大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)耐藥肺炎支原體研究進(jìn)展

王冰潔， 張 泓

（上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院 上海市兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200040）

肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae，MP）是上、下呼吸道感染，包括社區(qū)獲得性肺炎（community-acquired pneumonia，CAP）最常見(jiàn)的病原體之一，常引起非典型肺炎，尤其是兒童社區(qū)獲得性非典型肺炎，也會(huì)同時(shí)或依次引起神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等肺外癥狀[1-4]。各年齡人群均易感MP，但多發(fā)于兒童和青少年，易引起暴發(fā)流行。MP缺乏細(xì)胞壁，對(duì)作用于細(xì)胞壁的β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物天然耐藥。此外，不推薦兒童使用喹諾酮類(lèi)和四環(huán)素類(lèi)抗菌藥物。因此，大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗菌藥物是治療兒童MP感染的首選藥物[5]。隨著此類(lèi)藥物的廣泛應(yīng)用，大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)耐藥肺炎支原體（macrolide-resistantMycoplasma pneumoniae，MRMP）肺炎在世界范圍內(nèi)蔓延，嚴(yán)重限制了兒童患者的治療選擇。本文就MP對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗菌藥物的耐藥情況、耐藥機(jī)制及流行基因型和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)等進(jìn)行綜述，以了解MRMP感染的流行病學(xué)特征，為疾病的早期診斷和及時(shí)治療提供參考。

1 MP大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗菌藥物耐藥現(xiàn)狀

自2001年日本首次報(bào)道從臨床樣本中分離出MRMP后，亞洲、歐洲和北美洲相繼出現(xiàn)相關(guān)報(bào)道。MRMP在不同地區(qū)的流行差異較大，在中國(guó)、日本和韓國(guó)等亞洲國(guó)家普遍高度流行，在北美洲、歐洲、非洲地區(qū)相對(duì)低度流行。國(guó)內(nèi)外MP對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)的耐藥形勢(shì)較為嚴(yán)峻，美國(guó)MRMP占3%～10%[6]，歐洲除意大利（26%）外，其他地區(qū)均低于10%[7]，法國(guó)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)耐藥株檢出率為8.3%[8]，德國(guó)2016—2018年大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)耐藥率約3%[9]，南非2012—2015年的MP均為敏感株[10]，日本2008—2015年兒童MRMP的檢出率為50%～90%[11]，我國(guó)除南京外（20%），北京、上海、新疆、云南和哈爾濱等地兒童MRMP的檢出率仍然較高（66.7%～86.7%）[12]。QU等[13]發(fā)現(xiàn)北京2010—2012年兒童MRMP檢出率為94.3%，略高于成人（83.8%），但這種差異與特定的多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析（multiple-locus variantnumber tandem-repeat assay，MLVA）型別無(wú)相關(guān)性。韓國(guó)2015年MRMP檢出率為87.2%，較2011年的62.9%明顯上升[14]。

有研究結(jié)果顯示，日本2008—2012年MRMP檢出率高達(dá)81.6%，2013年逐漸降低至43.6%，可能與2011年日本MP治療指南允許對(duì)部分MRMP感染患兒使用氟喹諾酮類(lèi)藥物有關(guān)[11]。我國(guó)也有研究報(bào)道部分地區(qū)MRMP檢出率下降，但具體原因仍需進(jìn)一步分析[12]。相關(guān)研究結(jié)果[15-16]提示，合理使用抗菌藥物可能是控制MRMP的關(guān)鍵。

