N-乙酰半胱氨酸對脂多糖誘導的血管內皮細胞凋亡的影響

熊 婷，張貞禎，鄭 睿，黃佳琳，郭 玲

牙周炎是一種極為常見的口腔慢性炎癥性疾病，其與心血管疾病的相關性近年來已成為研究熱點，已有研究發(fā)現(xiàn)牙周炎是心血管疾病的獨立危險因素[1]。臨床研究還發(fā)現(xiàn)，患有牙周炎的患者出現(xiàn)血管內皮功能水平降低的情況[2]。導致牙周炎的病原體以革蘭氏陰性細菌中牙齦卟啉單胞菌為主，而脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)是其主要的毒力因子。LPS通過作用于血管內皮細胞，導致某些炎性因子、凋亡因子和細胞因子表達異常，最終導致組織細胞發(fā)生炎癥反應、凋亡壞死、功能障礙等一系列病理改變[3]。N-乙酰半胱氨酸(n-acetyl cystein, NAC)作為一種抗氧化劑，具有減少體內氧自由基，抗氧化應激，抗炎，阻止細胞凋亡，調節(jié)細胞信號通路等作用[4]。NAC是否能夠抑制LPS誘導的凋亡，國內外關于這方面的報道較少。該研究以人臍靜脈血管內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)為研究對象，使用LPS誘導細胞建立體外凋亡模型，觀察NAC對LPS誘導的血管內皮細胞凋亡的影響及其可能機制，從而為更好的防治牙周炎導致的血管性疾病提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料HUVECs 細胞系購自美國ATCC細胞庫；胎牛血清以及DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；LPS、NAC 購自美國sigma公司；CCK-8試劑盒購自日本Dojindo公司；Annexin V/PI檢測試劑盒購自北京寶賽生物技術公司；總RNA抽提試劑盒、PrimeScriptTMRT逆轉錄試劑盒以及SYBR Green熒光定量PCR檢測試劑盒均購自日本Takara公司；所有抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；0.25%胰蛋白酶、BCA蛋白質定量試劑盒和青-鏈霉素均購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 取出HUVECs并復蘇，將其培養(yǎng)在DMEM完全培養(yǎng)基中(胎牛血清和青-鏈霉素含量分別為10%和1%)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)基每2 d更換1次。實驗用傳10代以內的細胞。

1.2.2CCK-8法檢測不同濃度NAC對HUVECs細胞活力的影響 HUVECs培養(yǎng)到對數(shù)生長期后消化，稀釋到1×105/ml。按照200 μl/孔的標準接種到96孔板中，并置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，用不含血清的DMEM培養(yǎng)基替換，繼續(xù)培養(yǎng)12 h。分別加入終濃度為0.25、0.5、1、2.5、5 mmol/L的NAC培養(yǎng)24 h，在設置不包含NAC的對照組的情況下，設置僅包含DMEM培養(yǎng)基且沒有細胞的空白組。每組4個復孔。孵育24 h后，用100 μl無血清DMEM培養(yǎng)基替換，并根據(jù)10 μl/孔的標準添加CCK-8。放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h。在酶聯(lián)免疫檢測器上測定450 nm處的A值，4個孔的平均值作為該樣本檢測值，重復實驗3次。根據(jù)細胞活力檢測NAC在此濃度范圍內是否具有細胞毒性。

1.2.3CCK-8法檢測不同濃度NAC對LPS損傷的HUVECs的保護作用 按照1.2.2項步驟接種、培養(yǎng)細胞。分別加入濃度為0.25、0.5、1、2.5、5 mmol/L的NAC預處理1 h，然后與終濃度為1 μg/ml的LPS共培養(yǎng)24 h，并設置只加LPS(1 μg/ml)的模型組、未加LPS和NAC的對照組、只加DMEM培養(yǎng)基而無細胞的空白組，每組4個復孔。后期方法同1.2.2項。根據(jù)細胞活力確定NAC逆轉LPS對HUVECs損傷的最佳藥物濃度。

