月季高效增殖和生根條件的優(yōu)化研究

王藝程 楊柳燕 張永春 楊 玲

（1上海市農業(yè)科學院林木果樹研究所，上海市奉賢區(qū) 201403；2上海源怡種苗股份有限公司，上海市浦東新區(qū) 201204）

月季是薔薇科薔薇屬木本植物，原產于中國，具有很高的觀賞價值，被譽為花中皇后，深受人們喜愛。但月季為木本植物，生長繁殖速度較慢[1]，而隨著月季產業(yè)的發(fā)展，市場對月季種苗的需求量越來越大，傳統(tǒng)的無性繁殖手段已無法滿足市場需要。研究表明，月季的組培繁殖率遠高于無性繁殖手段，且通過組培繁殖的新苗不僅能保留原品種的優(yōu)良性狀，且耗時短[2]。因此，諸多研究建立了以月季腋芽為材料、通過器官發(fā)生途徑的快繁技術體系，以幼嫩葉片及合子胚為材料、通過誘導愈傷分化途徑的再生體系，以葉片和莖段為材料、通過月季體細胞胚胎發(fā)生途徑的快繁技術體系，然而這些研究均存在組培苗再生頻率低、組培技術體系不穩(wěn)定等問題，因此優(yōu)質種苗生產仍難以滿足市場需求[3]。在此背景下，為進一步優(yōu)化月季增殖和生根條件，提高月季增殖率和生根率，筆者在前期工作的基礎上，對月季組培苗增殖和生根的最適培養(yǎng)基配方進行了篩選，以期完善月季的組培快繁技術體系，為實現其規(guī)?；⒐S化生產提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為誘導產生的月季試管苗，品種代號為“5002”。試驗于2017年3月—6月在上海市植物種苗組培平臺組培室內進行。

1.2 試驗方法

1.2.1 月季離體增殖技術

供試材料為初代誘導產生的月季試管苗。增殖培養(yǎng)以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的6-BA（6-芐基腺嘌呤）、NAA（萘乙酸），另加蔗糖30 g/L、瓊脂4 g/L，共設9個處理，見表1。

表1 月季增殖培養(yǎng)基中激素配比

選取苗高≥2.5 cm的月季試管苗，用解剖刀切成長0.5～1.0 cm的莖段，每個莖段都帶有1張葉片，區(qū)分好植物形態(tài)學上下端，然后垂直接種于培養(yǎng)基上。每個處理接種20瓶，每瓶接種5個莖段。在培養(yǎng)室內進行光照培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為(25±2) ℃，光照時間12 h/d，光照強度1 000～2 000 Lux。

每隔3 d觀察1次，去除被污染的外植體，培養(yǎng)45 d后，統(tǒng)計增殖情況，即統(tǒng)計試管苗個數，測量其高度、葉長、葉片數、莖粗，記錄各配方最低苗高和最高苗高并進行比較，計算增殖系數和平均高度、平均葉長、平均葉片數、平均莖粗，觀察生長狀況等。

計算公式：增殖系數=試管苗個數÷發(fā)生增殖的外植體數，平均高度=∑各苗高度÷試管苗個數，平均葉長=∑各苗葉長÷總葉片數，平均莖粗=∑各苗莖粗÷試管苗個數，平均葉片數=∑各苗葉片數÷試管苗個數。

1.2.2 月季試管苗生根試驗

供試材料為增殖培養(yǎng)產生的月季試管苗。生根培養(yǎng)以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的NAA和AC（活性炭），另加蔗糖30 g/L、瓊脂4 g/L，共設9個處理，見表2。

表2 月季生根培養(yǎng)基中NAA和AC濃度配比

在超凈工作臺上用解剖刀將繼代增殖培養(yǎng)產生的試管苗（苗高≥2.5 cm）一株一株分開，接種于9種不同激素配比的培養(yǎng)基上。培養(yǎng)條件同1.2.1。每個處理接種20瓶，每瓶接種5株增殖苗。