2 MP對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗菌藥物的耐藥機(jī)制

大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗菌藥物可結(jié)合核糖體50S亞基23SrRNA結(jié)構(gòu)域V區(qū)或Ⅱ區(qū)的特定核酸，通過(guò)使肽酰基tRNA與核糖體提前分離而抑制蛋白質(zhì)合成，達(dá)到抑菌作用。MP耐藥株的體外藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，23SrRNA點(diǎn)突變與大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗菌藥物耐藥高度相關(guān)，常見(jiàn)的突變位點(diǎn)是2063、2064和2617[17]。A2063G點(diǎn)突變、A2064G與14元、15元大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)高水平耐藥有關(guān)，而2617點(diǎn)突變導(dǎo)致的耐藥性水平相對(duì)較低[17-19]。值得注意的是，我國(guó)MRMP最常見(jiàn)的是23Sr RNA 結(jié)構(gòu)域V區(qū)A2063G突變。北京2010—2012年MP耐藥監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)表明，分離自成人和兒童的MRMP幾乎都攜帶A2063G突變，2014—2016年分離的53株MRMP中，除1株攜帶A2064G突變外，其他菌株均攜帶A2063G突變[13，17]，與其他文獻(xiàn)[20-21]結(jié)果一致。同樣，日本和美國(guó)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)耐藥MP也以A2063G位點(diǎn)突變?yōu)橹鱗11，22]。此外，PEREYRE等[23]發(fā)現(xiàn)核糖體蛋白L4、L22保守區(qū)的缺失或插入也可能導(dǎo)致MP對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)耐藥，他們用克林霉素和泰利霉素在體外誘導(dǎo)核糖體蛋白L4發(fā)生單核苷酸H70R或H70L突變，泰利霉素誘導(dǎo)核糖體蛋白L22出現(xiàn)P112R和A114T替換和111IPRA114缺失。但其他相關(guān)研究結(jié)果表明，MP臨床分離株中核糖體蛋白L4、L22突變?cè)谒心退幒兔舾芯曛芯沙霈F(xiàn)，與耐藥性無(wú)關(guān)[15，24]。另外，MP也可能通過(guò)主動(dòng)外排系統(tǒng)或核糖體甲基化修飾等其他機(jī)制對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗菌藥物產(chǎn)生抗性[25]。

由于MP的23SrRNA只有1個(gè)拷貝，所以單個(gè)突變就可以改變大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)耐藥表型，而大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗菌藥物的過(guò)度使用會(huì)增加23SrRNA基因突變的可能性。有研究結(jié)果顯示，感染大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)敏感的肺炎支原體（macrolide-sensitive M. pneumoniae，MSMP）的患者在使用阿奇霉素24 d后可發(fā)生耐藥突變[15]，大規(guī)模使用大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗菌藥物后耐藥性克隆的出現(xiàn)頻率顯著增加[16]，提示耐藥菌株的出現(xiàn)與流行可能與大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗菌藥物的過(guò)度使用有關(guān)，合理使用抗菌藥物十分重要。

3 MP的分子流行病學(xué)特征

目前常用的MRMP的感染流行病學(xué)監(jiān)測(cè)方法有P1基因限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）分型和MLVA分型。隨著全基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，多位點(diǎn)序列分析（multilocus sequence typing，MLST）和單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）等分辨力更高的分型方法將被用于臨床常規(guī)檢測(cè)和暴發(fā)流行調(diào)查[2]。

