潛伏性結(jié)核感染進(jìn)展為活動(dòng)性結(jié)核病的機(jī)制研究

馬慧敏 張麗帆 劉曉清

據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，2019年全球新發(fā)結(jié)核病患者近1000萬(wàn)例，死亡患者約141萬(wàn)例；估算我國(guó)新發(fā)結(jié)核病患者83.3萬(wàn)例，占結(jié)核病患者總數(shù)的8.4%，僅次于印度(26%)和印度尼西亞(8.5%)，居世界第三位。全世界約有1/4的人感染了結(jié)核分枝桿菌，其中約5%～10%的人最終會(huì)發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核病[1]。通過預(yù)防性抗結(jié)核治療阻止?jié)摲越Y(jié)核感染(LTBI)進(jìn)展為活動(dòng)性結(jié)核病是世界衛(wèi)生組織消滅結(jié)核病戰(zhàn)略的關(guān)鍵措施之一。因此，研究LTBI進(jìn)展為活動(dòng)性結(jié)核病的機(jī)制，對(duì)發(fā)現(xiàn)LTBI再活動(dòng)的標(biāo)志物，評(píng)估再活動(dòng)的風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)而對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)感染者進(jìn)行預(yù)防性治療具有重要意義，對(duì)降低結(jié)核病發(fā)病率，控制結(jié)核病疫情至關(guān)重要[2]。

一、結(jié)核分枝桿菌感染后進(jìn)程

LTBI進(jìn)展為活動(dòng)性結(jié)核病，需要滿足2個(gè)獨(dú)立的生物學(xué)事件：首先，機(jī)體感染結(jié)核分枝桿菌，但沒有活動(dòng)性結(jié)核病的臨床癥狀、影像學(xué)異常及病原學(xué)證據(jù)，即進(jìn)入LTBI狀態(tài)[2]。在此期間，結(jié)核分枝桿菌以休眠菌的形式存在于LTBI 者的巨噬細(xì)胞內(nèi)，并在感染部位招募炎癥細(xì)胞聚集形成肉芽腫，肉芽腫組織內(nèi)部的免疫反應(yīng)導(dǎo)致組織內(nèi)缺氧、營(yíng)養(yǎng)不足和低pH值等微環(huán)境，進(jìn)一步抑制了被包裹在其中的結(jié)核分枝桿菌的生長(zhǎng)[3]。同時(shí)，結(jié)核分枝桿菌可通過改變自身特征和代謝途徑以適應(yīng)宿主內(nèi)環(huán)境，逃避機(jī)體免疫應(yīng)答，長(zhǎng)期存活于人體內(nèi)。第二，休眠的結(jié)核分枝桿菌由于各種原因被激活、增殖、播散，病原與宿主免疫的平衡被打破，最終發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核病[4]。

二、LTBI進(jìn)展為活動(dòng)性結(jié)核病的免疫學(xué)改變

結(jié)核感染的免疫學(xué)機(jī)制十分復(fù)雜，潛伏感染為一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，固有免疫和適應(yīng)性免疫對(duì)于維持潛伏感染的狀態(tài)至關(guān)重要。

1. 固有免疫：固有免疫主要控制早期結(jié)核分枝桿菌感染[5]。肺泡巨噬細(xì)胞是首先與結(jié)核分枝桿菌接觸并發(fā)揮抗結(jié)核作用的固有免疫細(xì)胞，肺泡巨噬細(xì)胞抗微生物機(jī)制包括吞噬-溶酶體融合、募集溶酶體酶、產(chǎn)生活性氧和氮物質(zhì)、自噬和細(xì)胞凋亡等[6]。樹突狀細(xì)胞也是早期發(fā)揮抗結(jié)核作用的細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞能夠橋接固有免疫和適應(yīng)性免疫，通過其抗原呈遞能力、共刺激能力和分泌細(xì)胞因子啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答[7]。中性粒細(xì)胞是固有免疫細(xì)胞的主要亞群，結(jié)核分枝桿菌感染機(jī)體后中性粒細(xì)胞即遷移至感染部位，產(chǎn)生并分泌多種抗微生物酶，以控制巨噬細(xì)胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的生長(zhǎng)[8]。另外，自然殺傷細(xì)胞能夠被病原菌直接活化，或者被巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子——白細(xì)胞介素(IL)-12間接活化?；罨蟮淖匀粴?xì)胞不僅可以產(chǎn)生γ干擾素(IFN-γ)激活巨噬細(xì)胞，繼而殺滅胞內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌[9]，還可以釋放穿孔素和顆粒溶素，通過依賴由激酶介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑殺滅胞外的結(jié)核分枝桿菌[10]。Roy等[11]用多個(gè)隊(duì)列綜合分析以確定針對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染的階段特異性宿主反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)循環(huán)中自然殺傷細(xì)胞在結(jié)核分枝桿菌潛伏期增加，活動(dòng)性疾病期相應(yīng)減少，臨床治愈后則可恢復(fù)至基線水平，自然殺傷細(xì)胞外周血中水平的變化可以表明疾病進(jìn)展和對(duì)治療的反應(yīng)情況。

