醫(yī)學檢驗技術在新型冠狀病毒肺炎診療中的應用

安 娜，俸家富

西南醫(yī)科大學附屬綿陽市中心醫(yī)院檢驗科，四川綿陽 621000

新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)是由一種新型β屬RNA冠狀病毒(CoV)引起的肺炎[1]。2020年2月11日，國際病毒分類學委員會將這種新型CoV命名為嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2)。

SARS-CoV-2具有極強的傳染性，主要經呼吸道飛沫傳播(噴嚏、咳嗽)和接觸傳染，存在經氣溶膠傳播的可能，人群普遍易感。SARS-CoV-2不僅潛伏期長、傳播速度快，而且感染早期臨床癥狀不典型、起病隱匿，易影響雙肺。因此，早期難以發(fā)現、容易漏診和誤診。隨著病情的加重，患者主要表現為發(fā)熱、乏力、干咳，少數患者伴有鼻塞、流涕、咽痛和腹瀉等癥狀，嚴重者快速進展為急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)[2-3]。除中國外，SARS-CoV-2很快傳播至全球，包括澳大利亞、法國、日本、馬來西亞、美國、越南等[4]近30個國家和地區(qū)，成為世界性的公共衛(wèi)生問題。

感染性疾病的診斷必須以病原學檢測結果為依據，此次極其嚴重的COVID-19疫情也不例外?？焖傺邪l(fā)的核酸檢測試劑盒為確定疑似病例是否為確診病例提供了最直接的證據，盡早檢測對于疫情防控具有重要作用，給疫情的遏制帶來了希望，但因其假陰性率較高也引起了一些疑慮。而對疾病的處理，不僅要依靠正確的診斷，還需要精準的治療和對預后的判斷。此次疫情讓更多人認識到檢驗科“看不見的醫(yī)生”在診療中所起的作用及檢驗技術不可或缺的重要性，同時也了解到醫(yī)學檢驗在疾病診療中的重要性。

1 COVID-19診斷的“金標準”

傳染性疾病，尤其烈性傳染性疾病，準確、快速地檢測出病原體對于患者的早發(fā)現、早報告、早隔離和早治療極為重要。沒有病原學檢測報告作為支撐，感染性疾病較難進行確診。病毒診斷的“金標準”是在實驗室中完成病毒的分離[5]，在武漢疫情初期，中國疾病預防控制中心應用基于二代測序(NGS)的宏基因組學技術，在短時間內完成該病毒相對豐度的鑒定，并獲取了全基因組序列[6]。在SARS-CoV-2基因組序列公布后，實時熒光反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑被快速研發(fā)[7]，截至2020年2月底，我國已有20多種用于SARS-CoV-2臨床診斷的商業(yè)試劑盒，RT-PCR檢測陽性成為COVID-19的病原學確診標準之一。另一種病原學確診的標準是“病毒基因測序，與已知的SARS-CoV-2高度同源”。

1.1NGS NGS具有測試速度快、通量高、信息量大、準確率高和成本低等優(yōu)勢[8]。NGS不僅可對標本中未知基因組序列進行測定和鑒定，用以確認未知病原體基因組信息，而且可用于未知感染性疾病宏基因組學分析和傳染病監(jiān)控。利用NGS，中國疾病預防控制中心在武漢疫情初期很快就獲得了SARS-CoV-2的全基因組序列，發(fā)現該病毒與蝙蝠CoV序列有96%的相似性，與嚴重急性呼吸綜合征(SARS)病毒序列有79.5%的相似性，確定為β屬CoV[9]。該研究為SARS-CoV-2的溯源、臨床診斷及治療方案制訂提供了科學依據，為后續(xù)進行COVID-19的病原學、免疫學和流行病學研究奠定了堅實基礎。但由于NGS對實驗室環(huán)境、裝備和人員素質的要求較高，且耗時長、價格昂貴，不適合用于SARS-CoV-2的臨床常規(guī)檢測。因此，SARS-CoV-2的“核酸檢測”幾乎成為COVID-19的“唯一”確診標準。