1.2.4實驗分組及給藥 實驗分為4個組：對照組(正常培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h)、LPS組(LPS 1 μg/ml處理24 h)、NAC組(NAC 1 mmol/L處理24 h)、NAC+LPS組(NAC 1 mmol/L預處理1 h 后，與LPS 1 μg/ml共同處理24 h)。

1.2.5Annexin V/PI 染色法檢測細胞凋亡 HUVECs培養(yǎng)到對數(shù)生長期后消化，做稀釋處理至1×105/ml水平后。將其接種至6孔板，按2 ml/孔標準，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，按1.2.4項分組進行處理。用不含EDTA的胰蛋白酶消化細胞并收集細胞。用4 ℃預冷卻的PBS液洗滌細胞，重復2次。接著將細胞重懸于緩沖液中并將其密度稀釋為1×106/ml。每組各取100 μl細胞懸液轉移到5 ml 流式管中，加入5 μl Annexin V/FITC和5 μl PI，輕輕振動細胞使其均勻混合，室溫黑暗環(huán)境下放置15 min，1 h內用流式細胞儀進行凋亡相關分析。每組3個重復，結果取平均值。

1.2.6實時熒光定量PCR 檢測HUVECs的Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA的表達 按照1.2.5項分組培養(yǎng)細胞后，收集細胞。采用Trizol總RNA一步法提取細胞RNA。根據(jù)PrimeScriptTMRT Reverse Transcript Kit產品說明書完成對cDNA的有效合成，并將合成好的cDNA置于-20 ℃環(huán)境下保存?zhèn)溆?。引物來自Takara公司，目的基因序列見表1。PCR反應條件為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性20 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s。循環(huán)35次，72 ℃檢測信號。以GAPDH為內參。反應結束后在PCR儀上自動讀取閾值Ct。每組3個重復，結果取平均值。

1.2.7Western blot檢測HUVECs Bcl-2、Bax、Caspase-3、p-p38MAPK和t-p38MAPK蛋白表達 按照1.2.5項分組培養(yǎng)細胞后，用預先冷卻的1× PBS洗滌細胞2次，加入一定的RIPA細胞裂解液，并放置于4 ℃冰上進行細胞裂解，時間控制在30 min。離心處理，收集上清液，進而獲取總蛋白。然后用BCA試劑盒完成對蛋白質濃度的有效測定。每組量取20 μg總蛋白進行上樣，通過SDS-PAGE凝膠電泳分離目標蛋白后，將蛋白轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST洗膜3次，分別加入Bcl-2、Bax、Caspase-3、p-p38MAPK、t-p38MAPK、β-Actin 抗體4 ℃孵育過夜。TBST洗膜處理3次，并將辣根過氧化物酶(HRP)標記的第二抗體與膜在室溫條件下孵育2 h，TBST再次洗膜3次，并使用增強型化學發(fā)光試劑(ECL)進行顯色，借助系統(tǒng)成像軟件分析各組的對應條帶灰度值。β-Actin作為內參。分別計算目標蛋白的相對表達水平。

表1 目的基因引物序列

2 結果

2.1 不同濃度NAC對HUVECs活力的影響CCK-8法檢測表明：各實驗組與對照組之間的細胞活力差異均無統(tǒng)計學意義(F=0.524，P>0.05)，見表2。表明NAC濃度控制在5 mmol/L以內，對HUVECs增殖活力沒有影響，說明該濃度范圍內的NAC對HUVECs沒有毒性作用。

表2 不同濃度NAC對HUVECs活力的影響

2.2 不同濃度NAC對LPS損傷的HUVECs的保護作用CCK-8 法檢測結果顯示：各組間差異均有統(tǒng)計學意義(F=40.437，P<0.05)。與LPS單獨刺激比較，NAC+LPS共培養(yǎng)實驗組中，隨著NAC濃度不斷提高，HUVECs的活力逐漸增加，HUVECs的活力在濃度為1 mmol/L時達到最大。但隨著NAC濃度的繼續(xù)增加到5 mmol/L，HUVECs的活力基本保持不變。見表3。提示NAC可以保護LPS誘導的HUVECs損傷，并且在1 mmol/L時具有最強的保護作用。因此實驗確定1 mmol/L為NAC對LPS損傷的HUVECs保護的最佳藥物濃度。后續(xù)實驗NAC濃度為1 mmol/L。