2. 適應(yīng)性免疫：適應(yīng)性免疫包括細(xì)胞免疫和體液免疫。其中，T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫是機(jī)體抗結(jié)核最主要的免疫機(jī)制。結(jié)核病患者多存在免疫功能異常，最常見的是細(xì)胞免疫功能低下、免疫功能受抑制等。其中T細(xì)胞亞群數(shù)量、百分比及相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)是決定細(xì)胞免疫強(qiáng)弱的主要因素，能夠介導(dǎo)和調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)平衡[12]，而人體內(nèi)抗結(jié)核保護(hù)性細(xì)胞免疫主要依賴CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞[13]。

CD4+T細(xì)胞分泌的輔助性T 細(xì)胞(Th細(xì)胞)1(Th1細(xì)胞)和Th17細(xì)胞因子是結(jié)核分枝桿菌感染過程中的關(guān)鍵效應(yīng)因子[14]。Th1細(xì)胞通過分泌IFN-γ激活巨噬細(xì)胞對(duì)控制包括結(jié)核分枝桿菌在內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)病原體至關(guān)重要[15-18]。研究表明，Th1細(xì)胞可分泌IFN-γ和腫瘤壞死因子α(TNF-α)激活巨噬細(xì)胞，控制結(jié)核分枝桿菌感染。其作用機(jī)制包括產(chǎn)生活性氧和氮中間產(chǎn)物、溶酶體酶攻擊和自噬，以及激活下游抗菌效應(yīng)通路[19]。Th17細(xì)胞可分泌多種效應(yīng)細(xì)胞因子，如IL-17、IL-17F、IL-21和IL-22。有文獻(xiàn)表明，Th17通過分泌IL-17招募中性粒細(xì)胞和IFN-γ+CD4+T細(xì)胞控制結(jié)核分枝桿菌感染，并通過下調(diào)IL-10和上調(diào)IL-12的水平，協(xié)同Th1細(xì)胞免疫反應(yīng)發(fā)揮抗結(jié)核作用[20]。此外，有研究表明Th17還與中性粒細(xì)胞炎癥和組織病理?yè)p傷有關(guān)[21]。Th1和Th17誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫反應(yīng)受許多因素影響，包括細(xì)胞因子和代謝產(chǎn)物的促炎和抗炎作用。打破這些因素之間的平衡可能會(huì)導(dǎo)致不同的結(jié)果，或有利于保護(hù)性Th1/Th17反應(yīng)，或可能會(huì)抑制這些反應(yīng)導(dǎo)致感染無(wú)法控制[22]。

CD8+T細(xì)胞可識(shí)別由主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)I類分子提供的抗原，通過釋放細(xì)胞因子，引起細(xì)胞毒性和誘導(dǎo)直接的殺菌活性來控制結(jié)核分枝桿菌感染[23-24]。Li等[25]研究發(fā)現(xiàn)，肺結(jié)核患者CD4+T細(xì)胞水平會(huì)降低，但CD8+T細(xì)胞水平會(huì)升高，而抗結(jié)核治療可逆轉(zhuǎn)這些影響。提示Th1/CD8+T細(xì)胞效應(yīng)因子水平的恢復(fù)可能是肺結(jié)核患者治療后的重要免疫事件，并進(jìn)一步提示這些免疫指標(biāo)作為預(yù)測(cè)結(jié)核病進(jìn)展和預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物的重要性。另外，各細(xì)胞亞群比例也能反映機(jī)體抗結(jié)核免疫的狀態(tài)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)亦表明，肺結(jié)核小鼠模型的CD4+T細(xì)胞數(shù)量減少，而CD8+T 細(xì)胞數(shù)量增高，CD4+/CD8+T細(xì)胞比值較健康小鼠明顯降低，且CD4+/CD8+T細(xì)胞比值降低是結(jié)核病嚴(yán)重的重要指標(biāo)之一[26]。研究還發(fā)現(xiàn)，在HIV感染者中，單核細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的比例與發(fā)生活動(dòng)性結(jié)核病的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，可用于評(píng)估結(jié)核活動(dòng)風(fēng)險(xiǎn)[27]。

