腸道類器官的構(gòu)建及應(yīng)用*

孫霞，詹麗杏

中國科學(xué)院營養(yǎng)代謝與食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/上海營養(yǎng)與健康研究所/中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所 上海 200031

類器官（organoids）是一種衍生于干細(xì)胞并具備三維結(jié)構(gòu)的培養(yǎng)模型[1]。體外培養(yǎng)的類器官含有特定組織或器官的各種成熟細(xì)胞，因此可以部分模擬其生理功能[2]。自2009年荷蘭科學(xué)家Hans Clevers等[3]第一次用成體干細(xì)胞（即小腸干細(xì)胞）培育出具備小腸絨毛和隱窩結(jié)構(gòu)的腸道類器官以來，組織類器官培養(yǎng)技術(shù)飛速發(fā)展，在2013年和2017年分別被《Science》和《Nature Methods》雜志評為年度十大進(jìn)展和突破。目前，研究人員已成功培養(yǎng)出多種類器官，比如結(jié)腸[4-5]、肝[6]、胰腺[7]、前列腺[8-9]、胃[10]、 乳腺[11]等。這些類器官不但保持原器官穩(wěn)定的表型和遺傳學(xué)特征，而且可以在體外長期培養(yǎng)，并可以冷凍保存[2]。除了來源于健康組織的類器官，多種來源于腫瘤的類器官也構(gòu)建成功。與傳統(tǒng)2D細(xì)胞培養(yǎng)模式相比，3D培養(yǎng)的類器官結(jié)構(gòu)能更好地模擬組織器官的生成及病理過程，因而在基礎(chǔ)研究以及轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

腸道類器官作為發(fā)展比較早的類器官模型之一，近幾年研究進(jìn)展迅速。目前，腸道類器官的培養(yǎng)主要來源于兩種干細(xì)胞類型，分別是富含亮氨酸重復(fù)序列G蛋白偶聯(lián)受體5陽性（leucine-rich re?peat-containing G-protein coupled receptor 5，LGR5+）成體干細(xì)胞和多能干細(xì)胞（pluripotent stem cell，PSC）[12]。類器官模型建立以來，特別是人源腸道類器官建立以來[4]，被廣泛用于炎癥性腸病、腸道損傷再生、腸癌等多種腸道疾病的研究?，F(xiàn)就腸道類器官的構(gòu)建以及其應(yīng)用做一述評。

1 腸道類器官的體外構(gòu)建及培養(yǎng)

1.1 腸道干細(xì)胞

腸道上皮由隱窩—絨毛這個(gè)基本單位構(gòu)成[13]，腸道干細(xì)胞就位于隱窩的底部，它們快速分裂增殖產(chǎn)生過渡擴(kuò)增（transit amplifying，TA）細(xì)胞[14]。TA細(xì)胞沿著隱窩向上遷移并生長至絨毛兩側(cè)，同時(shí)伴隨著增殖分化，最終形成成熟且完全分化的腸功能細(xì)胞，包括腸上皮吸收細(xì)胞、潘氏細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、內(nèi)分泌細(xì)胞等[13]。2007年，Hans Clevers等[15]利用體內(nèi)譜系示蹤技術(shù)，發(fā)現(xiàn)LGR5+僅表達(dá)于隱窩底部柱狀細(xì)胞表面，證實(shí)LGR5+細(xì)胞是真正的腸道干細(xì)胞。LGR5是一種跨膜蛋白，與配體R-spondin1結(jié)合可增強(qiáng)Wnt-β-catenin信號通路[16]。在隱窩底部，LGR5+干細(xì)胞與潘氏細(xì)胞交錯(cuò)排列，CD24+潘氏細(xì)胞可以表達(dá)表皮生長因子EGF、Wnt激動(dòng)劑Wnt3A、轉(zhuǎn)化生長因子TGF-α、Notch配體Dll4，這些因子可以促進(jìn)干細(xì)胞的增殖分化[17]。

