碳青霉烯類(lèi)耐藥腸桿菌科細(xì)菌臨床檢測(cè)與治療方案的發(fā)展及應(yīng)用

王 粟， 趙 虎

（復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200040）

近年來(lái)，隨著侵入性診療手段以及廣譜抗菌藥物等的大量使用，多重耐藥（multidrug resistance，MDR）細(xì)菌的檢出率呈現(xiàn)快速上升趨勢(shì)，碳青霉烯類(lèi)耐藥腸桿菌科細(xì)菌（carbapenem-resistantEnterobacteriaceae，CRE）因耐藥性強(qiáng)而廣、傳播快、感染病死率高而備受關(guān)注，被世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）列為全球耐藥的緊急威脅[1-2]。為了有效預(yù)防和控制CRE感染，本期“碳青霉烯類(lèi)耐藥腸桿菌科細(xì)菌臨床檢測(cè)與治療方案的發(fā)展及應(yīng)用”專(zhuān)題匯集4篇論著和2篇綜述，介紹了CRE的流行病學(xué)特征，并對(duì)CRE檢測(cè)方法和對(duì)應(yīng)治療策略的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了總結(jié)和比較，以期為臨床CRE感染的預(yù)防和診療提供參考。

1 CRE國(guó)內(nèi)外流行現(xiàn)狀

中國(guó)CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示，2005年，碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物對(duì)腸桿菌科細(xì)菌保持較高的敏感性，耐藥率普遍低于1%；2017年，耐藥率明顯上升，達(dá)1.9%～20.0%，尤以肺炎克雷伯菌的耐藥率增長(zhǎng)最快（由2005年的0.4%增長(zhǎng)到2017年的20.0%）[3]。不同菌種的CRE發(fā)生率也有所不同，美國(guó)CRE的發(fā)生率分別為：肺炎克雷伯菌 11%，大腸埃希菌2%，相關(guān)病死率為40%～50%[1]；歐洲肺炎克雷伯菌中碳青霉烯類(lèi)耐藥株的檢出率為37%，大腸埃希菌中碳青霉烯類(lèi)耐藥株的檢出率為19%[4-5]；我國(guó)CRE的檢出率則快速增加，最高可達(dá)15%，患者定植或感染CRE會(huì)直接增加住院時(shí)長(zhǎng)及感染病死率，總體病死率達(dá)34%，其菌種構(gòu)成以肺炎克雷伯菌（74%）為主[6]。

2 CRE的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法及應(yīng)用

CRE最常見(jiàn)的耐藥機(jī)制是產(chǎn)碳青霉烯酶，其次是高表達(dá)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（extendedspectrum β-lactamase，ESBL）或頭孢菌素酶（ampicillin，AmpC）合并膜孔蛋白突變，而藥物靶點(diǎn)改變和主動(dòng)外排系統(tǒng)過(guò)表達(dá)導(dǎo)致的碳青霉烯類(lèi)耐藥則較為少見(jiàn)[7]。因此，除了體外藥物敏感性試驗(yàn)外，目前的CRE檢測(cè)方法大多通過(guò)檢測(cè)是否產(chǎn)碳青霉烯酶來(lái)判斷CRE菌株。周宏偉等撰寫(xiě)的《碳青霉烯類(lèi)耐藥腸桿菌科細(xì)菌的檢測(cè)方法》從表型篩選、基因檢測(cè)和基于基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrixassisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）技術(shù)等方面概述了近十種臨床檢測(cè)CRE的方法：傳統(tǒng)的紙片法初篩操作最簡(jiǎn)便，但因菌種和耐藥機(jī)制不同需選用不同的藥物敏感性試驗(yàn)紙片[8]；顯色篩選培養(yǎng)基篩選法結(jié)合特異性的顯色酶底物及特定的碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物和抑制劑鑒定菌種，但該方法的敏感性和特異性易受顯色培養(yǎng)基中抗菌藥物和抑制劑濃度影響[9]；美國(guó)疾病預(yù)防與控制中心（the Centers for Disease Control and Prevention，CDC）推薦的肉湯富集法和改良法將抗菌藥物與腸桿菌科細(xì)菌同時(shí)置于肉湯中培養(yǎng)過(guò)夜[10]，再結(jié)合改良Hodge試驗(yàn)和MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果確證CRE，結(jié)果可靠，但操作繁瑣。