近年來，體液免疫的作用逐漸被重視。皮內(nèi)接種卡介苗可誘導(dǎo)機(jī)體分泌識(shí)別多種分枝桿菌抗原的IgG和IgM，這些抗體可通過多種機(jī)制增強(qiáng)抗結(jié)核分枝桿菌感染的細(xì)胞和體液免疫，包括加速吞噬體融合，促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)抗原的清除，并通過其調(diào)節(jié)炎癥的能力影響分枝桿菌感染的結(jié)果[28-29]?？贵w識(shí)別結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞的機(jī)制尚不完全清楚，Nimmerjahn和Ravetch[30]發(fā)現(xiàn)抗體可以直接識(shí)別受感染細(xì)胞上的抗原，與可溶性細(xì)菌抗原形成免疫復(fù)合物，通過胞飲作用/內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，繼而激活抗體的可結(jié)晶片段(fragment crystallizable，F(xiàn)c)，F(xiàn)c段變構(gòu)發(fā)揮免疫抗菌活性。Fc受體(Fc receptor，F(xiàn)cR)與結(jié)核病的免疫調(diào)節(jié)有關(guān)，缺乏激活FcR的小鼠表現(xiàn)出增強(qiáng)的免疫病理?yè)p傷和細(xì)菌負(fù)荷增加，而缺乏抑制性FcR的小鼠則減少了免疫病理?yè)p傷[31]。同樣，高親和力FcγRI的高表達(dá)和低親和力FcγRIIIb的丟失與結(jié)核病的加重有關(guān)[32-33]。抗體還可以通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度來影響結(jié)核分枝桿菌感染的結(jié)果。如某些抗體(如IgM)可以通過激活補(bǔ)體表現(xiàn)出促炎特性，而其他抗體(如IgG)則可以表現(xiàn)出促炎或抗炎特性，具體結(jié)果取決于抗原和FcR受體參與的情況[34]。另外，對(duì)MVA85A疫苗試驗(yàn)的分析顯示，Ag85A特異性IgG滴度升高被確定為降低結(jié)核病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)因素，這表明抗體在結(jié)核分枝桿菌感染保護(hù)性免疫中的作用[35]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)，B細(xì)胞的耗竭可導(dǎo)致病變細(xì)菌負(fù)荷增加[36]。Joosten等[37]分析了處于結(jié)核分枝桿菌感染和疾病不同階段的患者外周血B細(xì)胞的數(shù)量和功能。結(jié)果顯示，結(jié)核分枝桿菌感染可導(dǎo)致B細(xì)胞數(shù)量減少，剩余的B細(xì)胞免疫球蛋白生成功能受損，并且與LTBI者相比，活動(dòng)性結(jié)核病患者的損傷更為突出。

三、誘發(fā)LTBI再活動(dòng)的影響因素

(一)宿主因素

誘導(dǎo)LTBI進(jìn)展為活動(dòng)性結(jié)核病的主要因素包括宿主和細(xì)菌這2個(gè)方面，其中宿主免疫狀態(tài)的改變是LTBI進(jìn)展為活動(dòng)性結(jié)核病最直接的原因。而多種疾病狀態(tài)可導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降，如HIV感染者和AIDS患者、糖尿病患者，以及應(yīng)用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、生物制劑和放化療進(jìn)行治療的風(fēng)濕免疫病患者、惡性腫瘤患者、透析和實(shí)體器官或骨髓移植者等。這些人群由于免疫功能低下，有較高的LTBI 再活動(dòng)風(fēng)險(xiǎn)，且結(jié)核分枝桿菌感染后易播散，病情危重。