1.2 腸道類器官的建立

自從腸干細(xì)胞特異性標(biāo)記物L(fēng)gr5得到鑒定以后，腸道干細(xì)胞的研究得到了迅速發(fā)展。2009年Hans Clevers等[3]，首次利用小鼠Lgr5+干細(xì)胞在體外培養(yǎng)出3D小腸絨毛狀上皮空心球體結(jié)構(gòu)，至此類器官研究時(shí)代到來，而腸道類器官的建立為其他類器官的建立提供了基礎(chǔ)。他們是將整個(gè)隱窩結(jié)構(gòu)或者單個(gè)Lgr5+干細(xì)胞種植到基質(zhì)膠中，然后利用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基中有三種必須的生長因子：R-spondin1、EGF、Noggin。其中R-spondin1是Wnt激動(dòng)劑，同時(shí)也是Lgr5的配體，在體內(nèi)可以導(dǎo)致隱窩的大量增殖[18]；EGF信號主要促進(jìn)小腸細(xì)胞的增殖[19]；Noggin是BMP通路抑制劑，可以增加類器官中隱窩數(shù)量[20]。對于結(jié)腸類器官，還需要加入Wnt3A來維持干細(xì)胞的自我更新及分化能力，因?yàn)榻Y(jié)腸中沒有分泌Wnt3A的潘氏細(xì)胞[4]。通過這種方法培養(yǎng)出來的類器官，極化的上皮細(xì)胞緊密連接形成中空的管腔樣結(jié)構(gòu)，腔內(nèi)有凋亡脫落下的細(xì)胞。隨著類器官的生長，干細(xì)胞可通過出芽的方式向外突出生長形成更多的隱窩狀結(jié)構(gòu)。且類器官中含有各種腸上皮細(xì)胞，各細(xì)胞比例也和體內(nèi)一樣，潘氏細(xì)胞和內(nèi)分泌細(xì)胞也可以向腔內(nèi)分泌物質(zhì)，吸收細(xì)胞也具備吸收功能[21]。除了用這種基質(zhì)膠和生長因子培養(yǎng)類器官外，同年，Kuo實(shí)驗(yàn)室[22]運(yùn)用氣液交互（air-liquid interface，ALI）培養(yǎng)技術(shù)也培養(yǎng)出腸道類器官。

相比較于小鼠腸道類器官的建立，人源類器官的建立相對更加復(fù)雜。2011年，Hans Clevers等[4]成功構(gòu)建出可以長期培養(yǎng)的人源腸道類器官。該團(tuán)隊(duì)首先用小鼠類器官基本培養(yǎng)基WENR（Wnt3A、EGF、Noggin、R-spondin）來構(gòu)建人源結(jié)腸類器官，剛開始細(xì)胞會存活，但是后來會在一周內(nèi)逐漸死亡。研究人員通過篩選發(fā)現(xiàn)，除了加入基本生長因子外，還需要添加一些激素和維生素類物質(zhì)，如加入胃泌素（gastrin）和煙酰胺（nicotinamide），可以延長類器官的存活時(shí)間；另外加入A83-01（ALK4/5/7抑制劑）和SB202190（p38抑制劑），可以抑制類器官的死亡，提高類器官形成率。在這樣的培養(yǎng)條件下，人源結(jié)腸類器官呈現(xiàn)出芽狀結(jié)構(gòu)，增殖的干細(xì)胞處于出芽部位，人源小腸類器官構(gòu)建成功。腸道類器官經(jīng)過傳代培養(yǎng)，可以存活6個(gè)月以上，并且可以保持基因型不變。這種培養(yǎng)基可以用于人類腸道類器官的長期培養(yǎng)與擴(kuò)增，但卻不能像小鼠類器官那樣可以分化為各種腸上皮細(xì)胞。有趣的是如果在擴(kuò)增培養(yǎng)基基礎(chǔ)上去除Wnt3A、nicotin?amide和SB202190，則可以誘導(dǎo)腸干細(xì)胞分化為各種終末分化結(jié)腸上皮細(xì)胞[4]。

