白藜蘆醇通過調控Keap1-Nrf2/HO-1信號通路抑制大鼠腎草酸鈣結石的形成

邸彥橙，王志龍，張智慧，宋 靜，高 強，吳 影，南錫浩，郭振海，田 河

腎結石是一種常見的泌尿系統(tǒng)疾病，多因晶體物質在腎臟中異常聚積所致，其中以草酸鈣晶體最為常見[1]。草酸在腎臟中的積累可誘導腎臟損傷，產生大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)，進一步損傷腎小管上皮細胞，促使草酸鈣晶體更易黏附于腎小管上皮細胞表面，對草酸鈣結石的形成具有促進作用[2-3]。而Kelch樣ECH相關蛋白1(Kelch-like ECH associated protein 1，Keap1)-核因子E2相關因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)/血紅素氧合酶 1(heme oxygenase 1，HO-1)是細胞內最為重要的一條內源性抗氧化應激途徑。大量研究[4-5]顯示，激活Keap1-Nrf2/HO-1信號通路可顯著降低機體內ROS水平，并對維持機體內氧化/抗氧化平衡起著重要作用。白藜蘆醇(resveratrol，Res)是一種多酚類化合物，常見于花生、葡萄、虎杖等植物中，具有多重生物學活性。多項研究[6-7]表明，白藜蘆醇可激活Keap1-Nrf2/HO-1信號通路，發(fā)揮抗氧化作用。該研究擬采用1%乙二醇+2%氯化銨誘導法制備大鼠腎草酸鈣結石模型，初步探討Res對草酸鈣結石形成的影響以及與Keap1-Nrf2/HO-1信號通路的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級雄性SD大鼠60只，體質量240～260 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，動物許可證號：SYXK(湘)2014-0012。大鼠飼養(yǎng)于相對濕度50%～60%，溫度(22±2)℃，通風良好的環(huán)境中，自由飲食。

1.2 主要試劑與儀器白藜蘆醇，純度≥98%，購自甘肅益生祥生物技術有限公司；Nrf2抑制劑ML385購自美國MedChemExpress公司；丙二醛(MDA)含量檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；ROS測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；細胞核蛋白質提取試劑盒、HRP標記的山羊抗兔IgG均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；兔抗人Keap1單克隆抗體、兔抗人HO-1單克隆抗體、兔抗人GAPDH單克隆抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司；Von Kossa染色試劑盒、兔抗人Nrf2多克隆抗體、兔抗人Histone H3多克隆抗體均購自英國Abcam公司；全自動生化分析儀購自美國Beckman Coulter公司；全自動數碼凝膠圖像分析系統(tǒng)購自上海天能科技有限公司；FACSCalibur流式細胞儀購自美國BD Biosciences公司。

1.3 方法

1.3.1動物造模與分組處理 60只雄性SD大鼠，適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分成5組，即對照組、模型組、Res低劑量組(L-Res組)、Res高劑量組(H-Res組)和Res高劑量聯合Nrf2抑制劑ML385組(H-Res + ML385組)，每組12只。除了對照組，其他各組均參考文獻[8]采用1%乙二醇+2%氯化銨誘導法制備大鼠草酸鈣腎結石模型，具體為采用1%乙二醇兌水用于自由飲水，2%氯化銨用于灌胃，每次1 ml，每日2次，連續(xù)造模4周。造模的同時進行給藥處理，對照組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃，L-Res組給予40 mg/(kg·d)Res灌胃，H-Res組給予160 mg/(kg·d)Res灌胃，H-Res+ML385組在H-Res組的基礎上給予30 mg/kg ML385腹腔注射，2 d/次，連續(xù)給藥4周。

1.3.2尿液、血液相關指標檢測 實驗結束前1 d，使用代謝籠收集所有大鼠24 h空腹尿液，采用量筒測定24 h排尿量，以精密pH計測定尿液pH值，全自動生化分析儀檢測尿液中Ca2+濃度，采用鉻酸鉀氧化甲基紅催化光度法測定尿草酸(Ox)含量。實驗結束前采集各組大鼠空腹靜脈血，采用全自動生化分析儀檢測血清中尿氮素(BUN)、肌酐(Cr)、Ca2+含量。

1.3.3Von Kossa染色觀察大鼠腎臟組織草酸鈣晶體形成 實驗結束后斷頸處死各組大鼠，取左腎石蠟包埋切片后，65 ℃恒溫烘干，經二甲苯、梯度濃度乙醇脫水，滴加1%硝酸銀溶液，在紫外線照射下孵育30 min，蒸餾水洗滌3次，滴加5%硫代硫酸鈉孵育3 min，蒸餾水洗滌3次，置于核固紅染液中孵育3 min，流水沖洗2 min，梯度濃度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察。