1. HIV感染者和AIDS患者：Harries等[38]研究表明，HIV感染者發(fā)生活動(dòng)性結(jié)核病的風(fēng)險(xiǎn)是未感染者的16～27倍。HIV主要攻擊人體的CD4+T細(xì)胞，導(dǎo)致其數(shù)量明顯減少、細(xì)胞功能下降甚至缺失，從而導(dǎo)致機(jī)體病灶內(nèi)處于休眠狀態(tài)的結(jié)核分枝桿菌復(fù)燃或機(jī)體再次受結(jié)核分枝桿菌感染后形成新的感染灶，同時(shí)也可通過初染而迅速進(jìn)展為活動(dòng)性結(jié)核病。隨著HIV感染者CD4+T 細(xì)胞數(shù)量和功能不斷下降，機(jī)體免疫系統(tǒng)更加無(wú)法控制結(jié)核分枝桿菌的生長(zhǎng)和播散，加快了新感染者和LTBI者進(jìn)展為活動(dòng)性結(jié)核病的進(jìn)程[39]。

2. 其他免疫受損人群：很多疾病需要應(yīng)用免疫抑制劑進(jìn)行治療和控制疾病進(jìn)展，如風(fēng)濕免疫病、腫瘤、器官移植、炎癥性腸病患者等。這部分人群由于疾病本身或相關(guān)的治療導(dǎo)致免疫抑制，相比于一般人群進(jìn)展為活動(dòng)性結(jié)核病的風(fēng)險(xiǎn)升高。抗TNF-α的免疫治療在這類人群中具有重要意義，但該治療會(huì)導(dǎo)致由TNF-α介導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞募集障礙而不能形成肉芽腫[40]，下調(diào)巨噬細(xì)胞中的可誘導(dǎo)型一氧化氮合酶及其對(duì)結(jié)核分枝桿菌的抗菌活性[41]，損傷自然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞功能[42]。此外，抗TNF-α治療還會(huì)導(dǎo)致通過產(chǎn)生顆粒溶素殺死胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的CD8+T細(xì)胞在治療中的缺失[43]。因此，接受抗TNF-α治療的患者極易導(dǎo)致LTBI進(jìn)展為活動(dòng)性結(jié)核病或結(jié)核病的復(fù)發(fā)。

3. 糖尿病：糖尿病患者結(jié)核病的發(fā)病率是普通人群的3倍[44]。糖尿病不僅會(huì)增加結(jié)核分枝桿菌感染的概率[45]和疾病嚴(yán)重程度的風(fēng)險(xiǎn)[46]，并且會(huì)增加結(jié)核病患者治療期間復(fù)發(fā)、多耐藥及死亡的風(fēng)險(xiǎn)[47]。Dooley和Chaisson[48]研究證實(shí)，在糖尿病患者中，抑制結(jié)核分枝桿菌增殖所必需的固有免疫和適應(yīng)性免疫(如IFN-γ)被削弱，與非糖尿病患者相比，糖尿病患者的IFN-γ水平明顯降低。糖尿病并發(fā)LTBI者，抗原特異的Th1和Th17型細(xì)胞因子，如IL-1、IL-18和IL-10總體水平減少。因此，糖尿病患者感染結(jié)核分枝桿菌后細(xì)胞因子數(shù)量減少，從而導(dǎo)致感染不易被控制，這可能是此類人群活動(dòng)性結(jié)核病高發(fā)的免疫機(jī)制[49]。

(二)細(xì)菌因素

除了宿主，細(xì)菌也是決定疾病轉(zhuǎn)歸的重要因素，結(jié)核分枝桿菌的毒力和數(shù)量在其致病過程中至關(guān)重要。結(jié)核分枝桿菌是典型的胞內(nèi)寄生菌，雖然無(wú)毒株和有毒株均可進(jìn)入吞噬細(xì)胞，但只有有毒株才具有對(duì)抗吞噬細(xì)胞殺滅并在吞噬細(xì)胞中存活和復(fù)制的特性。

1. 毒力基因：毒力基因的表達(dá)是結(jié)核分枝桿菌致病的第一步，如表達(dá)Mig基因的分枝桿菌菌株可明顯增強(qiáng)抵抗巨噬細(xì)胞的能力[50]，nuoG基因可通過NADH-1復(fù)合體的酶活性發(fā)揮抑制巨噬細(xì)胞凋亡和促進(jìn)分枝桿菌毒力的功能[51]，Mtbici基因編碼的異檸檬酸裂解酶和RpoV基因編碼的分枝菌酸環(huán)丙烷合酶是結(jié)核分枝桿菌在宿主中持續(xù)感染的關(guān)鍵毒力因子[52-53]。結(jié)核分枝桿菌感染宿主時(shí)，這些毒力基因在有毒株中表達(dá)，將其剔除或突變后可滅活或降低有毒株的毒力。