1.3 腸道腫瘤類器官的建立

類器官培養(yǎng)不僅可以來源正常組織，還可以來源于腫瘤組織，構(gòu)建形成腫瘤類器官。同樣，將結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）組織消化后種植于基質(zhì)膠中，用類器官培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)出來的腫瘤類器官沒有與之對應(yīng)的正常類器官長得快，可能的原因是腫瘤類器官有絲分裂失敗率較高，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡[23-24]。為了構(gòu)建比較單純的腫瘤類器官，培養(yǎng)皿中正常類器官需要去除。因此，制定只適合腫瘤類器官培養(yǎng)的選擇性培養(yǎng)基非常重要，由于腫瘤組織某些促存活的信號通路被異常激活，因此可能不需要某些生長因子。比如，在大多數(shù)CRC中，Wnt信號特異性激活，培養(yǎng)這類腸癌類器官時(shí)可以去除Wnt和R-spondin1[4]，而這兩種因子對正常組織類器官培養(yǎng)非常重要；同樣，對于存在EGFR通路突變的CRC，可以去除EGF[23,25-26]；nutlin-3通過抑制E3泛素連接酶MDM2穩(wěn)定p53，可以用來培養(yǎng)p53突變的結(jié)腸癌類器官[23]；如果存在p38突變，則不需要加入p38抑制劑SB202190來維持生長[4,25,27]；在晚期CRC中，癌細(xì)胞對氧濃度比較敏感，在低氧情況下可能更適宜腫瘤類器官的培養(yǎng)[25]。通過不同生長因子的組合及建立不同培養(yǎng)環(huán)境，可以構(gòu)建出各種突變類型的腸癌類器官。通過這種方法培養(yǎng)出來的類器官保留了原腫瘤的組織病理學(xué)特征以及基因穩(wěn)定[27]，可以應(yīng)用于腫瘤的基礎(chǔ)研究以及轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)。

2 腸道類器官的應(yīng)用

2.1 腸道干細(xì)胞及發(fā)育研究

腸道類器官培養(yǎng)技術(shù)可以用于研究干細(xì)胞的各種特性，包括存活、自我增殖以及體外的長期培養(yǎng)。該技術(shù)結(jié)合各種基因工程小鼠的譜系示蹤實(shí)驗(yàn)，可用于鑒定腸道干細(xì)胞特異性標(biāo)志物[2]。Spence等[28]首次利用人多能干細(xì)胞（hPSC）體外誘導(dǎo)成為小腸類器官，利用此系統(tǒng)可以模擬小腸發(fā)育過程以及研究人類先天性腸組織發(fā)育缺陷的分子基礎(chǔ)，并且在體外直接證明了轉(zhuǎn)錄因子NEUROG3對腸內(nèi)分泌細(xì)胞的發(fā)育至關(guān)重要。Múnera等[29]鑒定出一條進(jìn)化上保守的BMP-Hox通路，這條通路調(diào)控結(jié)腸的發(fā)育，在體外短暫激活BMP信號可以促使hPSC發(fā)育成為結(jié)腸類器官，通過建立不同區(qū)域的腸道類器官可以用來研究腸道如何產(chǎn)生區(qū)域化干細(xì)胞。

