蘇蘇小兒止咳顆粒提取工藝研究中鞘蕊蘇的質(zhì)量控制

張 慧，何建華，顧成剛，朱麗玲，吳 寧△

（1．武漢軍谷坊科技開發(fā)有限公司，湖北 武漢 430075； 2．武漢藥谷科技開發(fā)有限公司，湖北 武漢 430075）

小兒咳嗽為兒科臨床常見病，易反復(fù)發(fā)作，目前用于小兒咳嗽的中成藥中，以治療熱咳的藥物居多，專用于小兒寒咳的極少，且療效較快的藥物大多含有麻黃堿、可待因等藥物，不適于小兒服用。針對這一現(xiàn)狀，本課題組研制了蘇蘇小兒止咳顆粒。其屬中藥新藥注冊6．1類，已獲國家藥物臨床試驗批件和發(fā)明專利證書，處方來源于醫(yī)院臨床應(yīng)用多年的經(jīng)驗方，對治療外感風(fēng)寒所致的小兒咳嗽臨床療效確切。處方由化橘紅、鞘蕊蘇、紫蘇葉等5味中藥組方，具有宣肺解表散寒、理氣化痰止咳之功效，用于小兒風(fēng)寒咳嗽癥，癥見咳嗽頻作、咳痰稀白、鼻流清涕、惡寒無汗、頭身疼痛、舌淡苔白、脈浮緊、指紋色淡。鞘蕊蘇為方中為臣藥，是唇形科植物毛喉鞘蕊花Coleus forskohlii（Willd．）Briq．的干燥全草，具有下氣平喘、平肝之功，用于喘咳、眩暈、目脹昏花，如支氣管哮喘、咳嗽、青光眼、高血壓［1］。滇產(chǎn)毛喉鞘蕊花中主要成分為異佛司可林（isoforskilin）［2］，是目前所知的腺苷酸環(huán)化酶激活劑，即不通過受體，亦不通過抑制磷酸-Ⅱ酶，可直接提高血漿中環(huán)磷酸腺苷（cAMP）水平，直接舒張支氣管平滑肌，從而起到明顯的止喘抗炎作用［3-4］。異佛司可林在鞘蕊蘇藥材中含量較低，且無紫外吸收，在復(fù)方中鮮有將其作為檢測指標的報道，但其作為處方中的藥效成分，有必要對其含量測定方法進行考察，為提取工藝研究優(yōu)選最佳工藝參數(shù)提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

LC-20A型高效液相色譜儀（日本島津公司）；2000-ES型蒸發(fā)光散射檢測器（美國奧泰公司）；204AL型電子天平（德國梅特勒-托利多儀器上海有限公司）。

1．2 試藥

異佛司可林對照品（美國Sigma公司，批號為A04016-13072506，含量按97．8%計）；水為娃哈哈純凈水；色譜甲醇、乙腈均由湖北昌泰興業(yè)科技有限公司提供；柱層析用硅膠（100～200目，化學(xué)純，青島海浪硅膠干燥劑有限公司）；甲醇，乙酸乙酯、二氯甲烷均為分析純，由國藥集團化學(xué)試劑有限公司提供；蘇蘇小兒止咳顆粒70%醇提液、鞘蕊蘇陰性樣品均為武漢藥谷科技開發(fā)有限公司自制。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18柱（150 mm×4．6 mm，5μm）；柱溫：40℃；流動相：乙腈-2．5%冰醋酸溶液（40∶60，V／V）；流速：1．0 mL／min；進樣量：5μL，10μL（外標兩點法）；2000-ES型蒸發(fā)光散射檢測器，汽化溫度：103℃，氮氣流速：2．8 L／min。

2．2 溶液制備

對照品溶液：取異佛司可林對照品11．98 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得0．468 6 mg／mL的對照品貯備液；精密吸取5 mL貯備液置25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度線，搖勻，得0．093 7 mg／mL的對照品溶液。