1.3.4大鼠腎臟組織中MDA含量與SOD活性檢測 取約0.1 g右腎組織，加入1 ml蛋白抽提液，冰浴條件下碾碎，12 000 r/min離心10 min，取上清液，按照試劑盒操作說明書加入相應試劑，孵育后測各樣品吸光度值，根據試劑盒操作說明書提供的計算公式分別計算MDA含量和SOD活性。

1.3.5大鼠腎臟組織中ROS水平檢測 取約1 mm3右腎組織，在預冷的PBS中漂洗，加入適量胰酶消化液，37 ℃消化30 min，間斷性吹打已消化組織，用預冷PBS終止消化，采用300目尼龍網過濾，收集細胞，500 r/min離心10 min，棄上清液，重懸細胞，加入10 μmol/L 熒光探針2’，7’-二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)，37 ℃孵育30 min，PBS洗滌2次，流式細胞儀上機檢測，記錄每組熒光強度值(fluorescence intensity，FI)，結果以相對于對照組熒光強度值表示。

1.3.6Western blot檢測大鼠腎臟組織中Keap1、Nrf2和HO-1等蛋白表達 取右腎組織，加入適量RIPA裂解液，冰上碾磨組織，12 000 r/min離心10 min，取上清液即為組織總蛋白溶液。另取部分右腎組織，根據核蛋白提取試劑盒說明書操作步驟提取腎臟組織細胞核蛋白，均采用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。均取20 μg蛋白進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，并將蛋白轉至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，對于總蛋白檢測分別加入兔抗人Keap1單克隆抗體(1 ∶1 000)、兔抗人HO-1單克隆抗體(1 ∶1 000)和兔抗人GAPDH單克隆抗體(1 ∶1 000)；對于核蛋白檢測分別加入兔抗人Nrf2多克隆抗體(1 ∶500)、兔抗人Histone H3多克隆抗體(1 ∶1 000)，均4 ℃孵育過夜。洗滌后加入HRP標記的山羊抗兔IgG(1 ∶10 000)室溫孵育1 h，ECL化學發(fā)光液孵育1 min后，使用全自動數碼凝膠圖像分析系統(tǒng)拍照觀察。目的蛋白相對表達量以目的蛋白光密度值與內參蛋白光密度值的比值表示。

2 結果

2.1 Res對草酸鈣腎結石模型大鼠尿液指標的影響與對照組比較，模型組大鼠24 h尿量、尿pH值降低，而24 h尿Ox含量和尿Ca2+含量增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，L-Res組和H-Res組大鼠24 h尿量和尿pH值增加，而24 h尿Ox含量和尿Ca2+含量降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且H-Res組優(yōu)于L-Res組。H-Res+ML385組與模型組各指標比較差異無統(tǒng)計學意義。見表1。

2.2 Res對草酸鈣腎結石模型大鼠血清生化指標的影響與對照組比較，模型組大鼠血清BUN、Cr和血Ca2+含量增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，L-Res組和H-Res組大鼠血清BUN、Cr和血Ca2+含量降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，并且H-Res組各指標下降幅度均優(yōu)于L-Res組。H-Res+ ML385組大鼠血清BUN、Cr和血Ca2+含量與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義。見表2。

表1 各組大鼠24 h尿量及尿液生化指標比較

與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001

圖1 各組大鼠腎臟組織Von Kossa染色 ×40

表2 各組大鼠血清生化指標比較

與對照組比較：**P<0.01，***P<0.001；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001

2.3 Res對草酸鈣腎結石模型大鼠腎臟草酸鈣結晶形成的影響Von Kossa染色后草酸鈣晶體呈現黑色著色，如圖1所示，與對照組比較，模型組大鼠腎臟組織中黑色著色增多；與模型組比較，隨著Res給藥濃度的增加，L-Res組和H-Res組大鼠腎臟組織中黑色著色減少；H-Res+ ML385組與模型組比較依舊可見大鼠腎臟中存在較多的黑色著色。

2.4 Res對草酸鈣腎結石模型大鼠腎臟組織氧化應激水平的影響與對照組比較，模型組大鼠腎臟組織中ROS水平、MDA含量增加，SOD活性降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，L-Res組和H-Res組大鼠腎臟組織中ROS水平、MDA含量降低，SOD活性增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且H-Res組優(yōu)于L-Res組。H-Res+ML385組與模型組各指標比較差異無統(tǒng)計學意義。見表3。

表3 各組大鼠腎臟組織SOD活性、MDA含量

與對照組比較：**P<0.01，***P<0.001；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001

