞損傷，增加血管壁通透性，釋放多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，如IL-17、TNF-α[13]；免疫效應(yīng)階段主要強(qiáng)化毒性T細(xì)胞與移植物細(xì)胞黏附和殺傷作用，導(dǎo)致移植物細(xì)胞功能障礙，凋亡增加。IL-17主要由輔助性T淋巴細(xì)胞分泌，在抗原呈遞、介導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞和NK細(xì)胞殺傷病原體和異源性細(xì)胞、激活B淋巴細(xì)胞中發(fā)揮重要作用[14]。間斷組細(xì)胞凋亡率低于持續(xù)組，單純組最高。細(xì)胞凋亡是再灌注損傷、急性排斥反應(yīng)、供體復(fù)跳失敗的重要機(jī)制，也是供體心臟功能恢復(fù)不佳的重要原因。

圖3 TUNEL比色法檢測(cè)心肌凋亡 ×400

圖4 TUNEL法檢測(cè)各組心肌細(xì)胞凋亡率

與單純組比較：#P<0.05；與連續(xù)組比較：*P<0.05

綜上所述，HTK液不同灌注方法對(duì)同種異體兔心移植后的急性排斥反應(yīng)影響不同，以間斷2 h灌注可明顯降低受體心肌ICAM-1和IL-17表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡效應(yīng)最明顯。移植心臟后功能是否能夠恢復(fù)至移植前的影響因素和參與機(jī)制較多，如何探尋特異性的干預(yù)靶點(diǎn)，對(duì)提高供體保存技術(shù)和受體移植物存貨質(zhì)量具有十分重要的意義。