拉曼光譜技術(shù)在乳腺癌臨床應(yīng)用方面的研究進(jìn)展

申李勝男,李思敏，李 倩，麻 帥，韓 冰

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院乳腺外科，吉林 長(zhǎng)春 130021)

2018年，世界衛(wèi)生組織宣布有62.7萬(wàn)女性死于乳腺癌，占女性因惡性腫瘤死亡人數(shù)的15%，全世界約有200萬(wàn)新確診病例[1]。在過(guò)去的幾十年里，全球乳腺癌發(fā)病率持續(xù)增加，其中發(fā)達(dá)地區(qū)的發(fā)病率更高[2-4]。乳腺癌篩查通常采用影像學(xué)(鉬靶和超聲相結(jié)合)和體格檢查的方式，可疑為乳腺癌的患者需進(jìn)行穿刺或切除活檢，其中70%～90%的患者在活檢中確診為良性，患者承受了不必要的創(chuàng)傷、巨大的精神壓力和高額的醫(yī)療費(fèi)用[5-6]。乳腺癌保乳手術(shù)采用不同顏色染料標(biāo)記切除病灶各個(gè)切緣，應(yīng)用石蠟病理判斷切緣是否有病灶殘留，但該方法耗時(shí)長(zhǎng)，無(wú)法在當(dāng)次手術(shù)中確定切緣情況，導(dǎo)致保乳手術(shù)的二次手術(shù)率高達(dá) 17%，增加了患者身心痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，因此急需一種無(wú)創(chuàng)、方便和即時(shí)的技術(shù)進(jìn)行判斷。拉曼光譜具有無(wú)需樣品制備、對(duì)樣品無(wú)接觸、不破壞樣品結(jié)構(gòu)、分析簡(jiǎn)便快速和分辨率高等特點(diǎn)，因而可應(yīng)用于疾病的預(yù)測(cè)、診斷及療效判斷。近年來(lái)，拉曼光譜檢測(cè)技術(shù)不斷完善，且統(tǒng)計(jì)學(xué)方法廣泛應(yīng)用于拉曼光譜結(jié)果的分析，使探索應(yīng)用腫瘤的拉曼光譜特點(diǎn)進(jìn)行診斷成為新的研究熱點(diǎn)，目前國(guó)內(nèi)外綜述內(nèi)容主要集中于拉曼光譜技術(shù)在細(xì)胞和組織中的研究結(jié)果及光譜歸屬等方面，但拉曼光譜測(cè)量?jī)x器以及拉曼光譜技術(shù)的改進(jìn)、乳腺癌拉曼光譜臨床應(yīng)用的相關(guān)綜述國(guó)內(nèi)尚無(wú)報(bào)道。本文作者系統(tǒng)回顧了近年來(lái)拉曼光譜測(cè)量?jī)x器以及拉曼光譜技術(shù)的變化，對(duì)拉曼光譜在乳腺癌細(xì)胞系和組織檢測(cè)的研究進(jìn)展及其臨床意義以及拉曼光譜臨床應(yīng)用時(shí)待解決的問(wèn)題和未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行綜述。

1 乳腺癌臨床研究中拉曼光譜技術(shù)的進(jìn)展

拉曼光譜檢測(cè)儀器與方法的改進(jìn)促進(jìn)了拉曼光譜技術(shù)在乳腺癌中的研究。最初的檢測(cè)方法是自發(fā)拉曼光譜(Raman spectroscopy)，當(dāng)光被物質(zhì)散射時(shí)，絕大部分光子會(huì)發(fā)生彈性散射，還有一小部分光子會(huì)與介質(zhì)分子發(fā)生非彈性碰撞，散射光子與分子相互作用產(chǎn)生能量交換，這種現(xiàn)象稱為非彈性散射。拉曼散射效應(yīng)最早由印度物理學(xué)家 RAMAN C.V.發(fā)現(xiàn)，激發(fā)光使用可見(jiàn)光或者近紅外光，降低了水的吸收，使得拉曼光譜可應(yīng)用于體液或者液體環(huán)境下細(xì)胞的測(cè)量[7]。