表3 不同濃度NAC對LPS損傷的HUVECs活力的影響

與對照組比較：*P<0.05；與LPS組比較：#P<0.05

2.3 NAC對LPS誘導HUVECs凋亡的影響流式細胞儀的檢測結果表明：各組間差異均有統(tǒng)計學意義(F=135.372，P<0.05)。與對照組相比，LPS單獨刺激HUVECs可誘導細胞凋亡率增加，而NAC單獨刺激HUVECs可導致細胞凋亡率下降；在LPS組內添加NAC進行預處理，與LPS組進行比較，觀察到細胞凋亡率處于更低的水平。表明NAC能夠抑制LPS誘導的HUVECs凋亡增加。見圖1。

2.4 NAC對LPS刺激HUVECs Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA及蛋白表達水平的影響與對照組相比，HUVECs在LPS的刺激下，Bcl-2 mRNA 表達下降，Bax、Caspase-3 mRNA 表達升高；NAC單獨刺激HUVECs，Bcl-2 mRNA表達增加，Bax、Caspase-3 mRNA表達降低；在LPS組加入NAC預處理后，相對于LPS組，Bcl-2 mRNA表達增加，Bax、Caspase-3 mRNA表達降低。各組間差異均有統(tǒng)計學意義(Bcl-2：F=435.200,P<0.05；Bax：F=1 113.556,P<0.05；Caspase-3：F=1 193.405,P<0.05)，表明NAC能夠逆轉LPS誘導的HUVECs中對Bcl-2 mRNA表達的下調作用和Bax、Caspase-3 mRNA表達的上調作用。見圖2。Western blot也表現(xiàn)出類似的結果(Bcl-2：F=37.253,P<0.05；Bax：F=52.174,P<0.05；Caspase-3：F=176.82,P<0.05)，見圖3。

圖1 NAC對LPS誘導HUVECs凋亡的影響

A： 對照組；B: LPS組；C: NAC組；D: NAC+LPS組； 與對照組比較:*P<0.05；與LPS組比較：#P<0.05

圖2 NAC對LPS誘導HUVECs表達Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA的影響

A： 對照組；B: LPS組；C: NAC組；D: NAC+LPS組；與對照組比較:*P<0.05；與LPS組比較：#P<0.05

2.5 NAC對LPS刺激HUVECs磷酸化p38MAPK蛋白表達水平的影響Western blot 結果表明：各組間t-p38MAPK蛋白表達水平差異均無統(tǒng)計學意義(F=1.486，P>0.05) ，而各組間p-p38MAPK蛋白表達水平差異均有統(tǒng)計學意義(F=269.678，P<0.05)。與對照組相比，LPS單獨作用HUVECs導致p-p38MAPK蛋白表達水平提高，NAC單獨作用HUVECs導致p-p38MAPK蛋白表達水平降低。與LPS組相比，NAC預處理能夠有效阻礙LPS誘導的p-p38MAPK蛋白表達水平的提高，提示NAC能夠下調磷酸化p38MAPK通路蛋白活性，從而對LPS誘導的HUVECs凋亡起調控作用。見圖4。

圖3 NAC對LPS誘導HUVECs表達Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白的影響

A： 對照組；B: LPS組；C: NAC組；D: NAC+LPS組;與對照組比較:*P<0.05；與LPS組比較：#P<0.05

3 討論

牙周炎和心血管疾病聯(lián)系密切[5]。有學者對國內60歲及以上的同時存在冠心病和牙周炎的患者進行研究，結果表明患者的牙周炎病情與冠脈狹窄的嚴重程度之間呈正相關[6]。外周血管病、腦梗死和冠心病的主要病因是動脈粥樣硬化 (AS)，而血管內皮損傷是其形成早期的主要表現(xiàn)。也有相關研究表明，牙周炎患者血液中重要的冠心病相關生物標志物濃度增加，系統(tǒng)性牙周治療后其濃度降低，從而改善了血管內皮細胞功能[7]。因此，對有效防治牙周炎的藥物進行相關研究，可以為臨床治療相關心血管疾病提供理論依據(jù)和研究基礎。

