循環(huán)腫瘤DNA在腎細胞癌中的應(yīng)用研究進展

師 越，董 冬

（天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院檢驗科 國家腫瘤臨床醫(yī)學研究中心 天津市“腫瘤防治”重點實驗室天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學研究中心，天津 300060）

腎細胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是全球第七大最常見癌癥，占全世界成人惡性腫瘤的2.4%，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1]。目前，RCC的診斷主要依賴影像學和病理學檢查。但是這些檢查方法均具有明顯缺點：影像學檢查雖然可以檢測到腎臟的占位性病變，但不足以判斷病變的組織學類型；組織病理學檢查屬有創(chuàng)性檢查，需要有嚴格的醫(yī)學指征。此外，影像學和病理學檢查在評估腫瘤的轉(zhuǎn)移風險和疾病的進展，以及在監(jiān)測腫瘤療效方面均沒有太大的應(yīng)用價值。同其他實體腫瘤不同，目前RCC尚未發(fā)現(xiàn)可適用于臨床的腫瘤標志物，故不利于對高危人群的篩查和疾病的早期診斷。

由于早期RCC缺乏臨床癥狀，30%的患者被診斷時已是疾病中晚期。晚期RCC患者的預(yù)后普遍較差，5年總生存率僅為8%[2]。此外，在接受根治性腎切除術(shù)后，超過30%的RCC會復發(fā)或轉(zhuǎn)移[2]。在過去的幾年中，針對晚期或轉(zhuǎn)移性腎細胞癌（metastatic renal cell carcinoma，mRCC）患者的治療策略發(fā)展迅速。例如，免疫療法[抗程序性細胞死亡1（programmed death-1，PD-1）抗體納武單抗和抗細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)蛋白4抗體伊匹單抗][3]、蛋白酶抑制劑[哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）抑制劑依維莫司][4]以及酪氨酸激酶抑制劑（舒尼替尼、索拉非尼、帕唑帕尼和阿西替尼）[5]，均可以使晚期RCC或mRCC患者顯著獲益。然而，這些治療措施均需要一定的免疫學或分子生物學指征，藥物的耐受仍是限制療效的關(guān)鍵問題。在這種情況下，迫切需要針對RCC可靠且無創(chuàng)的生物標志物，以進行疾病早期診斷，指導靶向藥物的選擇，監(jiān)測治療效果，發(fā)現(xiàn)并評估藥物耐受情況，以便及時調(diào)整治療方案。

循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）是存在于血液或體液中由腫瘤細胞衍生出的片段化DNA，是一種特征性的腫瘤生物標志物。通過分析ctDNA的各項特征，可獲得與該腫瘤相關(guān)的多方面信息。ctDNA檢測的核心優(yōu)勢在于其能反映整個腫瘤基因組的信息[6-7]，而且具有實時性、易獲得性。因此，近年來在抗擊癌癥中的應(yīng)用價值受到了極大的關(guān)注，但ctDNA在RCC臨床診治中的應(yīng)用仍處于探索的早期階段。深入研究其臨床應(yīng)用價值對各個階段的RCC患者均有益，并有助于提供個性化的mRCC治療方案。本綜述對ctDNA在RCC診斷、預(yù)后評估、疾病復發(fā)監(jiān)測、治療效果監(jiān)測及獲得性耐藥等方面的臨床研究進展進行介紹。

1 ctDNA含量與片段化

先拋開序列信息不談，RCC患者外周血中ctDNA的含量和片段大小本身就具有一定的臨床應(yīng)用價值。有研究發(fā)現(xiàn)，mRCC患者外周血中ctDNA的含量與腫瘤負荷相關(guān)，在53%的mRCC患者外周血中檢測到了ctDNA，這些患者的腫瘤體積顯著大于未檢測到ctDNA的患者[8]。WAN等[9]的研究則進一步證實，血漿ctDNA的水平與RCC的復發(fā)相關(guān)，腎切除術(shù)前血漿ctDNA水平高的患者腫瘤復發(fā)率明顯高于血漿ctDNA水平低的患者。ctDNA的水平在治療監(jiān)測中同樣具有重要作用，F(xiàn)ENG等[10]在不同時間點對18例接受索拉非尼治療的mRCC患者血漿ctDNA水平進行定量檢測，發(fā)現(xiàn)在治療過程中血漿ctDNA水平與預(yù)后呈負相關(guān)。

YAMAMOTO等[11]進行了更為深入的研究，發(fā)現(xiàn)RCC患者血漿中ctDNA中位數(shù)水平要顯著高于健康對照組。此外，血漿ctDNA的水平隨著腫瘤TNM分期和Fuhrman分級的增高而增加；伴有淋巴管浸潤患者的ctDNA水平也顯著高于不伴浸潤的患者；與健康對照組相比，即便是早期（cT1aN0M0）RCC患者，其血漿ctDNA水平也會顯著升高。該研究團隊還揭示了ctDNA的片段化水平同樣具有臨床應(yīng)用價值，即RCC患者血漿ctDNA片段長度要顯著短于健康對照組，而且ctDNA片段大小與RCC患者的疾病無進展生存率呈負相關(guān)[11]。不僅如此，在較高的Fuhrman分級和淋巴管浸潤陽性的患者中，ctDNA的平均長度更短[11-12]。以上這些研究結(jié)果均提示，ctDNA的含量及片段化水平對于RCC患者的診斷、疾病分期和分級，以及預(yù)后判斷均具有重要的潛在價值。

