酢漿草體外抗炎抗氧化檢測方法的建立和優(yōu)化

馮 倩，陳，蔡忠貞，王 琳，白雪梅

（新繹健康科技有限公司生命科技研究院，河北 廊坊 065001）

抗炎效果作為藥物作用的重要反應，常被作為藥物應用的關鍵考量指標。目前常用抗炎效果檢測方法有2種；第1種是通過脂多糖（LPS）體外刺激小鼠腹腔巨噬細胞建立細胞炎癥模型，采用Griess法檢測細胞培養(yǎng)上清液中一氧化氮（NO）的含量，采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測上清液中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、前列腺素E2（PGE2）的含量，實時熒光定量RT-PCR法檢測TNF-α、誘導型一氧化氮合酶（iNOS）及環(huán)氧合酶2（COX-2）mRNA表達［1-3］，細胞實驗操作煩瑣，且細胞活性與狀態(tài)會影響檢測結果；第2種是二甲苯致小鼠耳腫脹度和對醋酸誘發(fā)的小鼠扭體反應、冰醋酸所致小鼠血管通透性實驗模型檢測抗炎作用［4-5］。動物實驗在體檢測，操作復雜，存在個體差異，且由于動物實驗所存在的倫理問題及國際上對動物福利的日益關注，發(fā)展新的體外實驗方法，以減少、優(yōu)化和替代（reduction，refinement，replacement，3R理論）動物實驗成為當前研究的熱點［6］。酢漿草［7］抗炎作用雖有諸多研究［8-9］，但建立快速、簡便的檢測方法，實現(xiàn)離體檢測，判斷藥物抗炎活性將成為藥物評估的重要手段。本研究中以酢漿草為材料，優(yōu)化和建立抗氧化活性、蛋白變性抑制活性和酶活性抑制活性的檢測方法，對比其不同提取方法的藥物活性、不同保存條件及保存效果，實現(xiàn)體外快速、準確對比和篩選藥物，判斷藥物抗炎效果，對于快速評估藥物具有重大意義?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1．1 儀器與試藥

儀器：AB265-S型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；DE-500g型萬能高速粉碎機（浙江紅景天工貿(mào)有限公司）；DH6-903385-Ⅲ型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；UV2550型紫外可見分光光度計（日本島津公司）。

試藥：酢漿草（脫水干貨，購自河北保定）；95%乙醇，70%高氯酸，鹽酸（北京化工廠）；胰蛋白酶1∶250（北京博奧拓科技有限公司）；牛血清白蛋白（BSA，北京科海榮京生物科技公司）；酪蛋白（美國Sigma公司）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，上海麥克林生化科技有限公司）。

1．2 方法

1．2．1 酢漿草前處理

酢漿草干貨用粉碎機粉碎成2 mm大小粉末，密封待用。

1．2．2 提取液制備

醇提水沉法：取40 g酢漿草粉末，精密稱定，加入130 mL 95%乙醇，置500 mL三角瓶中浸泡過夜，用500目絹篩濾去殘渣，濾液采用0．8μm醋酸纖維濾膜真空抽濾，澄清濾液置玻璃蒸發(fā)皿中60℃過夜烘干，加水溶解至10 mL，作為提取原液1號。取提取原液1號3 mL，加水稀釋至40 mL（出現(xiàn)顆粒不溶物），采用0．8μm醋酸纖維濾膜真空抽濾，將濾液再加入40 mL水，混勻，再次真空抽濾，除去脂溶性色素（葉綠素、葉黃素、胡蘿卜素等），澄清濾液置玻璃比色皿中60℃過夜烘干，加20 mL水重新懸浮，采用0．8μm醋酸纖維濾膜真空抽濾，即得20 mL醇提水沉提取液2號。

水提醇沉法：取40 g酢漿草粉末，精密稱定，加入130 mL水，置500 mL三角瓶中浸泡過夜，用500目絹篩濾去殘渣，置玻璃蒸發(fā)皿中60℃過夜烘干，加水溶解至15 mL，加入95%乙醇40 mL，用500目絹篩濾去不溶物，采用0．8μm醋酸纖維濾膜真空抽濾，將澄清濾液置玻璃比色皿中60℃過夜烘干，加10 mL水重新懸浮，采用0．8μm醋酸纖維濾膜真空抽濾，除去不溶物，即得10 mL水提醇沉提取原液a號。取提取原液a號3 mL，加水稀釋至40 mL（出現(xiàn)顆粒不溶物），采用0．8μm醋酸纖維濾膜真空抽濾，將濾液再加入40 mL水，混勻，再次真空抽濾，澄清濾液置玻璃比色皿中60℃過夜烘干，加20 mL水重新懸浮，采用0．8μm醋酸纖維濾膜真空抽濾，即得20 mL醇提水沉提取液b號。