供試品溶液：取蘇蘇小兒止咳顆粒70%醇提液（按處方比例分別稱取化橘紅、鞘蕊蘇、紫蘇葉、桔梗各50 g，甘草25 g，加10倍量70%乙醇，提取2次，每次1 h，濾過，合并濾液，即得）150 mL，精密稱定，置水浴上蒸干，殘渣加水30 mL加熱使溶解，用二氯甲烷振搖提取4次，第1次30 mL，其余3次每次20 mL，合并二氯甲烷液，加水50 mL洗滌，棄去水液，回收溶劑至約5 mL，加入硅膠（100～200目）1．0 g，拌勻，揮干，移至硅膠柱（內(nèi)徑1．5 cm，硅膠8 g，濕法裝柱）上，先用二氯甲烷-乙酸乙酯（9∶1，V／V）80 mL洗脫，棄去洗脫液，再用二氯甲烷-乙酸乙酯（75∶25，V／V）100 mL洗脫，收集洗脫液，回收溶劑至干，用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

陰性對照品溶液：按處方比例稱取除鞘蕊蘇外的其他藥材，按蘇蘇小兒止咳顆粒70%醇提液的制備工藝制成陰性樣品，再按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2．3 方法學(xué)考察

專屬性試驗：精密量取對照品溶液、陰性供試品溶液、供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果見圖1。可見，陰性對照品溶液色譜在與異佛司可林相應(yīng)位置上無吸收峰出現(xiàn)，異佛司可林與其他成分色譜峰達到基線分離。

圖1 高效液相色譜-蒸發(fā)光散射色譜圖

線性關(guān)系考察：取對照品溶液，分別進樣1，3，5，7，10，15，20μL，按擬訂色譜條件測定，以進樣量的常用對數(shù)值為橫坐標（X）、峰面積的常用對數(shù)值為縱坐標（Y）繪制標準曲線，線性回歸方程為Y＝1．715X＋5．504 6，r＝0．999 8（n＝7）。結(jié)果表明，異佛司可林進樣量在0．093 7～1．874 0μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗：取同一對照品溶液，按擬訂色譜條件進樣5μL，連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，計算色譜峰峰面積對數(shù)。結(jié)果RSD為0．14%（n＝6），表明儀器精密度較好。

穩(wěn)定性試驗：取同一份供試品溶液，分別在制備后0，2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24 h時按擬訂色譜條件進樣測定。結(jié)果異佛司可林色譜峰峰面積對數(shù)的RSD為0．28%（n＝13），表明供試品溶液在常溫下放置24 h穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗：平行制備6份供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定。結(jié)果異佛司可林的平均含量為2．002 4μg／g，RSD為1．37%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品溶液（含量為2．002 4μg／g）6份，每份約75 mL，精密稱定，置蒸發(fā)皿中，精密加入83．325μg／mL的對照品溶液2 mL，置水浴上蒸干，制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，計算加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 異佛司可林加樣回收試驗結(jié)果（n＝6）

