小膠質(zhì)細(xì)胞活化介導(dǎo)的MMP-9信號(hào)通路在電針預(yù)處理對(duì)MCAO大鼠的腦保護(hù)效應(yīng)中的作用

陳麗瑩,蔣佩萱,徐詩(shī)婷,羅咿君,劉妍,張江松,趙逸彬,王豪,林咸明

·動(dòng)物實(shí)驗(yàn)·

小膠質(zhì)細(xì)胞活化介導(dǎo)的MMP-9信號(hào)通路在電針預(yù)處理對(duì)MCAO大鼠的腦保護(hù)效應(yīng)中的作用

陳麗瑩,蔣佩萱,徐詩(shī)婷,羅咿君,劉妍,張江松,趙逸彬,王豪,林咸明

(浙江中醫(yī)藥大學(xué),杭州 310053)

通過觀察電針預(yù)處理對(duì)大腦中動(dòng)脈栓塞(MCAO)大鼠的腦梗死體積、小膠質(zhì)細(xì)胞的活化和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)的影響,評(píng)價(jià)電針預(yù)處理對(duì)MCAO大鼠的腦保護(hù)效應(yīng)及相關(guān)機(jī)制。將32只健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、電針預(yù)處理組和針刺組,每組8只。取百會(huì)、風(fēng)府穴行電針15 d后,采用Zea Longa改良線栓法復(fù)制大鼠大腦MCAO模型。用Longa 4分法和Morris水迷宮進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分及學(xué)習(xí)和記憶能力的觀察,用TTC染色法檢測(cè)腦梗死體積,并用免疫熒光法檢測(cè)活化的小膠質(zhì)細(xì)胞、MMP-9的陽(yáng)性細(xì)胞。模型組大鼠腦梗死體積、MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞活化較假手術(shù)組明顯增多(＜0.01,＜0.05),電針預(yù)處理組、針刺組較模型組明顯減少(＜0.01,＜0.05)。百會(huì)、風(fēng)府穴電針預(yù)處理15 d能減小MCAO大鼠腦梗死體積,減輕學(xué)習(xí)與記憶能力的喪失,發(fā)揮腦保護(hù)效應(yīng)。此效應(yīng)可能是通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化介導(dǎo)的MMP-9信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)。

針刺療法;電針預(yù)處理;再灌注損傷;腦缺血;小膠質(zhì)細(xì)胞;基質(zhì)金屬蛋白酶-9;大鼠

卒中包括出血性卒中和缺血性卒中,其中缺血性卒中占60%～70%,具有發(fā)病率高、病死率高、致殘率高、復(fù)發(fā)率高、合并癥多及治愈率低等特點(diǎn)[1],主要的負(fù)面影響是降低了患者的日常生活能力和工作學(xué)習(xí)能力[2-3],給患者家庭及社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)。目前臨床上有各種預(yù)防方法(用高壓氧、一氧化氮、低氧、低溫或中藥如地龍和水蛭復(fù)方制劑以及針刺等誘導(dǎo)腦缺血耐受以期減少腦缺血性損傷[4-6])和治療方法(溶栓、抗血小板、抗凝、降纖等),但大部分預(yù)防和治療方法均有較大的局限性,難以直接應(yīng)用于臨床。相比之下,針刺預(yù)處理是最佳選擇,具有操作簡(jiǎn)便易行,經(jīng)濟(jì)安全有效等優(yōu)點(diǎn)。大量基礎(chǔ)和臨床研究表明,針刺預(yù)處理具有腦保護(hù)效應(yīng)[6-8]?？梢?針刺預(yù)處理防治卒中是一個(gè)新的切入點(diǎn),應(yīng)用于臨床的可能性較大。