1．2．3 檢測方法

抗氧化性成分：參考DPPH［10］法檢測、優(yōu)化和改進。用無水乙醇配置0．1 mmol／L的DPPH溶液，避光保存。將2 mL測試樣品溶液及2 mL DPPH溶液加入同一試管中，搖勻，室溫下暗處靜置30 min后測定其在517 nm波長處的樣品吸光度，測定前采用相應樣品用蒸餾水1∶1稀釋后調零，同時測定2 mL DPPH溶液與2 mL蒸餾水混合反應后的對照吸光度，采用蒸餾水調零。自由基清除能力以清除率表示。清除率（%）＝（對照吸光度-樣品吸光度）×100／對照吸光度。

蛋白變性抑制成分：參考抑制透明質酸酶能力測定方法［11］優(yōu)化和改進。1 mL測試樣品溶液加入1 mL 1%牛血清白蛋白，37℃反應20 min，57℃熱蛋白變性20 min，反應液在660 nm波長處測定吸光度，做3個平行樣。對照組測試液用0．9%氯化鈉溶液代替，對照組用0．9%氯化鈉溶液調零。測試樣品用測試液1 mL加0．9%氯化鈉溶液1 mL調零，排除樣品色素干擾問題。計算抑制比率。抑制比率（%）＝（對照吸光度-樣品吸光度）×100／對照吸光度。

酶活性抑制成分：參考抑制白蛋白變性能力測定方法［12］優(yōu)化和改進。0．06 mg胰蛋白酶加入1 mL 20 mmol／L Tris HCl緩沖液（pH＝7．4）加入1 mL測試樣品，37℃反應5 min，加入1 mL 0．8%酪蛋白，37℃反應20 min，加入2 mL 70%高氯酸終止反應，離心，上清液用Tris HCl稀釋100倍后于210 nm波長處測定吸光度。對照組測試液用Tris HCl緩沖液代替，對照組用緩沖液稀釋100倍調零。測試樣品用測試液＋4 mL緩沖液后稀釋100倍調零。20 mmol／L Tris HCl配制方法，0．242 g Tris溶解至50 mL水中，后用HCl調pH至7．4，加水定容至100 mL。0．8%酪蛋白配制方法，0．8 g酪蛋白加水100 mL，定容至100 mL。同法計算抑制比率。

圖1 不同濃度酢漿草提取液活性檢測

2 結果

2．1 酢漿草不同濃度提取液活性

通過優(yōu)化檢測方法的操作條件和背景噪音去除方法，在傳統(tǒng)檢測方法的基礎上獲得了可用于藥物活性檢測的更佳方法，檢測不同稀釋度的酢漿草醇提水沉提取液抗氧化性、蛋白變性抑制、酶活性抑制成分。結果見圖1，抑制比率與稀釋度呈線性關系，表明檢測方法能很好地反映相應組分的含量變化，可用于藥物有效成分的定量分析。

2．2 不同提取方法對酢漿草有效成分的影響

藥物溶劑提取法是選用適當?shù)娜軇⒅兴幓瘜W成分從藥材中提取出來。醇提水沉法先用適宜濃度的乙醇提取藥材成分，回收乙醇后，加適量水攪勻，靜置，冷藏，沉淀完全后濾除。藥材以乙醇為溶劑提取，可避免淀粉、蛋白質、黏液質等成分浸出，加水處理后可除去醇提液中樹脂、脂溶性色素等雜質。應用此法應慎重，避免醇溶性有效成分水溶性差而被除去。水提醇沉法中藥水提濃縮液中，加入乙醇，使其達到不同含醇量，某些藥物成分在乙醇溶液中溶解度降低，析出沉淀，固液分離后水提液得以精制。兩者在有機溶劑使用量和提取效果上有一定差異，對比差異詳見表1。可見，2種提取方法對酢漿草抗氧化、蛋白變性抑制和酶活性抑制影響差異不大。