美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）在2015年推薦了Carba NP試驗(yàn)（Carba NP test，CNPt）[11]，基于細(xì)菌抽提物水解亞胺培南可改變?nèi)芤簆H值的原理檢測(cè)CRE，該方法快速、成本低，無(wú)需大型設(shè)備，但需配制特定試劑，可同時(shí)檢測(cè)多種碳青霉烯酶，但僅適用于腸桿菌科細(xì)菌，且對(duì)染色體編碼的OXA型碳青霉烯酶的檢測(cè)敏感性低，也易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。CNPt是通過(guò)檢測(cè)產(chǎn)酶菌株水解對(duì)應(yīng)抗菌藥物發(fā)生的生化反應(yīng)來(lái)驗(yàn)證菌株是否產(chǎn)酶。有學(xué)者參照這一原理建立了Polymyxin NP實(shí)驗(yàn)來(lái)篩查腸桿菌科中的多黏菌素耐藥菌株[12]。唐瑜等撰寫(xiě)的《Polymyxin NP實(shí)驗(yàn)篩查腸桿菌科多黏菌素耐藥菌株臨床評(píng)價(jià)》從體外藥物敏感性試驗(yàn)、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增多黏菌素耐藥相關(guān)基因、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測(cè)多黏菌素耐藥相關(guān)的雙組分調(diào)控元件等多方面綜合評(píng)估了Polymyxin NP實(shí)驗(yàn)篩查多黏菌素耐藥腸桿菌科細(xì)菌的臨床價(jià)值，發(fā)現(xiàn)該方法操作簡(jiǎn)便，測(cè)定快速，結(jié)果可靠，可用于各種機(jī)制介導(dǎo)的多黏菌素耐藥腸桿菌科細(xì)菌的臨床篩查，可及時(shí)指導(dǎo)臨床抗感染治療。

改良碳青霉烯滅活試驗(yàn)（modified carbapenem inactivation method，mCIM）是2017年CLSI在經(jīng)典的紙片篩選及協(xié)同試驗(yàn)基礎(chǔ)上作出的改進(jìn)，mCIM將待檢菌株與10 μg美羅培南無(wú)菌紙片置于2 mL TSB肉湯共同孵育4 h后，立即將美羅培南紙片取出貼于已涂布有大腸埃希菌（ATCC 25922）的M-H平板上，孵育過(guò)夜后測(cè)量抑菌圈直徑，通過(guò)判斷菌株是否產(chǎn)碳青霉烯酶進(jìn)而判別CRE。2018年，CLSI再次更新了相關(guān)內(nèi)容，補(bǔ)充了mCIM陽(yáng)性菌株可再聯(lián)合乙二胺四乙酸改良碳青霉烯滅活試驗(yàn)（ethylenediamine tetraacetic acid-modified carbapenem inactivation method，eCIM）的結(jié)果區(qū)分產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶和絲氨酸碳青霉烯酶，以更有針對(duì)性地指導(dǎo)臨床用藥[13]。李世榮等撰寫(xiě)的《雙濃度聯(lián)合改良碳青霉烯滅活試驗(yàn)篩查CRE的臨床應(yīng)用價(jià)值》創(chuàng)新性地評(píng)估了雙濃度聯(lián)合mCIM篩查CRE的可行性及臨床應(yīng)用價(jià)值。該研究分別配制終濃度為2 μg/mL和4 μg/mL的含美羅培南標(biāo)準(zhǔn)液的TSB肉湯，孵育過(guò)夜后轉(zhuǎn)種中國(guó)藍(lán)瓊脂平板，檢查菌落生長(zhǎng)情況及菌落形態(tài)，如果2個(gè)濃度均不生長(zhǎng)，則為CRE陰性；2個(gè)濃度均生長(zhǎng)，為CRE陽(yáng)性；若2 μg/mL濃度生長(zhǎng)、4 μg/mL濃度不生長(zhǎng)，則需要進(jìn)一步做mCIM確認(rèn)CRE。以?xún)x器法分析結(jié)果為參考，雙濃度聯(lián)合mCIM方法篩查CRE的符合率、敏感性和特異性均高于98%?？傮w來(lái)說(shuō)，mCIM易操作，無(wú)需特殊設(shè)備，且能分辨多種碳青霉烯酶基因型，進(jìn)而細(xì)化臨床用藥指導(dǎo)，適合在各種醫(yī)療機(jī)構(gòu)的臨床微生物實(shí)驗(yàn)室中推廣使用，但仍然存在耗時(shí)長(zhǎng)等缺點(diǎn)[14]。