P1基因RFLP分型方法已被使用了約20年，該法將MP分為P1-Ⅰ型和P-Ⅱ型2種型別。SUN等[26]發(fā)現(xiàn)，北京2003—2015年分離的480株MP中，P1-Ⅰ型為主要型別（82.6%～95.4%）。美國(guó)、法國(guó)也以P1-Ⅰ型為主[8，22]。 俄羅斯、哥倫比亞等國(guó)流行P1-Ⅱ型或其變體[27]。除P1基因分型外，MLVA也是一種常用的分子分型方法。MLVA 4-5-7-2和3-5-6-2是主要類(lèi)型。分別占50.6%～55.1%和14%～20.8%[28-29]。P1基因RFLP分型與MLVA分型有一定關(guān)聯(lián)，如MLVA-4-5-7-2與P1-Ⅰ型相關(guān)，而MLVA3-5-6-2通常屬于P1-Ⅱ型或其變異體[30]。也有研究發(fā)現(xiàn)P1基因RFLR分型或MLVA型與大環(huán)內(nèi)脂類(lèi)耐藥無(wú)明顯聯(lián)系，其存在多克隆傳播，耐藥基因的不斷出現(xiàn)與治療過(guò)程中不斷出現(xiàn)的突變有關(guān)，而不是人與人之間的單克隆傳播[2，30]。然而，在多數(shù)耐藥率相對(duì)較高的研究中，大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)耐藥的MP中檢出的MLVA4-5-7-2顯著多于其他型別，而在非耐藥的菌株中MLVA3-5-6-2為主要優(yōu)勢(shì)型別[12-13，30-31]。我國(guó)香港的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，2011—2014年MP對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗菌藥物的耐藥率增長(zhǎng)了3倍，MLVA單一型別的克隆傳播導(dǎo)致耐藥率的增長(zhǎng)，MLVA 4-5-7-2型從25%增長(zhǎng)到100%[29]，與其他相關(guān)報(bào)道[12-13，32]一致。另外，日本對(duì)2011—2017年MP的流行病學(xué)分析結(jié)果表明，2015年后MRMP的檢出率降低與P1-Ⅱ型譜系菌株的增加有關(guān)[33]。但目前尚無(wú)證據(jù)直接證明耐藥與P1基因亞型或MLVA亞型有明顯關(guān)聯(lián)。2014年，有學(xué)者利用MP基因組中8個(gè)管家基因（ppa、pgm、gyrB、gmk、glyA、atpA、arcC、andadk）把57株MP分為12個(gè)ST型別、2個(gè)主要克隆群，其分辨率比P1基因RFLP分型和MLVA分型更高[34]。韓國(guó)學(xué)者用MLST把2000—2016年146株MP臨床分離株分為8個(gè)ST型別，其中常見(jiàn)的是ST3型和ST14型，分別占74.7%和15.1%，其中98.3%的MRMP為ST3型[35]。日本2002—2016年MP中最常見(jiàn)的型別是ST3，而MRMP主要為ST3（74.6%）和ST19（11.4%）[36]。這些研究結(jié)果均表明ST3型的克隆傳播可能與MRMP的增加有關(guān)。

4 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法

控制MRMP感染的重要措施是早期快速檢出MP及耐藥MP，從而指導(dǎo)臨床治療。MP分離培養(yǎng)和體外藥物敏感性試驗(yàn)是診斷MRMP感染和治療的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于生長(zhǎng)條件要求苛刻，且培養(yǎng)周期長(zhǎng)，結(jié)果受多種因素影響，不適合常規(guī)檢查。建立新的快速檢測(cè)方法，如目前臨床常用的聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增法，具有快速、靈敏的優(yōu)點(diǎn)，有助于及時(shí)控制MRMP的暴發(fā)流行[37]。

4.1 常規(guī)方法

MP培養(yǎng)法是世界衛(wèi)生組織推薦的診斷金標(biāo)準(zhǔn)，可分為固體培養(yǎng)法和快速液體培養(yǎng)法。MP固體培養(yǎng)法需要2～4周時(shí)間，靈敏度也較低，盡管隨著培養(yǎng)基的改進(jìn)，其敏感性得到一定程度的提高，但特異性仍較低，易受其他微生物的污染而出現(xiàn)假陽(yáng)性。血清學(xué)檢測(cè)方法由于快速、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)而在臨床中被廣泛應(yīng)用，但通常需要收集急性期和恢復(fù)期雙份血清，抗體滴度呈4倍或4倍以上增高或減低時(shí)才有意義，且耗時(shí)2～3周，結(jié)果受抗體產(chǎn)生、患者年齡、免疫功能的影響，如某些輕度感染者或嬰幼兒及免疫缺陷者不能產(chǎn)生抗體，會(huì)導(dǎo)致漏診，也不宜作為早期快速診斷方法[38-39]。

4.2 分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)

近年來(lái)，臨床常用核酸擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)MP的DNA或RNA，常用的實(shí)驗(yàn)方法有傳統(tǒng)聚合酶鏈反應(yīng)、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)等，常用的擴(kuò)增靶基因有P1黏附蛋白基因、16S rRNA、ATP酶基因和各種轉(zhuǎn)錄翻譯因子等。這類(lèi)技術(shù)具有特異性高，檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)，具有廣泛的應(yīng)用前景[40]。