但是生物樣本(組織、細(xì)胞和體液)的自發(fā)信號(hào)弱，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，易受熒光干擾。1973年表面增強(qiáng)拉曼散射光譜(surface-enhanced Raman spectroscopy, SERS)首次在吸附于粗糙銀電極的吡啶上觀察到，與傳統(tǒng)的拉曼散射方法相比有幾個(gè)數(shù)量級(jí)的增強(qiáng)。SERS的增強(qiáng)機(jī)制目前認(rèn)為主要有2種：第1種為電磁場(chǎng)增強(qiáng)機(jī)制,激發(fā)光刺激惰性貴金屬(金和銀等)納米顆粒產(chǎn)生等離子激元，等離子激元與拉曼活性分子相互作用，導(dǎo)致分子拉曼光譜信號(hào)增強(qiáng)105～1010倍[8]；第2種為化學(xué)增強(qiáng)機(jī)制,樣本表面分子與金屬表面的成鍵等相互作用，從而使分子拉曼光譜信號(hào)增強(qiáng)。雖然測(cè)量物質(zhì)與增強(qiáng)劑不需要接觸就能發(fā)生SERS增強(qiáng)，但在1～30 nm范圍內(nèi)SERS增強(qiáng)效應(yīng)較強(qiáng)[9-11]，因此在術(shù)中檢測(cè)應(yīng)用時(shí)應(yīng)加入生物相容性較好的納米顆粒，檢測(cè)位點(diǎn)應(yīng)盡量接近納米顆粒。

共振拉曼光譜(resonance Raman scattering, RRS)入射光頻率與分子電子躍遷頻率一致時(shí)相應(yīng)分子的光譜增強(qiáng)102～106倍，當(dāng)共振分子光譜增強(qiáng)時(shí)未共振光譜信息被湮滅，而無(wú)需加入任何樣本的預(yù)處理。即使在拉曼光譜信號(hào)復(fù)雜的樣品中，RRS只提供部分分子的信息，降低光譜的復(fù)雜性而便于識(shí)別。但RRS易受熒光背景的影響，應(yīng)使用短波長(zhǎng)的激發(fā)光加以避免，而短波長(zhǎng)激發(fā)光容易造成組織損傷，不適合用于活體檢測(cè)。

移頻激發(fā)差分拉曼光譜(shifted-excitation Raman difference spectroscopy, SERDS)通過(guò)拉曼光譜和熒光光譜對(duì)激發(fā)光波長(zhǎng)的依賴程度不同，有效解決了生物樣本檢測(cè)拉曼光譜時(shí)熒光干擾的困擾[12-13]，因此成為避免熒光干擾最常用的手段。在一定的范圍內(nèi)，隨著激發(fā)波長(zhǎng)的變化熒光光譜幾乎不會(huì)發(fā)生改變，而激發(fā)波長(zhǎng)對(duì)拉曼光譜中熒光有很大影響。采用2個(gè)相近頻率的激發(fā)光照射樣品，對(duì)得到的2組光譜進(jìn)行差分處理消除熒光的干擾，可得到只包含拉曼光譜信息的數(shù)據(jù)。SERDS檢測(cè)正常乳腺組織、纖維腺瘤和浸潤(rùn)性乳腺癌，判斷是否含有病變組織的敏感度和特異度均達(dá)到100%[14]。相干拉曼散射(coherent Raman scattering, CRS)是一個(gè)典型的采用皮秒脈沖激光器的三維非線性過(guò)程，CRS通過(guò)相干激勵(lì)增強(qiáng)信號(hào)，可以大幅縮短數(shù)據(jù)采集時(shí)間。當(dāng)泵振動(dòng)和斯托克斯振動(dòng)頻率與分子的振動(dòng)頻率發(fā)生共振時(shí)，將有4種主要的CRS過(guò)程同時(shí)發(fā)生：相干反斯托克斯拉曼散射(coherent anti-stokes Raman scattering spectrum,CARS)、相干斯托克斯拉曼散射(coherent stokes Raman scattering spectrum,CSRS)、受激拉曼增益(stimulated Raman gain,SRG)和受激拉曼損耗(stimulated Raman loss,SRL)。通常在 CARS 過(guò)程中還會(huì)伴有非共振的四波混頻信號(hào)，這種非共振背景將導(dǎo)致 CARS 光譜與自發(fā)拉曼光譜相比發(fā)生線型變化，使得 CARS 信號(hào)難以簡(jiǎn)單地被解釋。而對(duì)于指紋區(qū)成像，由于 CARS 信號(hào)很容易被強(qiáng)大的非共振背景淹沒(méi)，如何減輕乃至消除非共振背景干擾也是 CARS 成像所面臨的一大挑戰(zhàn)[15]。與CARS比較，受激拉曼散射(stimulated Raman scattering,SRS)成像最大的優(yōu)點(diǎn)在于沒(méi)有非共振的背景，其光譜線型與自發(fā)拉曼光譜完全一致，因而 SRS 信號(hào)的分配和解釋可以直接參考已經(jīng)發(fā)表的拉曼光譜文獻(xiàn)。兩者均可以同時(shí)獲得整個(gè)激發(fā)態(tài)譜，實(shí)現(xiàn)了生物組織的成像，但是需要可調(diào)諧脈沖激光器探測(cè)樣品中的不同分子，因此很難將激光有效地耦合和同步到手持或便攜式術(shù)中設(shè)備中。