近年來(lái)，基因測(cè)序等分子生物學(xué)技術(shù)快速發(fā)展與普及，其在臨床微生物實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛，最有代表性的就是通過(guò)檢測(cè)耐藥基因快速鑒別CRE[13，15]。周宏偉等撰寫(xiě)的《碳青霉烯類(lèi)耐藥腸桿菌科細(xì)菌的檢測(cè)方法》特別闡述了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)可直接檢測(cè)各種臨床送檢樣本中的耐藥基因，在68℃條件下特異性擴(kuò)增KPC基因，且不產(chǎn)生其他β-內(nèi)酰胺酶基因的非特異性擴(kuò)增，靈敏度可達(dá)100 CFU/mL，是普通PCR的10倍，檢測(cè)時(shí)間也僅需25 min；另外，還有一種基于實(shí)時(shí)熒光PCR的高靈敏度檢測(cè)方法Xpert Carba-R，可同時(shí)快速檢測(cè)KPC、NDM、VIM、IMP和OXA-48等多種碳青霉烯酶基因，正確率超過(guò)97%，但對(duì)設(shè)備有特殊要求，且耗材成本較高。何麗華等撰寫(xiě)的《RT-PCR快速檢測(cè)產(chǎn)KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌臨床應(yīng)用評(píng)價(jià)》評(píng)估了一種國(guó)產(chǎn)試劑盒——肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯類(lèi)抗生素KPC基因檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）的性能。該研究采用RT-PCR方法直接檢測(cè)臨床樣本和菌株中肺炎克雷伯菌外膜磷脂蛋白基因blaphoE和碳青霉烯酶基因blaKPC，用于鑒定和確認(rèn)耐藥基因，同時(shí)進(jìn)行傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)和體外藥物敏感性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)RT-PCR鑒定肺炎克雷伯菌的靈敏度為100%，特異性為99.38%，與傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)法的符合率為99.56%；KPC基因檢測(cè)的靈敏度為95.56%，特異性為99.48%，與體外藥物敏感性試驗(yàn)的符合率為98.67%。該試劑盒檢測(cè)僅需2～3 h，高效、簡(jiǎn)便，可快速篩查產(chǎn)KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌，可為重癥感染患者快速提供抗感染治療的依據(jù)?？傮w來(lái)看，基于PCR的分子檢測(cè)技術(shù)與傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)和體外藥物敏感性試驗(yàn)相比，具備耗時(shí)短、敏感性和特異性高的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，有助于早期、快速明確CRE感染，幫助臨床及時(shí)、合理用藥，但PCR也存在不足：僅能對(duì)已知的編碼基因進(jìn)行擴(kuò)增，而對(duì)目前尚未發(fā)現(xiàn)的基因型無(wú)法進(jìn)行預(yù)判[16]；若該菌存在未知或罕見(jiàn)的耐藥基因，則會(huì)導(dǎo)致CRE檢測(cè)結(jié)果呈假陰性；且PCR價(jià)格昂貴，需要特定設(shè)備，對(duì)操作人員也有一定的技術(shù)要求；后續(xù)分析如體外藥物敏感性試驗(yàn)指導(dǎo)用藥仍需依賴(lài)傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法[1]。

3 CRE治療方案

CRE菌株因其耐藥譜廣，通常對(duì)所有的β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物耐藥，可供選擇的抗菌藥物有限[5，7]，臨床大多采用聯(lián)合用藥方案，但療效不佳[16]?？紤]到細(xì)菌產(chǎn)生各類(lèi)β-內(nèi)酰胺酶是造成腸桿菌科細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)耐藥的主要原因[5]，國(guó)內(nèi)外研究者們開(kāi)始對(duì)β-內(nèi)酰胺酶抑制劑尤其是新型抑制劑的開(kāi)發(fā)進(jìn)行了廣泛研究。阿維巴坦（avibactam，AVI）是一種新型的非β-內(nèi)酰胺類(lèi)的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，2015年在美國(guó)獲批，與三代頭孢菌素——頭孢他啶（ceftazidime，CAZ）組合上市，與臨床常用的抑制劑舒巴坦等相比，AVI具有抑酶效果更好、抑制譜更廣的優(yōu)點(diǎn)，該復(fù)合制劑對(duì)革蘭陰性桿菌感染有著良好的治療效果[17]。陳濤等撰寫(xiě)的《頭孢他啶/阿維巴坦單獨(dú)和聯(lián)合磷霉素對(duì)碳青霉烯類(lèi)耐藥革蘭陰性菌體外抗菌活性研究》探究了這種新型β-內(nèi)酰胺/β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合劑——CAZ/AVI聯(lián)合磷霉素對(duì)碳青霉烯類(lèi)耐藥革蘭陰性菌的體外抗菌活性。結(jié)果表明，CAZ/AVI聯(lián)合磷霉素在體外對(duì)碳青霉烯類(lèi)耐藥肺炎克雷伯菌表現(xiàn)出協(xié)同作用，不存在無(wú)關(guān)和拮抗作用，證實(shí)了該聯(lián)合方案可通過(guò)AVI靶向抑制β-內(nèi)酰胺酶，CAZ和磷霉素可以無(wú)阻礙地破壞細(xì)菌細(xì)胞壁，以2種不同的策略殺死細(xì)菌；唯一的局限是該方案對(duì)產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶的CRE缺乏有效作用。