2．4 工藝研究樣品測定

鞘蕊蘇在本處方中為臣藥，擬以其所含主要成分異佛司可林為指標成分，對不同濃度乙醇提取液進行檢測，得出指標成分轉(zhuǎn)移率高的較優(yōu)乙醇濃度范圍，再在此范圍內(nèi)進行正交試驗，以提取次數(shù)（因素A）、提取時間（因素B）、加醇量（因素C）、乙醇濃度（因素D）確定優(yōu)化后的提取條件，并進行正交驗證試驗，確定最優(yōu)提取條件。異佛司可林提取轉(zhuǎn)移率＝（各提取液中異佛司可林的含量×對應(yīng)提取液的質(zhì)量）／（鞘蕊蘇異佛司可林含量×鞘蕊蘇的投料量）×100%。結(jié)果見表2至表6。結(jié)合君藥化橘紅中柚皮苷的轉(zhuǎn)移率，確定蘇蘇小兒止咳顆粒提取正交試驗乙醇濃度為60%～80%?？梢?，提取次數(shù)和加醇量對異佛司可林轉(zhuǎn)移率有顯著影響，最優(yōu)提取條件為A3B2C3D2；提取3次與2次相比，加醇量10倍與12倍，異佛司可林的提取轉(zhuǎn)移率相差均不大，從工業(yè)生產(chǎn)結(jié)合能源耗損來分析，臣藥鞘蕊蘇中異佛司可林最佳提取條件為A2B2C2D2。各驗證試驗提取液的異佛司可林提取轉(zhuǎn)移率均大于75%，RSD小于2．0%，表明提取2次，加醇量為10倍能將有效成分提取完全。故確定最佳提取工藝條件為：加10倍量70%乙醇，回流提取2次，每次1．5 h。

表2 工藝提取預(yù)試驗異佛司可林的測定結(jié)果

表3 醇提因素水平表

表4 醇提正交試驗結(jié)果

表5 異佛司可林轉(zhuǎn)移率方差分析表

表6 醇提正交驗證工藝異佛司可林轉(zhuǎn)移率試驗結(jié)果

3 討論

處方中鞘蕊蘇有效成分異佛司可林只有紫外末端吸收，目前對鞘蕊蘇異佛司可林含量測定報道主要有2種方法：一是選用紫外檢測器測定，采用末端吸收波長210 nm［5-6］；二是采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射（HPLC-ELSD）法，使用流動相乙腈-水系統(tǒng)［7］。采用紫外檢測波長210 nm測定時，由于異佛司可林含量低、雜質(zhì)峰相對較大，無論是調(diào)節(jié)流動相比例還是調(diào)節(jié)流動相酸度、柱溫，都無法將主峰與雜質(zhì)峰分開。采用HPLCELSD，使用流動相乙腈-水系統(tǒng)時異佛司可林主峰與雜質(zhì)峰完全重合，陰性樣品有干擾。該2種方法對蘇蘇小兒止咳顆粒樣品的分離度有限，陰性樣品總會有干擾。本研究中以HPLC-ELSD法測定異佛司可林含量時，在流動相中加入揮發(fā)性的酸，使本來與主峰重疊的雜質(zhì)峰，得到了完全分離，分離效果得到極大改善，方法可行。

關(guān)于鞘蕊蘇中異佛司可林含量測定，按2015年版《中國藥典（四部）》通則0512中高效液相色譜法測定。分別精密吸取對照品溶液5，10μL，供試品溶液5～10μL，注入液相色譜儀，測定，用外標兩點法常用對數(shù)方程計算即得。本品按干燥品計算，含異佛司可林（C22H34O7）不得少于0．01%。工藝研究中各試驗樣品投料用鞘蕊蘇異佛司可林含量按本法測定為151．7μg／g。

蘇蘇小兒止咳顆粒樣品中異佛司可林含量相對較低，要達到檢測要求，取樣量較大，直接濃縮加硅膠拌勻時發(fā)現(xiàn)樣品黏性較強，呈團塊狀不易分散，加至硅膠柱上時干擾洗脫，故根據(jù)異佛司可林的溶解性，以有機溶劑萃取純化，但萃取后的樣品中仍含有較多雜質(zhì)，顏色較深，對異佛司可林的測定產(chǎn)生干擾，且易降低色譜柱的柱效和使用壽命，因而仍有必要進一步通過硅膠柱對萃取后的樣品進行純化。以二氯甲烷-乙酸乙酯不同比例混合，進行梯度洗脫，通過系列對比試驗確定了硅膠柱的內(nèi)徑、用量，以及二氯甲烷-乙酸乙酯洗脫劑的最佳用量。以上研究方法為中藥新藥研發(fā)過程中相對含量較低的復(fù)雜成分的質(zhì)量控制提供了一定的研究思路。