1.2核酸檢測 目前用于SARS-CoV-2的核酸檢測技術主要為RT-PCR。已在臨床實驗室應用多年的RT-PCR技術，其檢測體系成熟，不僅具有特異性強、靈敏度高、檢測周期短和可定量檢測的優(yōu)點，而且還能對病毒感染程度和治療效果進行動態(tài)監(jiān)測。然而，RT-PCR在SARS-CoV-2檢測應用中因陽性率低的問題，其檢測準確性受到較大質疑。造成陽性率低的原因可能主要有以下幾點。

1.2.1標本的選擇與采集 根據國家衛(wèi)生健康委員會頒布的《新型冠狀病毒感染的肺炎實驗室檢測技術指南》[10]，用于SARS-CoV-2檢測的標本類型有上呼吸道標本(如咽拭子、鼻拭子等)、下呼吸道標本(如呼吸道吸取物、支氣管灌洗液、肺泡灌洗液、深咳痰液等)、眼結膜拭子、糞便標本和抗凝血標本等，何種標本是最適標本(即陽性率最高)，至今還在探索之中。另外，SARS-CoV-2感染病程轉歸并不完全清楚，采樣最佳時機還不確定，若標本中病毒載量濃度低于檢測限時，不可避免會產生假陰性結果；再者，目前實驗室檢測結果表明下呼吸道標本SARS-CoV-2核酸檢出率更高[11]，而《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案(試行第六版)》[2](以下簡稱“《診療方案》”)推薦的首選核酸檢測標本是痰液，但臨床送檢的多數為上呼吸道標本，以及標本采集質量的差異，都將不可避免地導致結果為假陰性。

1.2.2RNA不穩(wěn)定性 RNA病毒核酸穩(wěn)定性較差，易受環(huán)境條件和實驗器材等諸多方面影響而自行降解，易導致假陰性。

1.2.3試劑盒質量 已有研究證實，SARS-CoV-2基因組結構自上而下依次由5′非翻譯區(qū) (UTR)、轉錄酶復合物(orf1ab)、S基因、E基因、M基因、N基因和3′UTR及幾個未知非閱讀編碼框序列組成[12]。采用RT-PCR檢測SARS-CoV-2核酸就需按此特定結構進行引物設計。理論上，檢測的靶標越多，其靈敏度就越高。但實際研發(fā)中，靶標越多，引物和探針的設計就越復雜，這無疑給方法設計和產品加工增加更大難度。根據美國疾病預防控制中心的推薦，特異度最高的orf1ab為確診靶標，E基因是一線篩查靶標，N基因是附加確診靶標[13]。因此，現有SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒根據靶標可分為單靶標(orf1ab)、雙靶標(orf1ab+N基因/E基因)和三靶標(orf1ab+N基因+E基因)。靶標設計的不完全，自然就會導致檢出率下降。此外，應急研發(fā)生產的SARS-CoV-2檢測試劑盒缺乏完整的臨床應用驗證和方法學驗證，擴增區(qū)突變和試劑批間差異可導致結果假陰性；另外，RNA提取方法所用檢測試劑缺乏質量保證，通常用于擴增的標本量是以體積計算而非RNA拷貝數來衡量，現有檢測試劑盒的檢測下限多數是500 copy/mL，個別是200 copy/mL，如果標本中RNA水平更低，可能影響最終的擴增效果，導致結果呈假陰性。

此外，還有很多影響SARS-CoV-2檢測分析前、中、后的因素，如采樣時期、標本保存與運送、實驗室操作和結果判斷與解讀，任何環(huán)節(jié)出現問題均可導致結果不可靠。

2 非“金標準”的實驗室檢測指標

針對RT-PCR對COVID-19病原學確診標準靈敏度較低和準確性差的缺點，臨床醫(yī)生和實驗室工作人員必然要對“非核酸檢測”之外的實驗室指標加以關注和重視。

2.1輔助診斷 COVID-19由SARS-CoV-2感染所致，患者血常規(guī)指標與其他病毒感染有相似的變化特征，即COVID-19發(fā)病早期外周血中白細胞計數正?；驕p少，淋巴細胞計數減少，多數患者C-反應蛋白(CRP)和紅細胞沉降率升高，降鈣素原(PCT)正常，在繼發(fā)感染患者中PCT水平會升高(0.5 ng/mL)[14-16]。