2.2 腸道疾病的研究

腸道類器官模型可用于腸道疾病的研究?？梢杂脕碓从谘装Y性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）患者的干細(xì)胞構(gòu)建IBD類器官模型。此種類器官在體外可以長期培養(yǎng)，并具有穩(wěn)定遺傳學(xué)特征和生物特性，可以用來研究腸炎發(fā)生的分子機(jī)制[30]。囊性纖維化（cysticfibrosis，CF）可由單個(gè)基因CFTR突變引起，導(dǎo)致腸黏液過度分泌和粘度增加，從而影響腸道功能[31]。利用CF患者的腸干細(xì)胞構(gòu)建的這些類器官可以保持與患者基因型一致以及腸細(xì)胞的異常功能，因此有助于CF診斷、發(fā)病機(jī)制研究以及藥物研發(fā)等[32]。腸道類器官為研究腸道菌群及病毒感染提供了有效的模型，例如C.艱難梭狀芽孢桿菌、腸道沙門氏菌、輪狀病毒和腸出血性大腸桿菌等腸道病原體與人腸道上皮的相互作用已經(jīng)用此模型得到證明[33]。研究表明將艱難梭狀芽孢桿菌微注射到小腸類器官管腔中，發(fā)現(xiàn)鈉吸收蛋白NHE3表達(dá)下調(diào)引起艱難梭狀芽孢桿菌相關(guān)的腹瀉[34]。如果將鼠傷寒沙門氏菌微注射到小腸道類器官中，它能夠入侵上皮屏障并且改變類器官的轉(zhuǎn)錄譜，并以此來探究沙門氏菌引起腸炎的分子機(jī)制[35]。

2.3 腸道再生修復(fù)

腸道類器官的建立可以在體外利用腸干細(xì)胞培養(yǎng)出大量類器官，這為腸道的再生修復(fù)提供了條件。早在2012年，Yui等[36]通過在體外培養(yǎng)結(jié)腸類器官，并將其移植到DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)類器官可以到達(dá)損傷的上皮位置，修復(fù)損傷的腸道。這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)如果能運(yùn)用到人類身上，可以取患者少量腸道干細(xì)胞，通過離體培養(yǎng)擴(kuò)增源自患者的類器官，最后將其移植到靶向病灶，令腸道上皮再生治愈腸道疾病。科學(xué)家們可以使用hPSC來誘導(dǎo)產(chǎn)生腸道類器官，相信更復(fù)雜的腸道類器官的建立可能會為患者提供專用的“備用零件”來修復(fù)受損的組織。例如，James Wells等[37]利用hPSC在體外將腸道類器官和神經(jīng)祖細(xì)胞結(jié)合在一起，成功構(gòu)建出具有神經(jīng)系統(tǒng)的腸道類器官。如果將此系統(tǒng)植入小鼠體內(nèi)，類器官生長6～10周出現(xiàn)血管化，并形成高度成熟的腸道組織，其中包含的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞會整合到腸道黏膜層控制腸蠕動(dòng)。這是再生醫(yī)學(xué)的一個(gè)主要進(jìn)步性標(biāo)志，腸道類器官的出現(xiàn)為其在腸道再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究開辟了一條新道路。

3 腸道腫瘤類器官的應(yīng)用

3.1 創(chuàng)建腫瘤類器官生物樣本庫（biobanks）

目前，研究者分析的大部分樣本僅代表原發(fā)腫瘤，而轉(zhuǎn)移通常提示癌癥的致命階段。而患者來源的腫瘤類器官PDO（patient-derived organoids）可以擴(kuò)大腫瘤樣本，從而能夠在任何階段對癌癥進(jìn)行分析[38]。2015年，Hans Clevers等第一次成功構(gòu)建了20個(gè)不同突變類型CRC患者的腫瘤和與之對應(yīng)的正常組織類器官庫。測序發(fā)現(xiàn)PDO保留了原CRC患者的基因組和轉(zhuǎn)錄組，利用這些類器官庫可以進(jìn)行大通量的藥物篩選，研究人員發(fā)現(xiàn)只有Wnt拮抗劑泛素連接酶RNF43突變的腫瘤類器官才會對Wnt分泌抑制劑LGK974敏感[27,39]。較多數(shù)量的類器官可以驗(yàn)證特定突變類型CRC與已知藥物的相關(guān)性，并且可以篩選出起作用的藥物。隨后，研究人員利用此腸癌類器官庫，分析類器官的蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組，指出蛋白質(zhì)組對腫瘤治療非常重要[40]。后來，Sato實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了來源于55位CRC患者的腫瘤類器官庫，根據(jù)不同CRC基因突變類型，用不同培養(yǎng)基培養(yǎng)，進(jìn)一步提高了PDO的成功率。并且將培養(yǎng)的PDO移植到免疫缺陷小鼠的腎囊中，還可以保持組織病理學(xué)特征，這表明可以利用PDO在更復(fù)雜的體內(nèi)環(huán)境中來評估藥物的敏感性[25]。目前，各個(gè)癌癥研究所都致力于建立更完善的類器官庫，使之成為有利的公共研究資源，為腫瘤的藥物篩選和個(gè)性化治療提供條件，有助于促進(jìn)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展。