圖4 NAC對LPS誘導HUVECs表達磷酸化p38MAPK蛋白的影響

A： 對照組；B: LPS組；C: NAC組；D: NAC+LPS組;與對照組比較:*P<0.05；與LPS組比較：#P<0.05

NAC作為谷胱甘肽(GSH)的前體，具有清除氧自由基、抗細胞凋亡、調節(jié)免疫等作用[8]。研究[9]表明，NAC可以降低內皮細胞氧化應激水平，減少細胞凋亡，從而抑制血管內皮受損。本次實驗通過Annexin V-FITC/PI流式細胞儀雙染實驗，觀察到NAC能夠對LPS誘導的HUVECs凋亡增加產生抑制效應。

細胞凋亡的發(fā)生受到多種凋亡相關基因的調控。作為凋亡的執(zhí)行者，Caspase-3在細胞凋亡發(fā)展中起關鍵作用，是所有凋亡信號轉導系統(tǒng)的共同通路蛋白，抑制Caspase-3活性可抑制細胞凋亡[10]。來自Bcl-2基因家族中的抗凋亡因子Bcl-2以及促凋亡因子Bax是細胞凋亡過程中的重要調節(jié)因子。Bcl-2過度表達時，與Bax進行有機結合形成異源二聚體以抑制細胞凋亡。Bax過度表達時，與Bax有機結合形成同源二聚體以促進細胞凋亡[11]。Bcl-2和Bax表達的失調，使細胞線粒體膜電位發(fā)生相應變化，從而導致細胞色素C成功穿透線粒體膜最終滲透到胞漿中，激活Caspase-9，活化的Caspase-9進一步激活Caspase-3，從而提高Caspase-3活性，最終促進細胞凋亡[12]。本研究表明，與對照組相比，單純使用1 mmol/L的NAC處理的血管內皮細胞Bcl-2 mRNA及蛋白表達上升，Bax、Caspase-3 mRNA及蛋白表達下降。表明NAC能夠阻礙血管內皮細胞凋亡的發(fā)生；與LPS組相比，NAC干預后，Bcl-2 mRNA及蛋白表達水平明顯上升，Bax、Caspase-3 mRNA及蛋白表達明顯下降，表明NAC可以拮抗LPS對血管內皮細胞促凋亡的作用，從而有助于細胞存活。

p38MAPK是MAPK信號轉導途徑的一部分，參與細胞增殖、凋亡等多種生理活動[13-14]。有研究報道NAC可抑制丙酮醛對人腹膜間皮細胞促凋亡作用，具體機制與抑制p38MAPK信號通路有關[15]。提示NAC抗細胞凋亡作用與信號轉導通路有關。本研究表明，對HUVECs予以LPS處理后，磷酸化p38MAPK蛋白表達水平顯著增加。NAC預處理后，磷酸化p38MAPK蛋白表達水平顯著下降，提示NAC能夠通過降低磷酸化p38MAPK信號分子的活性來抑制LPS誘導的細胞凋亡。

綜上，NAC能夠有效調節(jié)凋亡相關因子Bcl-2、Bax和Caspase-3的表達，從而抑制LPS對HUVECs凋亡的促進作用，且該過程可能與調控p38MAPK信號通路有關。提示牙周炎時，細菌產生的LPS進入血液，可導致血管內皮細胞增殖和凋亡平衡失調，引起斑塊聚集于血管內皮下，促進AS的發(fā)展。實驗表明有效控制牙周炎癥有利于改善血管內皮功能，降低發(fā)生患AS風險，為預防和控制心血管疾病提供新思路。