空間偏移拉曼光譜(spatial offset Raman spectroscopy,SORS)提供了一種對(duì)深部組織樣品進(jìn)行非侵入性研究的方法[16-17]，其具有抑制表層成分拉曼光譜和熒光背景干擾的能力。光譜探測(cè)位置與激發(fā)光入射位置不同，當(dāng)激光入射到樣本表面并透射入表層物質(zhì)內(nèi)部時(shí)，其中一部分散射光子經(jīng)過(guò)多次散射后達(dá)到組織深層, 并與深層組織成分發(fā)生拉曼散射,攜帶深層組織物質(zhì)信息的拉曼散射光子在探測(cè)位置進(jìn)行分析[18]，目前已有研究[19-20]將SORS用于檢測(cè)假酒、評(píng)估骨成分以及分析乳腺癌組織中的微鈣化等方面。將羥磷灰石、單水草酸鈣以及 3.5% 碳酸鹽置入8.7 mm 厚的雞乳腺組織中，采用SORS檢測(cè)正常乳腺組織下的癌癥邊緣，證實(shí)了拉曼光譜檢測(cè)新鮮乳腺組織內(nèi)微鈣化灶的可行性。最近一些科學(xué)家將SORS與SERS的優(yōu)點(diǎn)相結(jié)合用來(lái)檢測(cè)深部樣本的拉曼信號(hào)，NICOLSON等[21]采用便攜式拉曼光譜儀檢測(cè)埋于組織中的三維乳腺腫瘤模型，結(jié)果表明其跟蹤乳腺腫瘤的深度達(dá)25 mm,為臨床應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。

2 拉曼光譜在乳腺癌細(xì)胞系中的應(yīng)用

乳腺癌很可能轉(zhuǎn)移到骨骼、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)臟，導(dǎo)致預(yù)后不良和總體生存率降低[22-23]，因此通過(guò)乳腺癌的拉曼光譜特點(diǎn)早期發(fā)現(xiàn)乳腺癌可降低乳腺癌患者的病死率。研究者[24-25]運(yùn)用拉曼光譜、原子力顯微鏡(AFM)、光學(xué)顯微鏡探索正常乳腺細(xì)胞系(MCF-10A)與乳腺癌細(xì)胞系(MDA-MB-231, MDA-MB-453)之間的差異與聯(lián)系，采用主成分分析法(principal component analysis,PCA)分析拉曼光譜，得出正常乳腺細(xì)胞系(MFC-10A)和乳腺癌細(xì)胞系(MDA-MB-231, MDA-MB-453)的拉曼光譜主要波峰為苯基丙氨酸帶、酰胺Ⅰ和Ⅲ帶、CH2變形、CH2擺動(dòng)/扭轉(zhuǎn)和S-S鍵振動(dòng)帶。在2種乳腺癌細(xì)胞系中，酰胺Ⅰ、CH2變形帶的強(qiáng)度類似，但是乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231有較強(qiáng)的CH2變形帶，運(yùn)用這些波峰特征可以有效地區(qū)分3種細(xì)胞系，為拉曼光譜診斷乳腺癌奠定基礎(chǔ)。