人體感染病毒后，免疫系統(tǒng)會產生抗體，IgM是機體感染后產生的早期抗體，提示現階段被感染的狀態(tài)；而IgG抗體在感染中晚期出現，滴度出現持續(xù)增高，并在血液循環(huán)中存在較長時間，提示既往存在感染[17]。因此，檢測特異抗體也可以明確患者是否“近期或既往感染”SARS-CoV-2，有助于核酸檢測陰性但臨床上疑似患者的確診。

2.2疾病嚴重度判斷 《診療方案》中指出，COVID-19重癥患者D-二聚體(D-D)水平升高、外周血淋巴細胞進行性減少[2]。D-D水平可反映血液凝集狀態(tài)，而SARS-CoV-2感染的重癥患者會出現凝血功能障礙，發(fā)生ARDS后，D-D水平會有不斷升高的表現[14]，醫(yī)生可根據D-D水平掌握病情進展情況。

淋巴細胞是機體免疫系統(tǒng)執(zhí)行免疫功能、發(fā)揮細胞免疫和體液免疫的物質基礎。外周血中淋巴細胞進行性減少，提示患者免疫功能逐漸下降[18]，病情更加嚴重。

因此，臨床醫(yī)生可監(jiān)測COVID-19患者血漿D-D水平和外周血中淋巴細胞數量，分析判斷患者病情的嚴重程度，掌握疾病進展情況，必要時及時調整治療措施或采取針對性的治療方案。

2.3鑒別診斷 根據中東呼吸綜合征(MERS)的診斷經驗，MERS-CoV在感染早期較易漏診，其臨床表現與甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒和鼻病毒等引起的社區(qū)感染性肺炎相似，而大多數MERS-CoV感染在醫(yī)院內暴發(fā)都與診斷延遲有關[19]。SARS-CoV-2感染所致COVID-19的臨床特征也與普通病毒性肺炎相似[15]。進行呼吸道病原體的檢測可以很好地將SARS-CoV-2與流感病毒、副流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒等已知病毒性肺炎進行鑒別，甚至還可與支原體、衣原體肺炎鑒別。即使是COVID-19確診患者，也能判斷其是否合并有其他病原微生物感染，給治療決策提供可靠的病原微生物檢測依據。相反，若呼吸道病原體檢測全部呈陰性，而臨床表現又具有病毒性肺炎的特征，即使SARS-CoV-2核酸檢測呈陰性，也能提示臨床醫(yī)生對此類患者應持以高度警惕。

COVID-19重型患者在發(fā)病1周后出現呼吸困難[2]，而肺栓塞患者也多有呼吸困難發(fā)生，但是肺栓塞時血漿D-D呈陰性，對于門診的一般發(fā)熱患者，D-D的陰性檢測結果可用于肺栓塞的排除診斷。因此，D-D呈陰性，既能預示COVID-19患者疾病嚴重度較低，也能提示醫(yī)生該患者沒有合并肺栓塞。此外，B型鈉尿肽(BNP)/N末端B型鈉尿肽(NT-proBNP)是診斷心力衰竭的首選指標，通過檢測BNP/NT-proBNP，可以幫助患者排除因心力衰竭導致的呼吸困難。

2.4療效監(jiān)測 COVID-19患者確診后的治療監(jiān)測，除影像學外，最直接、快速地反映治療方案是否合理的證據就是實驗室檢測指標。根據《診療方案》，SARS-CoV-2感染可分為輕型、普通型、重型和危重型。重型和危重型患者多伴有肝、腎、心臟和凝血系統(tǒng)損傷等多器官、多系統(tǒng)的急性損傷甚至衰竭[2]。因此，SARS-CoV-2感染者常常通過高頻次檢測相關血液體液指標，以監(jiān)測疾病進展情況，適時調整處理和治療方案，避免病情惡化。