2 ctDNA的突變

ctDNA來源于基因組DNA，其所攜帶的堿基突變數(shù)量與患者腫瘤細胞的突變負荷直接相關(guān)，檢測ctDNA的突變譜有助于預(yù)測患者是否能夠從免疫學檢查點抑制劑治療中獲益[13]。納武單抗是一種針對PD-1的單克隆抗體，最近被批準用于治療伴有錯配修復缺陷的惡性腫瘤[14]，而mRCC屬于其治療適應(yīng)癥。目前，免疫檢查點抑制劑在mRCC的治療中起著極其重要的作用，并且預(yù)計在不久的將來會有越來越多的相關(guān)藥物被批準用于mRCC的治療。此外，多種免疫學檢查點抑制劑的聯(lián)合使用有望成為mRCC的一線療法[15-17]。ctDNA中堿基突變數(shù)量可以預(yù)測RCC患者對免疫治療的反應(yīng)，這更顯示出了ctDNA突變檢測所具有的臨床應(yīng)用價值。

除此之外，RCC的突變特征也與治療應(yīng)答和療效密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，RCC小鼠血漿中可檢測到帶有耐甲氧戊二烯（methoprenetolerant，MET）突變的ctDNA，其水平與原發(fā)腫瘤的體積相關(guān)，并隨著卡博替尼的治療而改變[18]。血管內(nèi)皮生長因子受體1（vascular endothelial growth factor receptor 1，VEGFR1）基因上的rs9582036突變能夠預(yù)測舒尼替尼治療的效果，有望成為一個重要的預(yù)測生物標志物[19]。PAL等[20]檢測了220例mRCC患者的ctDNA突變譜并進行分類，評估不同ctDNA突變類型患者對靶向治療的反應(yīng)性是否存在顯著差異，發(fā)現(xiàn)ctDNA中p53基因突變水平的升高與舒尼替尼、帕唑帕尼及貝伐珠單抗等靶向藥物的耐藥產(chǎn)生相關(guān)。

由腫瘤異質(zhì)性引起的耐藥性是限制腫瘤治療效果的根本原因，RCC也不例外[21]。在腫瘤組織中，哪怕只有極少數(shù)的癌細胞帶有耐藥突變，那么在治療過程中，這些細胞都可能存活下來，進而形成耐藥腫瘤組織[22]。這些腫瘤細胞在最初的病理活檢中會因數(shù)量少或空間分布等原因而被漏檢，ctDNA可以提供更具代表性的腫瘤遺傳多樣性“全視圖”，從而可以在一定程度上彌補這個缺憾，這對指導RCC的治療決策具有重要意義。

3 ctDNA甲基化

ctDNA甲基化標志物已成為腫瘤臨床治療研究的熱點，這不只是因為甲基化改變是腫瘤發(fā)生的一個早期而獨立的事件，更是因為外周血ctDNA的甲基化圖譜恰似腫瘤細胞的指紋，具有高度的腫瘤特異性和個體特異性。由Epigenomics公司研發(fā)的外周血Sept9甲基化檢測試劑盒已經(jīng)獲得美國食品與藥品監(jiān)督管理局批準上市，用于結(jié)直腸癌的篩查和早期診斷，并且在腫瘤復發(fā)監(jiān)測、預(yù)后判斷，以及治療監(jiān)測中均具有重要的臨床應(yīng)用價值[23-24]。

ctDNA甲基化已成為多種腫瘤診斷和預(yù)后評估的非常有前途的表觀遺傳標志物，對RCC來說亦是如此。大量研究結(jié)果表明，DNA甲基化參與RCC的發(fā)生和發(fā)展，并且能夠反映患者對治療的反應(yīng)性[25-26]。DNA甲基化通常發(fā)生在癌癥的早期，這使DNA甲基化生物標志物成為早期檢測的理想靶標。SKRYPKINA等[27]的研究發(fā)現(xiàn)，RCC患者血漿DNA中可以檢測到Ras區(qū)相關(guān)域家族1A（ras association domain family 1A，RASSF1A）、脆性組氨酸三聯(lián)體（fragile histidine triad，F(xiàn)HIT）和結(jié)腸腺瘤樣息肉蛋白（adenomatous polyposis coli，APC）的甲基化，對于RCC的診斷具有重要價值。此外，DNA甲基化通常與治療藥物的耐藥性和敏感性有關(guān)。因此，甲基化生物標志物既適用于在藥物治療前對患者進行有效性分層，也適用于在治療過程中監(jiān)測疾病的進展。