胡文娟等[41]建立了新型MP實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)方法，并與傳統(tǒng)的巢式聚合酶鏈反應(yīng)、分離培養(yǎng)法等進(jìn)行對(duì)比，總符合率分別達(dá)88.1%、83.5%，且檢測(cè)靈敏度可達(dá)10拷貝，更快速、經(jīng)濟(jì)，具有很高的科研和臨床應(yīng)用價(jià)值。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是一種較新的直接檢測(cè)臨床標(biāo)本中多種微生物的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，其利用寡核苷酸引物和鏈置換聚合酶在恒溫下擴(kuò)增目的片段，結(jié)果肉眼可見(jiàn)。該方法目前已被成功運(yùn)用于檢測(cè)MP。YUAN等[42]使用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在北京307醫(yī)院2016—2017年收集的125份標(biāo)本中檢出43例MP，而實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)檢出40例。提示環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)具有很高的特異性和靈敏度，尤其適合MP的快速檢測(cè)，在兒童患者中有很好的應(yīng)用前景。

目前，學(xué)者們對(duì)MP是否為上呼吸道正常菌群存在爭(zhēng)議。有研究結(jié)果表明，健康人上呼吸道MP攜帶率很高，且死亡MP的DNA可持續(xù)7個(gè)月之久，血清學(xué)方法和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)不能區(qū)分無(wú)癥狀攜帶和感染[43-44]。而RNA只存在于增殖存活的病原體內(nèi)，故以RNA為基礎(chǔ)的檢測(cè)MP RNA放大技術(shù)能夠區(qū)分MP的感染和攜帶。實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)（simultaneous amplification and testing，SAT）技術(shù)是我國(guó)自主研發(fā)的專(zhuān)利技術(shù)，通過(guò)磁珠法提取特異性核酸，具有很高的特異性，目前在結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)中應(yīng)用廣泛，但在MP檢測(cè)中應(yīng)用較少。LI等[45]分別采用MP-SAT、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)315例患兒MP，發(fā)現(xiàn)兩者具有較好的一致性，且SAT具有更高的特異性和敏感性。

目前，一般采用體外藥物敏感性試驗(yàn)分析MP對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗菌藥物的耐藥情況，但由于MP培養(yǎng)條件苛刻，臨床實(shí)驗(yàn)室一般無(wú)法常規(guī)開(kāi)展。大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗菌藥物耐藥性的產(chǎn)生多與23SrRNA結(jié)構(gòu)域Ⅱ區(qū)和V區(qū)基因位點(diǎn)突變有關(guān)。目前臨床上主要通過(guò)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)和測(cè)序技術(shù)快速檢測(cè)耐藥性點(diǎn)突變進(jìn)行耐藥分析，如Sanger測(cè)序法和實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)-高分辨率熔解曲線（polymerase chain reaction-high resolution melting，PCR-HRM）。最近有研究結(jié)果表明，有商業(yè)化試劑盒通過(guò)熔解曲線分析MP耐藥突變，與測(cè)序法比較，敏感性和特異性均為100%[46]。美國(guó)疾病預(yù)防與控制中心也使用PCR-HRM檢測(cè)在MP暴發(fā)流行中的大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)耐藥突變[47]，但很少有方法可以同時(shí)檢測(cè)MP及其耐藥性突變。有學(xué)者設(shè)計(jì)了一種實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)方法，可以從臨床標(biāo)本中快速檢測(cè)MP，并同時(shí)快速檢測(cè)23SrRNA 3個(gè)常見(jiàn)的耐藥突變[48]。LIU等[49]開(kāi)發(fā)了一種循環(huán)探針?lè)?，利用RNA和DNA構(gòu)成的嵌合cycling探針，可以快速檢測(cè)出MP，并區(qū)分出耐藥突變株，與傳統(tǒng)聚合酶鏈反應(yīng)有良好的一致性。

核酸擴(kuò)增方法有助于更好地了解MP的流行病學(xué)特征，可為臨床治療提供一定的依據(jù)。但是目前尚無(wú)統(tǒng)一的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，故還未常規(guī)應(yīng)用于臨床。我們?nèi)孕杼剿鞲m用于臨床的MP檢測(cè)方法，指導(dǎo)臨床制定合理的治療方案，獲得理想的治療效果。