2.4.1心肌損傷監(jiān)測 《診療方案》中明確提出了將心肌肌鈣蛋白(cTn)和肌紅蛋白(MYO)作為COVID-19患者疾病監(jiān)測指標[2]。而MYO水平在心肌損傷后1.5 h即可增高，有助于早期診斷。cTn是心肌損傷時血清中出現的特異性標志物，病情較為嚴重的COVID-19患者，因呼吸系統(tǒng)受損，氧合不足，導致心肌缺血性損傷，引起血液中cTn水平增加[16]。

COVID-19重型病例多在1周后出現呼吸困難，嚴重者快速進展為ARDS、感染性休克、凝血功能障礙，引發(fā)肺外各系統(tǒng)損害。BNP/NT-proBNP和D-D水平檢測可鑒別呼吸困難是心源性或肺源性，患者是否有肺栓塞存在。因此，有學者建議采用新的“心臟3項”(包括cTn、BNP/NT-proBNP和D-D)作為心肌損傷診斷的標志物，原因為新的3項指標可綜合反映心臟結構變化、心臟功能變化，并從病因學和病理生理學兩個方面整體評估心臟結構和功能的改變[14]。因此，“心臟3項”首先用于胸痛和呼吸困難初步評估，鑒別和排除是否存在心肌梗死、肺栓塞和心力衰竭，以便進一步對患者進行風險評估，進而根據風險分層實施精準治療，觀察療效，還可對患者預后進行評估。

2.4.2肝、腎功能損傷監(jiān)測 重癥、危重癥COVID-19患者大多數都存在肝臟和(或)腎功能損傷[14]，因此，SARS-CoV-2感染患者一旦確診，無論疾病程度輕重，均需要常規(guī)性地監(jiān)測患者肝、腎功能，以降低患者并發(fā)癥的發(fā)生風險[2]。已有研究表明，COVID-19患者血清乳酸脫氫酶(LDH)水平明顯升高，而清蛋白(Alb)水平降低；部分患者血清肌酐(SCr)水平增高[14]。由于對SARS-CoV-2的認識尚在探索之中，因此，感染者即使確診后也以對癥治療為主，仍然有不少患者發(fā)展成重癥和危重癥，很快發(fā)展為ARDS[2]。由于個體差異，一些患者難免出現繼發(fā)感染，引發(fā)肺外系統(tǒng)疾病如肝、腎功能損傷和呼吸衰竭。有研究報道，在MERS疫情期間多達50%的病例有急性腎損傷[19]。但是，監(jiān)測腎功能早期損傷的SCr并非是首選標志物，急性腎損傷應選中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白和胱抑素C，慢性腎損傷應選腎小球濾過率和尿Alb與尿肌酐比。

2.4.3細胞因子風暴綜合征(CSS) 細胞因子是免疫原、絲裂原等刺激誘導多種細胞產生的一類相對分子質量低于30×103的可溶性蛋白，在細胞間的信息傳遞過程中起重要作用。肺內細胞因子經刺激產生或自分泌后，經肺泡上皮細胞、間質細胞、成纖維細胞及血管內皮細胞等放大作用產生更多的細胞因子，形成“瀑布”效應，即細胞因子風暴。因此，當機體受病原微生物感染后，CSS刺激免疫系統(tǒng)，短時間內釋放大量炎性介質入血，從而導致全身性炎癥反應綜合征的發(fā)生，引起多器官損傷、衰竭和ARDS等疾病[20]。HUANG等[14]對SARS-CoV-2感染患者的早期觀察研究中闡述了CSS，并且從細胞因子水平論述了COVID-19與SARS的不同之處，為臨床診療提供了較高的價值。SARS-CoV-2感染者容易出現CSS，導致肺組織大量釋放炎性因子，同時肺發(fā)生纖維化，從而導致缺血、缺氧。有研究證實，CSS發(fā)生可導致肝衰竭、心力衰竭、急性腎損傷和凝血功能障礙等多系統(tǒng)、多器官病變[15]。凝血激活可能會導致彌散性血管內凝血(DIC)和靜脈血栓栓塞癥(VTE)。因此，對于COVID-19患者，尤其是重危癥患者進行多系統(tǒng)、高頻次的實驗室指標監(jiān)測，以防止CSS進一步導致多系統(tǒng)、多器官急性損害的發(fā)生極為重要。