2.5 Res對草酸鈣腎結石模型大鼠Keap1-Nrf2/HO-1信號通路的影響與對照組比較，模型組大鼠腎臟組織中核蛋白Nrf2及全蛋白Keap1、HO-1表達減少；與模型組比較，L-Res組和H-Res組大鼠腎臟組織中核蛋白Nrf2及全蛋白Keap1、HO-1則又呈濃度依賴式上調，而H-Res+ML385組與模型組比較各蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2。

3 討論

導致泌尿系統(tǒng)結石形成的病因可大致歸納為四個主要因素，即遺傳因素、代謝因素、飲食因素和局部因素。而有關該疾病的發(fā)病機制目前還尚無定論，但從結石成分分析來看，以草酸鈣為主要成分的結石占比最高，且其復發(fā)率也保持較高水平[9-10]。在草酸鈣結石形成初期，高濃度草酸會刺激腎小管上皮細胞發(fā)生氧化應激反應，產生大量的氧自由基，后者可改變細胞膜磷脂選擇性，促進膜表面草酸鈣晶體附著及成核，形成結石[11]。此外，形成的結石可進一步損傷腎小管上皮細胞，發(fā)生氧化應激反應，進而形成惡性循環(huán)。同時，Ma et al[3]也證實，在腎結石患者體內存在較高的氧化應激水平。因此，抗氧化療法或許能夠為腎結石的預防和治療提供新的思路。

圖2 Western blot檢測各組大鼠腎臟組織Nrf2、Keap1和HO-1蛋白的表達

A：Nrf2、Keap1和HO-1蛋白表達；B：蛋白相對表達量；1：對照組；2：模型組；3：L-Res組；4：H-Res組；5：H-Res+ML385組；與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較：##P<0.01，###P<0.001

目前，1%乙二醇+2%氯化銨誘導法是制備腎草酸鈣結石動物模型的常用方法。乙二醇是草酸的前體物質，在體內可代謝成草酸，引起高草酸尿癥，造成腎小管上皮細胞發(fā)生損傷，導致腎結石。而氯化銨可酸化尿液，促進草酸鈣晶體的析出，加快腎結石的形成[12]。本研究結果顯示，與對照組比較，造模后模型組大鼠尿pH值和24 h尿量均降低，而尿草酸含量、血清BUN和Cr以及尿Ca2+、血Ca2+含量均顯著升高，并且腎臟組織中存在大量草酸鈣晶體析出。說明腎草酸鈣結石模型制備成功。而采用Res干預后，與模型組比較，Res組大鼠尿pH值和24 h尿量均升高，而尿草酸含量、血清BUN和Cr以及尿Ca2+、血Ca2+含量均顯著降低，且大鼠腎臟組織中草酸鈣晶體析出量減少。說明Res干預可抑制腎草酸鈣結石的形成。

Res具有天然的強抗氧化能力，不僅能夠抑制氧自由基的產生，還能夠清除氧自由基以及抑制脂質過氧化，對多種病理狀態(tài)下的氧化應激水平均有改善作用[13],提示Res抑制腎草酸鈣結石形成的機制可能與其抗氧化作用有關。本研究結果顯示，模型組大鼠腎臟組織中ROS水平和MDA含量顯著增加，SOD活性顯著降低。說明草酸鈣結石模型大鼠腎臟組織確實存在較高的氧化應激水平。而Res干預后可顯著降低大鼠腎臟組織中ROS水平和MDA含量，并顯著提高SOD活性。說明Res可降低大鼠腎臟組織內的氧化應激水平，但在腎草酸鈣結石形成過程中Res通過何種途徑發(fā)揮抗氧化作用目前還未知。

Keap1-Nrf2/HO-1信號通路是近幾年來新發(fā)現的機體抵抗外界氧化刺激的防御性轉導通路。正常情況下，Nrf2與細胞骨架相關蛋白Keap1結合以二聚體的形式存在于細胞漿中，當受到外界氧化應激因子刺激后，Nrf2與Keap1解離并轉位進入細胞核，然后通過與抗氧化應激反應元件AR相互作用，誘導抗氧化蛋白(如HO-1)等蛋白的表達，進而發(fā)揮抗氧化作用[14]。已證實，Res可激活Keap1-Nrf2/HO-1信號通路發(fā)揮抗氧化作用[6-7]。本研究結果顯示，模型組大鼠腎臟組織中細胞核中Nrf2蛋白及全蛋白Keap1、HO-1表達減少，采用Res干預后核蛋白Nrf2及全蛋白Keap1、HO-1又顯著上調。然而，采用ML385阻斷Keap1-Nrf2/HO-1信號通路傳導后，Res干預效果則被顯著抑制，表明Res可能是通過激活Keap1-Nrf2/HO-1信號通路介導的抗氧化作用抑制草酸鈣結石的形成。