每天觀察各培養(yǎng)基上試管苗的生根情況，培養(yǎng)38 d后統(tǒng)計生根指標數據，即統(tǒng)計每個處理生根試管苗數、各苗根數，測量根長、根粗、第三節(jié)高度（由上往下數第三節(jié)）、葉長，計算生根率、平均根長、平均根數、平均葉長、平均根粗、第三節(jié)平均高度。

計算公式：生根率=（生根苗數÷接種苗數）×100%，平均根長=總根長÷生根外植體數，平均根數=總根數÷生根外植體數，第三節(jié)平均高度=∑各苗第三節(jié)高度÷外植體數，平均葉長=∑各苗葉長÷總葉片數，平均根粗=∑各苗根粗÷各苗總根數。

1.3 統(tǒng)計分析

運用SPSS 19.0數據統(tǒng)計分析軟件進行數據分析。采用ANOVA 9（方差分析）對處理間進行差異性測驗，采用鄧肯氏新復極差法進行多重比較分析（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 不同增殖培養(yǎng)基上月季試管苗的增殖和生長情況

由表3可知，培養(yǎng)基配方中不同濃度的6-BA與NAA組合對月季試管苗的增殖影響存在差異。在6-BA為0.5 mg/L時，隨著NAA濃度的升高，增殖系數呈先下降后升高的趨勢;在6-BA為1.0 mg/L時，隨著NAA濃度的升高，增殖系數呈先上升后降低的趨勢;在6-BA為2.0 mg/L時，隨著NAA濃度升高，增殖系數呈先下降后升高的趨勢。在NAA為0.1 mg/L時，隨著6-BA濃度的升高，增殖系數呈先下降后升高的趨勢；在NAA為0.2～0.3 mg/L時，隨著6-BA濃度的升高，增殖系數呈先上升后降低的趨勢。各處理間增殖系數差異達顯著水平，G2處理的增殖系數最低，為1.29，且G2處理的試管苗有黃葉和愈傷組織，葉片??；G1處理和G9處理的增殖系數雖較高，但G1處理的試管苗有少量黃葉，且基部有愈傷組織，G9處理的試管苗畸形，葉彎曲，且部分苗的基部有愈傷組織；G5處理的增殖系數最高，為2.71，且G5處理的試管苗正常生長并生長健壯。

經綜合考慮，以G5處理，即以MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂4 g/L為月季試管苗的最佳增殖培養(yǎng)基配方。

表3 不同增殖培養(yǎng)基上月季試管苗的增殖和生長情況

2.2 不同生根培養(yǎng)基上月季試管苗的生根和生長情況

由表4可知，培養(yǎng)基配方中不同濃度的NAA與AC組合對月季試管苗生根及生長的影響存在差異，加入活性炭對月季試管苗生根有促進作用。在NAA濃度為0.5 mg/L時，隨著AC濃度的升高，平均生根率呈下降的趨勢;在NAA濃度為1.0 mg/L時，隨著AC濃度的升高，平均生根率呈先下降后升高的趨勢;在NAA濃度為2.0 mg/L時，隨著AC濃度的升高，平均生根率呈下降的趨勢。S5處理的平均生根率最低，為68%；S4處理和S6處理的平均生根率最高，均為100%，但S4處理的試管苗根細長且根系脆、易斷，有少量枯黃葉和少量側根，S6處理的試管苗有少量褐枯黃葉，葉卷曲；S1處理的平均生根率排名第2，達98%，但試管苗葉色有枯黃，有少量側根，且根系易斷；S7處理的平均生根率排名第4，達96%，試管苗根長、粗壯，僅有少量黃葉，但根易斷，且根系有部分褐色；S2處理的平均生根率達94%，僅有少量褐枯黃葉，且根系有彈性，不易斷，更適于移栽成活。