由此可見，SARS-CoV-2感染后除監(jiān)測患者血常規(guī)、尿常規(guī)、CRP、肝功能、腎功能、凝血功能、心肌損傷標志物、動脈血氣等外，還應該監(jiān)測患者炎性細胞因子，如白細胞介素(IL)-2、腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-6、干擾素(IFN)-γ等[2]，如果細胞因子水平出現增高，需嚴防CSS的發(fā)生，以及進而引發(fā)的患者器官損傷甚至衰竭。

2.4.4凝血功能障礙 COVID-19患者D-D水平增高，嚴重者發(fā)生出血和凝血功能障礙[2]?；罨糠帜蠲笗r間、凝血酶原時間、凝血酶時間和纖維蛋白原常稱作凝血4項，為凝血功能相關疾病的篩查指標，但其對凝血過程進行分解檢驗，不能反映凝血整體過程，其結果與臨床常有不符。纖維蛋白原降解產物與D-D在輔助診斷DIC和深靜脈血栓等疾病時較凝血4項更有價值，但受其他可能導致纖維蛋白降解的因素影響，對纖溶亢進的檢測特異度較低。血栓彈力圖檢測能對患者發(fā)生血栓風險進行準確評估，準確診斷繼發(fā)和原發(fā)纖溶亢進?？鼓浮⒌鞍證和蛋白S可監(jiān)測易栓癥和靜脈血栓栓塞癥的形成。

SARS-CoV-2感染的重癥患者與危重癥患者在發(fā)病1周后出現呼吸困難和(或)低氧血癥，嚴重者快速進展為ARDS、膿毒癥休克、難以糾正的代謝性酸中毒和凝血功能障礙[2]。因此，血氣分析也在COVID-19患者危重程度分級及治療監(jiān)測方面有極大的指導價值。

對于COVID-19患者，尤其是重癥患者與危重癥患者實施多系統(tǒng)、多方位的監(jiān)測，可更好更準地實現對疾病病情的監(jiān)控，進而實施精準治療。

2.5預后評價 重癥肺炎會導致患者多器官衰竭，增加心臟負擔，心肌損傷是COVID-19的常見并發(fā)癥之一，特別是重癥患者，根據血清中cTn水平可對患者的心肌損傷程度和預后風險作出判斷?；加行呐K基礎疾病的患者，較易發(fā)生心力衰竭等惡性事件，BNP/NT-proBNP的檢測可用于確診和排除診斷，還可評估急性冠狀動脈綜合征的危險分級及心臟功能，并可對預后進行判斷。COVID-19患者較易發(fā)生肝臟和(或)腎臟損傷，檢測肝功能指標如天門冬氨酸氨基轉移酶、總膽紅素、Alb等可對預后進行判斷，腎功能預后評估仍依賴于尿蛋白定量，ARDS和年齡是急性腎功能不全的重要危險因素，而急性腎功能不全是預測病死率的獨立危險因素[21]，有效的肝、腎功能監(jiān)測和預后評估對于延長患者生存期有重要意義。

此外，血清中IL-2R和IL-6表達水平可預測COVID-19患者的病情嚴重程度和預后情況[15]。CRP可反映由病毒引起炎癥的嚴重程度，并且與肺部的免疫病理損害有關，其水平升高增加了呼吸衰竭和死亡的風險，因此預示了不良的預后[22]。CRP和PCT檢測也可評價合并細菌感染患者的預后情況。而IgM作為感染早期抗體，其滴度與呼吸道感染癥狀的嚴重程度密切相關，也可間接反映病毒在體內的增殖情況，IgM的檢測對預后判斷也有一定幫助。

3 總 結

基因測序與核酸檢測可提供診斷COVID-19的依據。而患者治療則依賴除此之外的“非核酸檢測”指標。此次疫情中，核酸檢測技術在疾病診斷中的重要性已顯而易見，但在對確診患者實施精準治療中，需要對“非核酸檢測”指標進行及時、準確的監(jiān)測，才能正確選擇藥物、確定療效、評估預后，進而遏制病情惡化，使患者得以早日康復。