JUNG等[28]檢測了RCC組織及血漿樣品中身材矮小同源盒蛋白2（short stature homeobox protein 2，SHOX2）的甲基化水平，并對其臨床意義進行了評估，發(fā)現(xiàn)通過檢測治療前ctDNA中SHOX2甲基化水平可以鑒別出腎切除術(shù)后仍具有高死亡風險的RCC患者，通過早期干預(yù)，這些患者可能受益于輔助治療或早期進行的姑息治療。另一項研究發(fā)現(xiàn)，血清中原鈣黏蛋白17（protocadherin-17 precursor，PCDH17）甲基化是RCC中的常見事件，并能夠提示預(yù)后不良，有可能成為術(shù)后RCC患者預(yù)后的生物標志物[29]。除了血液樣本，RCC患者尿液樣本中的PCDH17甲基化也有可能成為泌尿系統(tǒng)腫瘤的生物標志物，包括膀胱癌、RCC和前列腺癌[30]。在RCC患者尿液樣本中挖掘出的另一種甲基化生物標志物是轉(zhuǎn)錄因子21（transcription factor 21，TCF21），該基因在RCC患者尿液中的水平與其在腫瘤組織中的水平呈正相關(guān)，且對RCC具有一定診斷價值[31]。COSTA等[30]的研究進一步印證了這一結(jié)論。事實上，在組織學水平上，很多基因的甲基化水平與腎癌患者的預(yù)后緊密相關(guān)，但是這些基因在血漿中的甲基化水平是否也與腎癌患者的預(yù)后相關(guān)還有待深入研究。理論上特定基因在腫瘤組織中的甲基化水平應(yīng)該與血漿或者尿液中的水平是一致或相關(guān)的[31]，這些基因在外周血或尿液中的甲基化水平在疾病預(yù)后中的臨床價值也應(yīng)該得到關(guān)注。

4 其他

4.1 多態(tài)性

自噬在RCC的發(fā)生及進展中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。SANTONI等[32]對外周血中自噬基因的基因型進行了分析，以評估其與腎透明細胞癌患病風險以及預(yù)后的相關(guān)性。他們選取的自噬相關(guān)基因包括自噬相關(guān)家族基因（autophagyrelated gene，ATG）中的ATG4A、ATG4B、ATG4C、ATG5、ATG16L1、ATG16L2和IRGM，并在40例接受帕唑帕尼治療的mRCC患者中對這些基因的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）進行分析，發(fā)現(xiàn)與普通人群相比，mRCC患者ATG16L2-rs10751215的發(fā)生率顯著降低，ATG4A-rs7880351、ATG4C-rs6670694和ATG5-rs490010與接受帕唑帕尼的治療RCC患者的疾病無進展生存期相關(guān)。

4.2 線粒體

LU等[33]調(diào)查了基因組和線粒體來源的ctDNA片段在RCC患者診斷和預(yù)后中的應(yīng)用潛力，他們從40名健康對照者和229例RCC患者（145例RCC和84例mRCC）中提取ctDNA并進行分析，發(fā)現(xiàn)2個線粒體片段（65 bp和175 bp）能夠?qū)⒔】祵φ照摺CC和mRCC患者進行有效的區(qū)分；同時還發(fā)現(xiàn)，有1個基因組ctDNA片段（306 bp）能夠?qū)CC患者和健康對照者進行區(qū)分。該研究表結(jié)果明，基因組和線粒體ctDNA片段可能有助于早期診斷mRCC，這在RCC輔助治療中可能具有重要的應(yīng)用價值。

5 問題與展望

RCC患者外周血ctDNA有其自身特點，與其他實體瘤（如胰腺癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌等）相比，RCC患者的ctDNA水平相對較低[34-35]。RCC患者的ctDNA水平與疾病進展相關(guān)，具有高腫瘤負荷的RCC患者傾向于具有更高水平的ctDNA[34]。而對于早期RCC患者來說，需要具有更高靈敏度的檢測方法進行檢測。

作為液體活檢的一個重要分支，ctDNA檢測具有改變癌癥治療前景的潛力。但是，這種新方法的廣泛使用仍面臨著諸多挑戰(zhàn)，包括：如何改進技術(shù)以提高早期RCC患者外周血中ctDNA檢測的敏感性和特異性；如何制定統(tǒng)一、規(guī)范的操作流程以使不同實驗室的檢測結(jié)果具有可比性；如何降低檢測成本以使該檢測適用于疾病的早期篩查。作為腫瘤診斷的金標準，組織病理檢查仍具有不可替代的作用。隨著研究的深入，ctDNA檢測在RCC診斷、預(yù)后評估、疾病復發(fā)監(jiān)測、治療效果監(jiān)測及獲得性耐藥等方面的作用日益受到重視。作為一種非侵入性的檢測方法，ctDNA檢測能夠使患者容易耐受，并能夠滿足臨床對于實時性和連續(xù)性取材的要求。因此，ctDNA檢測將可能成為組織活檢不可或缺的補充手段，其臨床應(yīng)用價值得期待。