3.2 作為腫瘤模型研究結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制

傳統(tǒng)的二維（2D）腫瘤細(xì)胞系培養(yǎng)和動(dòng)物人源性腫瘤異種移植物（primary patient-derived tumour xenografts，PDTXs）長期以來一直被用做腫瘤模型，并為癌癥研究做出了巨大貢獻(xiàn)。但是細(xì)胞系由于大量傳代可能經(jīng)歷了遺傳變異，不能保持原始腫瘤的遺傳異質(zhì)性，而PDTXs成功概率比較低。腫瘤類器官模型可以避開了這些缺點(diǎn)，它既保持了原腫瘤在體內(nèi)的生物學(xué)特性和遺傳學(xué)特征，又便于操作、成功率高，成為一種新興的腫瘤研究模型[41]。

由于PDO可以從不同發(fā)展階段的腫瘤組織中獲得，并且可以保留腫瘤的病理特征和異質(zhì)性[27]。因此可以用PDO對不同階段CRC進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組化分析及表觀分析，發(fā)現(xiàn)隨著腫瘤發(fā)展基因突變率增加，可獲得新的突變特征，腫瘤異質(zhì)性增加[42]。同樣的結(jié)果在來源于正常小鼠和Apcmin/+小鼠的類器官中也被發(fā)現(xiàn)，隨著正常細(xì)胞向癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，類器官累計(jì)突變不斷增加，疾病進(jìn)展加速[43]。在研究組織癌變的過程中，類器官可用于模擬和研究CRC的發(fā)生發(fā)展過程，如對正常類器官進(jìn)行基因編輯以獲得CRC進(jìn)展模型。Drost等[44]通過使用CRISPR/Cas9技術(shù)，對CRC中四個(gè)常見的突變基因APC、p53、KRAS和SMAD4依次進(jìn)行編輯，發(fā)現(xiàn)四種基因都突變的類器官可以不依賴于外源生長因子存活，并且證明APC和p53的缺失是導(dǎo)致CRC的關(guān)鍵。當(dāng)把具有四種基因突變的類器官皮下移植到小鼠中時(shí)，它雖然可以有效生長但不能自發(fā)轉(zhuǎn)移，但是將其原位移植到小鼠盲腸時(shí)發(fā)現(xiàn)，這些類器官誘導(dǎo)發(fā)生的CRC能夠自發(fā)轉(zhuǎn)移，說明腸道類器官微環(huán)境對于腫瘤的轉(zhuǎn)移非常重要。類似的，在正常結(jié)腸類器官中引入Braf V600E突變可以構(gòu)建鋸齒狀結(jié)腸癌模型，利用此模型證明TGFβ信號促使鋸齒狀結(jié)腸癌向預(yù)后更差的間充質(zhì)型結(jié)腸癌亞型轉(zhuǎn)變[45]。由此腫瘤類器官培養(yǎng)與基因編輯技術(shù)相結(jié)合，極大地促進(jìn)了CRC的研究進(jìn)展。

