紫草總色素β-環(huán)糊精包合物的定性鑒別及左旋紫草素含量測定*

李俊江，劉向娥，李季文，張?jiān)鲋?，牛建?/p>

（1．甘肅省中醫(yī)院科研制劑中心，甘肅 蘭州 730050； 2．甘肅省中醫(yī)院白銀分院，甘肅 白銀 730900；3．甘肅隴中藥業(yè)有限公司，甘肅 白銀 730900）

紫草為紫草科植物新疆紫草Arnebia euchroma（Royle）Johnst．或內(nèi)蒙紫草Arnebia guttataBunge的干燥根［1］，主要活性成分為多種羥基萘醌類化合物（紫草羥基萘醌總色素）［2-3］，藥用活性廣泛，但普通口服制劑的穩(wěn)定性較差。β-環(huán)糊精包結(jié)紫草總色素可避免紫草總色素及衍生物長時間在光、空氣和高溫環(huán)境下產(chǎn)生聚合作用而失去活性［4-6］，擴(kuò)大臨床使用范圍。本研究中對紫草總色素β-環(huán)糊精包合物進(jìn)行了定性鑒別與含量測定，建立了薄層色譜（TLC）鑒別及高效液相色譜（HPLC）含量測定方法?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

PerkinElmer A-10型高效液相色譜儀（美國PerkinElmer公司），包括717自動進(jìn)樣器，二極管陣列檢測器（DAD）；HS6150型超聲波清洗儀（天津恒奧科技發(fā)展有限公司）；Mettler AE240型電子分析天平（德國Sartorius賽多利斯公司，萬分之一）；HXGZ-000800型電熱恒溫干燥箱（連云港醫(yī)療器械設(shè)備廠）；薄層板（自制）。

1．2 試藥

紫草藥材由甘肅省中醫(yī)院藥劑科提供，經(jīng)甘肅省中醫(yī)院藥學(xué)部汪付田主任中藥師鑒定為正品；紫草總色素β-環(huán)糊精包合物（甘肅省中醫(yī)院科研制劑中心制備，批號分別為20160906，20160915，20160918，20160920，20160925，20161211）；左旋紫草素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為110769-200405，供含量測定用）；β，β-二甲基丙烯酰阿卡寧對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為111689-200502）；β-環(huán)糊精（江蘇豐園生物技術(shù)有限公司，相對分子質(zhì)量為1 134．98，含量≥98%）；乙腈、甲醇（天津光復(fù)精細(xì)化工研究所，色譜純）；其他試劑均為分析純，水為自制超純水。

2 方法與結(jié)果［7］

2．1 薄層色譜鑒別

取總萘醌包合物0．5 g，加石油醚20 mL，超聲20 min，濾過，濾液濃縮至約1 mL，作為供試品溶液。同法制得β-環(huán)糊精陰性對照品溶液。另取β，β-二甲基丙烯酰阿卡寧對照品、左旋紫草素對照品適量，配成對照品溶液。按2015年版《中國藥典（四部）》通則0502薄層色譜法試驗(yàn)，分別吸取供試品溶液、對照品溶液、陰性對照品溶液各10μL，點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5∶5∶0．5∶0．1，V／V／V／V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴10%氫氧化鉀甲醇溶液，顯色。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對照無干擾（詳見圖1）。

圖1 薄層色譜圖

2．2 含量測定

2．2．1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Waters C18柱（250 mm×4．6 mm，5μm）；流動相：甲醇-0．025 mol／L磷酸（82∶18，V／V）；流速：0．8 mL／min；檢測波長：516 nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：10μL［8］。理論板數(shù)不低于4 000，且分離度大于1．5。

2．2．2 溶液制備

取左旋紫草素對照品5．11 mg，精密稱定，置5 mL容量瓶中，加甲醇配制成質(zhì)量濃度為1．022 mg／mL的溶液，即得對照品溶液。取包合物0．25 g，置30 mL三角瓶中，加甲醇20 mL，超聲（300 W，25 kHz）10 min，0．45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按包合物的處方比例稱取環(huán)糊精制得陰性樣品，按供試品溶液制備方法制得陰性對照品溶液。

2．2．3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：分別精密吸取供試品溶液、對照品溶液和陰性對照品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果供試品溶液與對照品溶液在相同時間出峰，左旋紫草素達(dá)到較好分離，峰形良好，陰性對照無干擾。色譜圖見圖2。

線性關(guān)系考察：吸取對照品溶液適量，分別用甲醇稀釋至每1 mL含左旋紫草素20．4，40．8，81．6，163．2，326．4μg的溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣10μL，每個質(zhì)量濃度進(jìn)樣3次，以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y＝9×105X-50 121，r＝0．999 6。結(jié)果表明，左旋紫草素質(zhì)量濃度在20．4～326．4μg／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取質(zhì)量濃度為81．6μg／mL的對照品溶液10μL，按擬訂色譜條件分別于不同時間連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果左旋紫草素峰面積的RSD為0．85%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取同一供試品溶液，分別在0，4，8，12，18，24 h時按擬訂色譜條件各進(jìn)樣10μL測定。結(jié)果左旋紫草素含量的RSD為1．26%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品（批號為20160925）6份，同法制備供試品溶液，精密吸取10μL進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果樣品中左旋紫草素的平均含量為5．58 mg／g，RSD為1．46%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：稱取已知含量的包合物（批號為20160906）0．25 g（左旋紫草素含量為5．3 mg／g），精密稱定，共6份，分別加入1．022 mg／mL左旋紫草素對照品溶液1 mL，按2．2．2項(xiàng)下樣品處理方法處理，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