指導(dǎo)惡性腫瘤治療的2個(gè)重要指標(biāo)是“腫瘤反應(yīng)”和“疾病進(jìn)展”。腫瘤反應(yīng)是指在治療早期對(duì)治療效果進(jìn)行評(píng)估，疾病進(jìn)展為癌癥的增長(zhǎng)和擴(kuò)散，代表治療失敗。腫瘤進(jìn)展包括多種機(jī)制，其中基質(zhì)、血管生成、炎癥、免疫系統(tǒng)、激素和外源性生物制劑發(fā)揮著重要作用，所有這些機(jī)制均會(huì)引起組織生化水平的變化[26-28]，因此識(shí)別癌組織的生化變化可以評(píng)估腫瘤的轉(zhuǎn)移潛能、侵襲性和疾病進(jìn)展，有助于制定治療決策。MARRO等[29]發(fā)現(xiàn)：乳腺癌細(xì)胞趨向性與氨基酸、線粒體信號(hào)水平降低有關(guān)。MIGNOLET等[30]在MCF-7細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)了4種使胞內(nèi)脂類增加的多酚，并且其與細(xì)胞凋亡有關(guān)。研究[31-32]顯示：乳腺癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與細(xì)胞表面糖脂和糖蛋白的唾液酸化有關(guān)聯(lián)。ABRAMCZYK等[33]發(fā)現(xiàn)：隨著細(xì)胞侵襲性增加，細(xì)胞核仁組蛋白乙?；缴?；甲基伸縮振動(dòng)隨著惡性程度增加，拉曼光譜發(fā)生藍(lán)移。放療是乳腺癌治療手段之一，研究者[34-35]采用拉曼光譜研究輻射對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和MCF-7的影響，結(jié)果表明：拉曼光譜可評(píng)估細(xì)胞內(nèi)糖原水平的變化，將其用于惡性腫瘤潛在標(biāo)志物和對(duì)放射治療耐藥機(jī)制的研究。研究者[36-37]采用拉曼光譜研究了乳腺癌耐藥性與HER-2基因過(guò)表達(dá)的關(guān)系，結(jié)果表明：拉帕替尼的耐藥性與HER-2基因過(guò)表達(dá)有關(guān)，在HER-2基因過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中脂類增加，蛋白減少；接受拉帕替尼治療后，HER-2基因陽(yáng)性的細(xì)胞中脂類仍在增加。在治療過(guò)程中，研究乳腺癌組織的拉曼光譜變化，可以確定治療方法是否有效、是否需要修改，并有助于確定臨床研究中進(jìn)展終點(diǎn)的時(shí)間。

3 拉曼光譜在乳腺組織中的應(yīng)用

拉曼光譜對(duì)乳腺癌組織的研究經(jīng)歷了從體外到體內(nèi)、從組織切片到新鮮組織的過(guò)程，正常乳腺腺體與病變?nèi)橄俳M織拉曼光譜的差異主要集中在胡蘿卜素、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)。乳腺良性與惡性病變拉曼光譜的主要差異為胡蘿卜素和脂肪酸，利用酰胺Ⅰ和CH2彎曲振動(dòng)的比值作為鑒別參數(shù)，可以區(qū)分正常乳腺組織和惡性乳腺組織。惡性組織特點(diǎn)為脂類含量下降、核酸和蛋白增加及結(jié)構(gòu)紊亂(分子氫鍵斷裂)。 研究[38-40]顯示：類胡蘿卜素的拉曼光譜是惡性腫瘤表現(xiàn)出的關(guān)鍵特征；癌前病變、導(dǎo)管內(nèi)癌和浸潤(rùn)性癌組織中，DNA 的磷酸骨架伸縮振動(dòng)譜線的特征峰藍(lán)移至1 086 cm-1，說(shuō)明在癌前病變組織中部分DNA 的單雙鏈斷裂。