有研究證實(shí)，CRE定植以直腸定植為主，是患者發(fā)生CRE感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，定植進(jìn)展為感染的總體風(fēng)險(xiǎn)高達(dá)17%，感染病死率也會(huì)隨之上升；目前全球普遍存在CRE定植的情況，不同的醫(yī)療機(jī)構(gòu)中CRE定植率在0.3%～5.0%[18-19]，在臨床治療CRE感染之前，對(duì)CRE定植的患者實(shí)行有效的去定植方案也是降低CRE感染率的必要手段[20]。鄒成韻等撰寫(xiě)的《碳青霉烯類(lèi)耐藥腸桿菌科細(xì)菌去定植策略研究現(xiàn)狀》主要闡述了以預(yù)防CRE定植進(jìn)展為感染的去定植策略，包括選擇性消化道凈化與糞菌移植技術(shù)，列舉了2種去定植手段的優(yōu)缺點(diǎn)以及未來(lái)需要集中解決的問(wèn)題。目前主流的去定植方法是口服氨基糖苷類(lèi)抗菌藥物、多黏菌素E或兩者的組合，最高可將定植肺炎克雷伯菌進(jìn)展為感染的風(fēng)險(xiǎn)降低80%[21]。盡管目前關(guān)于選擇性消化道凈化的研究較多，且已證實(shí)對(duì)于CRE去定植有一定的效果，但其臨床普及率卻不高，部分國(guó)家只在重癥監(jiān)護(hù)病房零星使用[22]。有研究發(fā)現(xiàn)糞菌移植實(shí)行1周后37.5%的患者無(wú)CRE定植，3個(gè)月后50%的患者無(wú)CRE定植，表明去定植效果良好，但考慮該試驗(yàn)樣本量較小，且目前相關(guān)研究還較為缺乏，糞菌移植去定植CRE的臨床可行性和安全性仍需要更大的隨機(jī)和隊(duì)列研究驗(yàn)證[23]。

4 總結(jié)

CRE是當(dāng)前最受?chē)?guó)內(nèi)外關(guān)注的耐藥性威脅之一，在我國(guó)的流行狀況也異常嚴(yán)峻，因此快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)CRE，及時(shí)選擇合適的抗感染治療方案對(duì)于降低感染率至關(guān)重要。隨著各種新技術(shù)、新方法的開(kāi)發(fā)和普及，尤其是MALDITOF MS等技術(shù)的應(yīng)用，臨床微生物實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)可以快速檢測(cè)出耐藥菌株，明確鑒別CRE，為臨床感染性疾病的預(yù)防及診治爭(zhēng)取寶貴時(shí)間。但是不同的檢測(cè)方法對(duì)不同菌種、不同耐藥基因的檢測(cè)靈敏度不同，沒(méi)有一個(gè)單一且理想的方法可以覆蓋所有的耐藥基因，全面地指導(dǎo)臨床用藥。目前對(duì)CRE感染的治療尚無(wú)國(guó)際統(tǒng)一的有效方案，需結(jié)合本地區(qū)菌株流行特征、藥物敏感性、定植與否及抗菌藥物特點(diǎn)等因素綜合考量。本專(zhuān)題的6篇文章，從檢測(cè)和治療的不同角度分別闡述了CRE實(shí)驗(yàn)室診斷方法以及相應(yīng)的治療策略，為臨床CRE感染的治療及防控提供了參考依據(jù)。希望本專(zhuān)題能幫助讀者更好地了解CRE檢測(cè)技術(shù)及防控策略，更好地服務(wù)臨床。