經綜合考慮，以S2處理，即以1/2 MS+NAA 0.5 mg/L+AC 1.0 g/L+蔗糖30 g/L+瓊脂4 g/L為月季試管苗的最佳生根培養(yǎng)基配方。

3 結論與討論

3.1 激素對月季試管苗增殖的影響

細胞分裂素有抑制植物頂端優(yōu)勢的作用，因而能促進側枝的萌發(fā)和生長，主要是影響腋芽的增殖。生長素最主要的作用是促進生長，促進作用因濃度而異，較低濃度促進生長，較高濃度抑制生長[4]。曹偉杰等[5]的研究結果表明，月季品種“紅雙喜”叢生芽增殖的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L，6-BA和NAA對月季叢生芽的增殖起著協同作用，6-BA能促進叢生芽萌發(fā)，而適量NAA能使叢生芽生長健壯，但過高的6-BA會誘發(fā)芽苗玻璃化。在月季組織培養(yǎng)過程中，激素配比除了要考慮增殖系數外，還應考慮不定芽的質量，增殖系數過大，往往會伴隨發(fā)生芽生長細弱、節(jié)間拉長等現象，出現不易生根或移栽成活率下降等問題。同時，生長素濃度較高會抑制細胞分裂，使某些芽的萌發(fā)受到明顯抑制[6]。謝曉靜等[7]以現代月季主栽品種“博”的莖段為外植體進行研究，BA和IBA的合適濃度配比，對月季側芽的發(fā)育、生長均有促進作用；張宇斌[8]的研究結果表明，增殖培養(yǎng)基的最佳激素濃度為MS+6-BA 0.8 mg/L+NAA 0.4 mg/L。此外，細胞分裂素(6-BA)與生長素(NAA)的比值較低時，可誘導根的分化，兩者比值適中時，可產生愈傷組織，兩者比值較高時，可誘導芽的分化。

表4 不同生根培養(yǎng)基上月季試管苗的生根和生長情況

本試驗結果表明，月季“5002”試管苗的最佳增殖培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂4 g/L，在此培養(yǎng)基上誘導出的叢生苗長勢較強，葉片大小正常，顏色鮮綠，平均高度為2.67 cm，平均葉長為1.32 cm，平均葉片數為7.53張，平均莖粗為2.47 mm，平均增殖系數達2.71。

3.2 激素和活性炭對月季試管苗生根的影響

曹偉杰等[5]的研究結果表明，月季品種“紅雙喜”芽苗再生根的最佳培養(yǎng)基為1/2 MS+NAA 0.05 mg/L，NAA能促進再生根的誘導，然而，NAA濃度過高會導致再生根生長不正常，對瓶苗生長不利，尤其對瓶苗的后期移栽成活非常不利。因此，NAA適合濃度的確定，不僅要考慮芽苗的生根率和生根數，還要考慮瓶苗的移栽成活率[5]。而張宇斌[8]研究結果表明，月季組培苗生根的最佳激素濃度為NAA 0.5 mg/L，培養(yǎng)10 d就能誘導根的形成，其生根率為90%。本試驗篩選出的最優(yōu)生根培養(yǎng)基配方中加入的激素及濃度也是NAA 0.5 mg/L，這和張宇斌等的研究結果一致。

孫占育[9]認為活性炭對植物組織培養(yǎng)生根的作用主要表現在：可提供生根的暗環(huán)境，防止根系褐變，有利生根，也有利于提高培養(yǎng)苗體內的可溶性蛋白和總糖含量，能吸附植物生長調節(jié)劑與其他有機物等有利生根的物質。因此，在植物組織培養(yǎng)生根中，選擇合適的活性炭濃度有利于生根。本試驗結果表明，以在培養(yǎng)基配方中加入AC 1.0 g/L為較好，且加入活性炭處理的試管苗比沒有加活性炭處理的試管苗根系更有彈性，顏色潔白，且更有利于移栽成活，表明在月季試管苗生根培養(yǎng)基中加入活性炭，對生根起到了促進作用，這與孫占育的研究結論一致。