正常乳腺組織與良、惡性病變組織的拉曼光譜特征為胡蘿卜素、脂類、核酸和蛋白質(zhì)含量不同，但目前研究主要集中于組織切片，并且均未構(gòu)建合適的模型區(qū)分正常組織、良性病變和惡性病變。HAKE等[41]在2002年采用共聚焦顯微拉曼光譜儀檢測(cè)了乳腺組織的冰凍切片，通過(guò)擬合來(lái)源于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核仁、脂肪酸、膠原蛋白、羥磷灰石鈣、草酸鈣、脂質(zhì)和水的光譜，構(gòu)造形態(tài)/化學(xué)乳房組織模型；通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的拉曼光譜脂質(zhì)和膠原蛋白擬合系數(shù)，區(qū)分乳腺良、惡性病變的靈敏度為94%，特異度為96%。GEBREKIDAN等[14]構(gòu)建的模型診斷乳腺癌的靈敏度為99.15%，非乳腺癌病變的特異度為90.4%，在含有惡性病變的組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)惡性成分的靈敏度為100%。但既往研究中實(shí)驗(yàn)標(biāo)本均進(jìn)行了預(yù)處理，如冰凍、甲醛固定、石蠟包埋和脫蠟等，這些預(yù)處理會(huì)影響組織拉曼光譜信號(hào)，因此檢測(cè)未進(jìn)行任何處理的新鮮在體組織的拉曼光譜非常必要。HAKA等[41]檢測(cè)了9例保乳術(shù)患者的手術(shù)切緣，利用之前構(gòu)建的數(shù)據(jù)模型進(jìn)行診斷，檢測(cè)陽(yáng)性切緣的靈敏度為100%，特異度為100%，總準(zhǔn)確率為93.3%。SHIPP等[42]探索多光譜組織病理學(xué)判斷保乳手術(shù)切緣的應(yīng)用，多光譜組織病理學(xué)利用自發(fā)熒光顯微鏡高空間分辨率、速度、敏感性(低特異性)結(jié)合高化學(xué)特異性的拉曼光譜可發(fā)現(xiàn)微小腫瘤，靈敏度達(dá)91%，特異度達(dá)83%。證實(shí)了拉曼光譜在體內(nèi)檢測(cè)可以實(shí)現(xiàn)，但是由于絕經(jīng)前后乳腺組織脂肪含量變化和化療對(duì)乳腺組織的影響，仍然需要構(gòu)建更成熟的模型，以乳腺組織拉曼光譜特征為標(biāo)準(zhǔn)構(gòu)建模型，可快速、客觀、準(zhǔn)確地鑒別乳腺癌組織、良性病變組織與正常組織。

保乳手術(shù)中準(zhǔn)確地判斷陰性切緣并區(qū)分良、惡性組織非常重要。拉曼光譜可以提供組織的化學(xué)性質(zhì)和疾病發(fā)展?fàn)顟B(tài)等信息。在探索性手術(shù)中通過(guò)拉曼光譜判斷病變的性質(zhì)，可以降低二次手術(shù)率。拉曼光譜可以提供與傳統(tǒng)病理類似的圖像，結(jié)合拉曼光譜的穿刺活檢技術(shù)可以提供即時(shí)、無(wú)需標(biāo)記且客觀的化學(xué)信息。研究[43-46]顯示：利用建立的擬合系數(shù)模型，可成功地識(shí)別組織的良、惡性，在體內(nèi)測(cè)量的準(zhǔn)確率可達(dá)93.3%，光譜活檢穿刺測(cè)量為實(shí)時(shí)診斷奠定了基礎(chǔ)。