通過特異性消除LGR5+干細(xì)胞的類器官模型可以研究腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells，CSCs）對CRC發(fā)展的作用，研究提示殺傷CSCs并不能直接導(dǎo)致原發(fā)腫瘤的消退，但是其對CRC肝轉(zhuǎn)移的形成和維持是必須的[46]。同樣，Shimokawa等[47]對CRC類器官進(jìn)行小鼠腎囊移植，然后通過可誘導(dǎo)的caspase9對LGR5+干細(xì)胞進(jìn)行敲除，結(jié)果顯示雖然腫瘤出現(xiàn)短暫退化，此后由KRT20標(biāo)記的分化腫瘤細(xì)胞可轉(zhuǎn)變?yōu)長GR5+CSCs，從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，可見腫瘤細(xì)胞具有很強(qiáng)的可塑性。利用類器官也可以作為研究菌群及其代謝物對CRC的作用，Ruben van Boxtel和Hans Clevers研究組對培養(yǎng)的腸道類器官內(nèi)腔進(jìn)行pks+大腸桿菌注射，發(fā)現(xiàn)pks+大腸桿菌產(chǎn)生的毒性物質(zhì)Co?libactin可以引起人腸道類器官中的雙鏈內(nèi)交聯(lián)以及DNA雙鏈損傷，進(jìn)而造成癌變的發(fā)生。在結(jié)直腸癌患者的DNA中也發(fā)現(xiàn)了相似的突變模式，從而將人體內(nèi)的微生物與驅(qū)動(dòng)癌癥發(fā)生發(fā)展的遺傳變異建立了直接聯(lián)系[48]。利用類器官模型研究腸道微生物與CRC的關(guān)系，為結(jié)直腸癌發(fā)病機(jī)制和治療提供了重要工具。

3.3 腫瘤藥物篩選和個(gè)性化治療

盡管2D培養(yǎng)的腸癌細(xì)胞系一直用于檢測藥物反應(yīng)，但細(xì)胞系無法完全代表CRC的各種亞型，因此2D實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能全面體現(xiàn)在體療效[49]。而PDO能夠很好地保留患者腸癌的基因組特征，由此可以進(jìn)行大規(guī)模的藥物篩查，為不同患者制定個(gè)體化治療提供幫助。腫瘤類器官庫的建立為患者藥物篩選和精準(zhǔn)治療提供了條件和可能性。Hans Clevers等[50]利用囊性纖維化（CF）患者的類器官來檢測其對各種藥物的反應(yīng)。他們測試了源自荷蘭600名囊性纖維化患者的類器官，通過觀察藥物是否能夠引起類器官膨脹來決定該藥物是否對患者起作用。在腫瘤治療中，與化療藥物的普遍性殺傷不同，免疫療法具有較高的特異性。E.Voest實(shí)驗(yàn)室[51]利用外周血單核細(xì)胞與肺癌或結(jié)直腸癌腫瘤類器官共培養(yǎng)誘導(dǎo)出一群腫瘤特異性T細(xì)胞。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)這群腫瘤殺傷性T細(xì)胞不會攻擊正常組織類器官，或可在回輸進(jìn)患者體內(nèi)后起到抗腫瘤效果。此類研究提示了利用腫瘤類器官進(jìn)行免疫療法的可能性。

4 類器官局限與展望

以上總結(jié)了類器官的建立以及在腸道疾病和腫瘤中的作用，但許多研究都處于起始階段，仍然有很多困難需要克服。比如相對于細(xì)胞系來說，類器官的培養(yǎng)耗費(fèi)較大的時(shí)間和費(fèi)用。此外，類器官的培養(yǎng)缺少血管和免疫細(xì)胞，預(yù)期今后可將類器官與包括免疫細(xì)胞共培養(yǎng)等來解決此類問題。另外，當(dāng)類器官體積增加時(shí)缺氧和缺乏生長因子會導(dǎo)致類器官壞死，因此需要適當(dāng)激活血管生成途徑以此促進(jìn)類器官的存活。另一個(gè)需要解決的問題是目前類器官的培養(yǎng)基是小鼠來源的基質(zhì)膠，這對人源的類器官的培養(yǎng)可能并不是最合適的。目前，一種新合成的“水凝珠”能夠支持小鼠和人源類器官的生長，它可能會用于代替小鼠來源的基質(zhì)膠[52]。最后，目前所構(gòu)建的類器官都來源于上皮細(xì)胞，非上皮細(xì)胞類器官的建立還沒有構(gòu)建成功。雖然類器官有一些局限性，但是它的應(yīng)用前景非常廣泛，類器官的發(fā)展是未來轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)不可或缺的基石。