表1 不同提取方法對酢漿草抗氧化活性、蛋白變性抑制及酶活性抑制成分比較（X±s，%）

醇提水沉和水提醇沉成分高效液相色譜（HPLC）圖比較見圖2。可見，2種提取物出峰位置基本一致，水提取物的峰面積較95%乙醇提取物大，表明2種提取方法在成分含量上有一定差異。但抗氧化作用、酶活性抑制和蛋白變性抑制效果相差不大，可能與2種提取液有效成分含量均處于上限有關，但醇提水沉法操作更簡便。

圖2 酢漿草提取液高效液相色譜圖

2．3 酢漿草提取液保存條件及效果

提取液的保存方法和效果可影響后續(xù)分析和使用，保存方法包括4℃冷藏和室溫25℃。對醇提水沉提取液的保存效果進行檢測，結果見圖3?？梢姡鞍鬃冃砸种瞥煞衷诓煌４鏃l件3 d時均下降40%，7 d時無活性；酶活性抑制成分在冷藏時下降比室溫條件慢，在7 d時分別下降30%和60%；抗氧化成分在2種保存條件下均有較高活性，性狀穩(wěn)定。室溫長時間保存有一定活性成分損失，最佳使用時間在3 d內，推薦冷藏保存。

3 討論

圖3 酢漿草提取液不同保存條件活性比較

DPPH法廣泛用于定量測定生物試樣和食品的抗氧化能力［10］，是根據(jù)DPPH自由基有單電子，在517 nm波長處有強吸收，醇溶液呈紫色的特性。當有自由基清除劑存在時，由于與其單電子配對而使其吸收逐漸消失，其褪色程度與其接受的電子數(shù)量成定量關系，因而可用分光光度計進行快速定量分析。蛋白變性效果通過檢測牛血清白蛋白在高溫變性后的吸光度變化來計算，檢測樣品與蛋白作用后引起蛋白變性效果發(fā)生的變化，以對照組與樣品組吸光度的差異來計算樣品對蛋白變性抑制的效果，該方法操作簡單，且穩(wěn)定可控。

蛋白酶在一定條件下不僅能水解蛋白質的肽鍵，也能水解酰胺鍵和酯鍵，因此可用蛋白質或人工合成的酰胺及脂類化合物作為底物來測定蛋白酶的活力。以酪蛋白為底物可測定微生物蛋白酶水解肽鍵的活力，經(jīng)蛋白酶作用后降解成相對分子質量較小的肽和氨基酸，在反應混合物中加入三氯醋酸溶液，相對分子質量較大的蛋白質和肽則沉淀，相對分子質量較小的肽和氨基酸仍留在溶液中，溶解于三氯醋酸溶液中的肽的數(shù)量與酶的數(shù)量和反應時間成正比。在210 nm波長下測定溶液吸光度的增加，就可計算酶的活力。

本研究中以酢漿草為原料，建立了抗氧化、蛋白變性抑制、酶活性抑制成分檢測方法，用于快速體外檢測藥物抗炎活性。DPPH法檢測抗氧化活性具有快速、簡便、經(jīng)濟、反應液穩(wěn)定、數(shù)據(jù)重復性好等優(yōu)點，易實現(xiàn)高通量篩選。酶活性抑制成分檢測和蛋白變性抑制成分檢測方法具有操作簡便、反應條件易控、數(shù)據(jù)可靠等特點。從3個維度對酢漿草抗炎成分進行體外快速檢測，安全可靠，為藥物抗炎活性評估提供了更便捷的方法。

炎癥的基本病理變化通常概括為局部組織的變質、滲出和增生［13］。炎性反應將炎癥細胞輸送到炎癥局部，滲出白細胞是炎性反應最重要的特征，白細胞通過釋放酶、化學介質和毒性自由基等，引起組織損傷，并可能延長炎癥過程。這一系列的炎性反應伴隨著自由基產(chǎn)生、酶釋放、酶活性增加、蛋白變性等生化反應。

本研究中建立的藥物抗氧化、蛋白變性抑制活性、酶活性抑制檢測方法，與炎癥發(fā)生過程中的主要生化反應相對應，檢測結果顯示，酢漿草提取液具有100%抗氧化活性、90%蛋白變性抑制活性和50%酶活性抑制活性。抗氧化和蛋白變性抑制尤其對其抗炎效果的發(fā)揮具有積極作用，因此，本研究中所建立的藥物抗炎抗氧化活性體外快速檢測方法可用于抗炎藥物批量篩選和快速鑒定。