拉曼光譜技術(shù)不但可以應(yīng)用于乳腺癌的診斷，還可以用于研究疾病進(jìn)展及化學(xué)通路，為更好地理解疾病和治療疾病提供生化信息。研究[40,47]顯示：癌組織與正常組織中脂質(zhì)構(gòu)成比存在差異，對(duì)照脂質(zhì)成分的拉曼光譜可以發(fā)現(xiàn)非癌組織的脂質(zhì)多為油酸(油酸及其衍生物是脂肪組織中甘油的組成部分)，而癌組織中多為花生四烯酸(AA)(不飽和脂肪酸)。這一變化表明代謝是通過(guò)環(huán)氧合酶(COX)途徑進(jìn)行，不是通過(guò)脂氧合酶(LOX)進(jìn)行，而LOX會(huì)導(dǎo)致二十烷酸類化合物參與炎癥過(guò)程[48]。COX催化生成環(huán)狀化合物，LOX催化生成非環(huán)狀化合物。AA先于二十碳酸及其衍生物合成，其生物活性大于同型亞麻酸(DGLA)和二十碳五烯酸(EPA)。隨著組織惡性程度增加，OH-NH-CH的光譜增強(qiáng)，代表重要生物分子(如核酸、蛋白、脂肪)的增加，位于600～1 600 cm-1(與核酸有關(guān))的拉曼波峰也會(huì)發(fā)生改變。這些波峰的改變有助于對(duì)乳腺癌進(jìn)行分級(jí)分期，高級(jí)別導(dǎo)管原位癌的脂肪酸和甘油的拉曼光譜增加而低級(jí)別則減少[48]。

癌癥的具體病因并不明確，老化、氧化和自由基可能是其原因。BROZEK-PLUSKA等[38]對(duì)44例患者新鮮手術(shù)標(biāo)本(腫瘤組織、健康組織和血管標(biāo)本)進(jìn)行分析，在獲得的321個(gè)光譜中發(fā)現(xiàn)正常乳腺組織中類胡蘿卜素和脂質(zhì)的峰值明顯；但是惡性腫瘤組織熒光干擾較強(qiáng)。在惡性腫瘤中類胡蘿卜素和脂質(zhì)峰值降低表明這些成分在惡性組織中的含量較低，類胡蘿卜素減少可能由于脂褐素氧化，而脂質(zhì)減少也可能為脂質(zhì)過(guò)氧化。

4 展 望

利用拉曼光譜分析生物樣本仍然存在很多挑戰(zhàn)與局限性。樣本的拉曼光譜信號(hào)較弱時(shí)可使用SERS等靈敏度較高的技術(shù)，但樣品制備起著重要的作用。在分析生物樣品的拉曼光譜時(shí)，由于成分復(fù)雜，需要建立可靠的校準(zhǔn)模型確?？煽亢投繙y(cè)量。此外在使用探針進(jìn)行體內(nèi)分析時(shí)也存在挑戰(zhàn)，在引入拉曼光譜作為診斷依據(jù)之前，需要克服背景熒光、偽影和信號(hào)弱等不足，且需要通過(guò)多元統(tǒng)計(jì)分析方法構(gòu)建診斷模型。

拉曼光譜可以在分子水平上分析疾病的變化，為疾病診斷和治療效果評(píng)價(jià)提供客觀和可量化的信息。使用拉曼光譜技術(shù)可以更加深入地了解浸潤(rùn)性乳腺癌的浸潤(rùn)過(guò)程，獲得的化學(xué)信息可以定量定性地分析疾病。熒光等干擾給生物樣品拉曼光譜的獲取和解析帶來(lái)了巨大的困難，因此仍然需要開(kāi)發(fā)獲取、處理和分類數(shù)據(jù)的技術(shù)，通過(guò)對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，消除不需要的信號(hào)，增強(qiáng)拉曼光譜特征實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)的定性和定量分析，從而判斷乳腺組織的病變性質(zhì)。隨著拉曼光譜數(shù)據(jù)庫(kù)、組織分類方法和儀器設(shè)計(jì)的不斷改進(jìn)，獲取分辨率和準(zhǔn)確度更高及采集時(shí)間更短的拉曼光譜數(shù)據(jù)將成為可能，從而實(shí)現(xiàn)癌癥早期診斷，避免不必要的活組織檢查，即時(shí)、快速判斷乳腺癌保乳術(shù)的手術(shù)切緣，保證完全切除腫瘤。