2．4 樣品含量測定

取已制備的3批樣品（批號分別為20160906，20160920，20160925），依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件平行進(jìn)樣3次，記錄峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果3個批次樣品中左旋紫草素含量分別為5．3，5．4，5．6 mg／g。

圖2 高效液相色譜圖

表1 左旋紫草素加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

3 討論

紫草臨床應(yīng)用廣泛，主要用于治療血熱毒盛、斑疹紫黑、瘡瘍、濕疹、水火燙傷、凍傷、流行性腮腺炎、色素性紫癜和過敏性紫癜等，尤其對糖尿病造成的大面積潰瘍傷口的愈合效果很好［3-4，9-10］。另外，以紫草為主藥治療皮膚白斑、銀屑病、乳腺增生、神經(jīng)衰弱、精神分裂癥等均可獲得較好的臨床療效［2］。近年來，又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)紫草具有保肝、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)作用，臨床可用于急慢性肝炎、絨毛膜上皮癌等的治療。紫草藥理作用及臨床應(yīng)用很多，如抗菌抗炎、抗病毒、抗癌、抗生育、抗氧化、抗衰老、降糖、保肝及提高機(jī)體免疫功能［2-4，11-15］。

羥基萘醌化合物為紫草色素的主要組成部分，化學(xué)結(jié)構(gòu)由母體萘茜（5，8-dihydroxy-y-1，4-naphthoquinone）與側(cè)鏈部分相連而成，化學(xué)性質(zhì)與母體有許多相似之處［6］。羥基的引入使得其比母體更不穩(wěn)定，但具有更豐富的特性。羥基萘醌具有重要生物活性和應(yīng)用前景，但易受自然界光照、溫度、pH、氧化劑、金屬離子等的影響而發(fā)生降解、氧化、聚合、螯合等變化，改變其穩(wěn)定性［5-6］。紫草的諸多藥理活性使其具有廣闊的臨床應(yīng)用前景，但因紫草總色素及衍生物長時間在光、空氣和高溫環(huán)境下產(chǎn)生聚合作用，聚合后則失去活性，口服制劑的穩(wěn)定性較差，導(dǎo)致紫草的臨床應(yīng)用經(jīng)常以紫草油等外用劑型多見，單味及復(fù)方的口服制劑較少見，臨床使用受到了較大限制。

β-環(huán)糊精包合物是一種超微型的藥物載體，原料是環(huán)糊精（CYD）。β-CYD是以7個葡萄糖分子以1，4-糖苷鍵連接，筒狀結(jié)構(gòu)，筒內(nèi)壁空腔為0．6～1．0 nm，由于葡萄糖的羥基分布在筒的兩端并在外部，糖苷鍵氧原子位于筒的中部并在筒內(nèi)，β-CYD的兩端和外部為親水性，而筒的內(nèi)部為疏水性，借范德華力將一些大小和形狀合適的藥物分子包合于環(huán)狀結(jié)構(gòu)中，形成超微囊狀包合物，供口服或注射，在體內(nèi)經(jīng)酶水解釋放出藥物［16］。采用β-環(huán)糊精包合技術(shù)克服因有效成分性質(zhì)不穩(wěn)定給提取和制備帶來的困難，為含紫草的復(fù)方及單味藥內(nèi)服制劑的研制提供了創(chuàng)新思路和技術(shù)支持，可穩(wěn)定含紫草的內(nèi)服中藥制劑的質(zhì)量，提高生物利用度，充分發(fā)揮其抗菌抗炎、抗病毒、抗癌、降糖、保肝及提高機(jī)體免疫的臨床功效。

本研究中對紫草總色素β-環(huán)糊精包合物進(jìn)行定性鑒別和定量測定，采用TLC法、HPLC法對紫草總色素β-環(huán)糊精包合物進(jìn)行質(zhì)量評價。根據(jù)環(huán)境和實(shí)驗(yàn)室條件，在HPLC-DAD法測定左旋紫草素含量時，發(fā)現(xiàn)若單用甲醇水溶液作為流動相，則左旋紫草素峰形會發(fā)生拖尾。加入低濃度酸如0．025 mol／L磷酸，能較明顯地改善峰形［17］。所建立的TLC定性鑒別及HPLC含量測定方法，完善并提高了紫草總色素β-環(huán)糊精包合物的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。該方法操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好，為紫草總色素β-環(huán)糊精包合物質(zhì)量提供了保障，為含紫草的新制劑研發(fā)提供了參考。