2．毒力相關(guān)因子：結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁上的脂甘露聚糖(lipomannan，LM)和脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan，LAM)也是結(jié)核分枝桿菌致病的主要毒力相關(guān)因子，LM可以破壞機(jī)體的抗結(jié)核免疫，使其向非保護(hù)性免疫應(yīng)答轉(zhuǎn)變，同時(shí)LAM可以通過結(jié)合巨噬細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞表面的受體而引起機(jī)體的免疫抑制[54]。再者，早期分泌抗原靶蛋白6(ESAT-6)、培養(yǎng)濾液蛋白10(CFP-10)和抗原85復(fù)合物(Ag85)等，在巨噬細(xì)胞的黏附、侵襲、細(xì)胞溶解和逃避細(xì)胞溶解中起著重要作用，是結(jié)核病發(fā)病相關(guān)的重要毒力因子[55]?？梢傻慕Y(jié)核分枝桿菌毒力因子還有很多，包括侵襲性蛋白、溶血素、細(xì)胞毒素、熱休克蛋白、硫酯等。這些分枝桿菌毒力因子可以直接或間接作用于宿主細(xì)胞導(dǎo)致組織的破壞及疾病的發(fā)生。

3．調(diào)控巨噬細(xì)胞凋亡：被結(jié)核分枝桿菌感染的吞噬細(xì)胞只有發(fā)生凋亡后才可殺死寄生于其內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌，并激活鄰近未感染的吞噬細(xì)胞，進(jìn)一步增強(qiáng)機(jī)體對(duì)結(jié)核分枝桿菌的殺傷能力。結(jié)核分枝桿菌調(diào)控巨噬細(xì)胞凋亡與結(jié)核分枝桿菌毒力密切相關(guān)，強(qiáng)、弱毒株對(duì)宿主細(xì)胞調(diào)控機(jī)制不同，其感染巨噬細(xì)胞的結(jié)局也大相徑庭。Spira等[56]應(yīng)用結(jié)核分枝桿菌強(qiáng)毒株H37Rv和弱毒株H37Ra同時(shí)感染人肺泡巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)弱毒株比強(qiáng)毒株可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生更多的凋亡；同時(shí)應(yīng)用微陣列技術(shù)檢測(cè)不同毒力的結(jié)核分枝桿菌感染人巨噬細(xì)胞后基因表達(dá)譜的變化，發(fā)現(xiàn)一系列促凋亡基因在強(qiáng)毒株感染細(xì)胞后表達(dá)下調(diào)。

除了結(jié)核分枝桿菌的毒力在結(jié)核病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，感染結(jié)核分枝桿菌的數(shù)量也至關(guān)重要。面對(duì)大量細(xì)菌，機(jī)體將無(wú)法控制結(jié)核分枝桿菌的生長(zhǎng)、增殖、播散。Rich[57]的研究證明，在同一例患者中，大的病變傾向于發(fā)展而小的病變則受到限制，轉(zhuǎn)移性病變與原發(fā)性病變的不同之處在于轉(zhuǎn)移性病變通常是局限性的，細(xì)菌生長(zhǎng)可受到控制也說明了這一點(diǎn)。

綜上所述，機(jī)體由LTBI進(jìn)展為活動(dòng)性結(jié)核病的機(jī)制復(fù)雜，結(jié)核分枝桿菌可長(zhǎng)期以休眠狀態(tài)存活于宿主體內(nèi)，也能被重新激活進(jìn)展為活動(dòng)性結(jié)核病，感染的結(jié)局與宿主的免疫狀態(tài)和結(jié)核分枝桿菌的毒力及數(shù)量有關(guān)。其中宿主免疫狀態(tài)的改變是打破平衡的始動(dòng)因素，研究宿主免疫機(jī)制，關(guān)注誘發(fā)結(jié)核活動(dòng)的危險(xiǎn)因素，預(yù)測(cè)結(jié)核活動(dòng)風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)而對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)人群實(shí)施預(yù)防性抗結(jié)核治療，對(duì)于降低結(jié)核病發(fā)病率意義重大。此外，通過深入理解結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)的免疫功能特征，亦有助于尋找預(yù)測(cè)LTBI進(jìn)展為活動(dòng)性結(jié)核病的生物標(biāo)志物，以及新型結(jié)核病疫苗的研制。