研究表明,血腦屏障(blood brain barrier, BBB)的損害與多種因素有關(guān),其中與小膠質(zhì)細(xì)胞、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9, MMP-9)關(guān)系密切。腦缺血損傷后,小膠質(zhì)細(xì)胞迅速活化,會(huì)分泌各種蛋白水解酶和炎性介質(zhì)[9],如MMP-9、IL-6、IL-1b。其中MMP-9能通過降解緊密連接蛋白、細(xì)胞外基質(zhì)成分參與BBB結(jié)構(gòu)和功能的破壞[10],從而導(dǎo)致了腦損傷。相關(guān)研究表明,電針預(yù)處理能夠明顯減輕腦缺血損傷,可以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化,減少M(fèi)MP-9陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá),減小腦梗死體積(%),減輕卒中后學(xué)習(xí)和記憶能力的損傷[11-13]。而電針預(yù)處理是否通過調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞活化介導(dǎo)的MMP-9信號(hào)通路而發(fā)揮腦保護(hù)效應(yīng),減小腦梗死體積、減輕卒中后學(xué)習(xí)和記憶能力的喪失目前尚無報(bào)道。本研究擬探討電針預(yù)處理對(duì)缺血再灌注后腦梗死體積、小膠質(zhì)細(xì)胞的活化和MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)的影響,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

清潔級(jí)健康雄性Sprague Dawley(SD)大鼠32只,體質(zhì)量(250±20)g,上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(滬)2013-0016],常規(guī)飲食,飼養(yǎng)環(huán)境溫度為18℃～22℃。采用查隨機(jī)數(shù)字表法將32只SD大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組、模型組、電針預(yù)處理組和針刺組,每組8只。分別進(jìn)行以下處理,假手術(shù)組僅予以頸總動(dòng)脈分離,不結(jié)扎、不插線;模型組采用Zea Longa改良線栓法復(fù)制右側(cè)大腦中動(dòng)脈栓塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型;電針預(yù)處理組取百會(huì)、風(fēng)府穴行電針預(yù)處理15 d后行右側(cè)MCAO造模;針刺組僅將針灸針刺入穴位,深度和角度同電針預(yù)處理組,其余與電針預(yù)處理組無異。

1.2 材料與試劑

TTC(T817,Solarbio公司);anti-MMP-9(ET1705- 78,huabio有限公司);anti-iba1(ET1704-69,huabio有限公司);韓氏穴位神經(jīng)刺激儀(HANS-100A,中國(guó)南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司);冰凍切片機(jī)(LeicaCM 1900);激光多普勒組織血流儀(帕瑞醫(yī)學(xué)科技有限公司)。

1.3 預(yù)處理方法

取百會(huì)、風(fēng)府穴,定位參照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物穴位圖譜》。常規(guī)消毒后,采用蘇州醫(yī)療用品廠有限公司出品的華佗牌0.30 mm×25 mm針灸針進(jìn)行針刺,刺入穴位后連接韓氏穴位神經(jīng)刺激儀,設(shè)置參數(shù)為頻率2/15 Hz,電流為2 mA,以肢體輕微抖動(dòng)為度。每次30 min,每日1次,連續(xù)15 d不間斷。針刺組僅刺入上述兩個(gè)穴位但不予通電。

1.4 模型建立

采用Zea Longa改良線栓法復(fù)制SD大鼠右側(cè)MCAO模型。術(shù)前12 h禁食不禁水,稱重,用水合氯醛腹腔麻醉,暴露顳骨,置于激光多普勒血流監(jiān)測(cè)儀下監(jiān)測(cè)腦部即時(shí)基礎(chǔ)血流。然后將大鼠以仰臥位固定于恒溫臺(tái),分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈,將制備好的線栓,經(jīng)頸總動(dòng)脈分叉下端進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈顱內(nèi)段,阻斷大腦中動(dòng)脈血流,同時(shí)用激光多普勒血流儀監(jiān)測(cè)造模后缺血程度以確定MCAO大鼠造模成功。90 min后再灌注,將栓線提至頸內(nèi)動(dòng)脈起始部,剪去大鼠體外的栓線,即恢復(fù)大腦中動(dòng)脈的血流,同時(shí)予青霉素鈉肌肉注射。假手術(shù)組僅分離頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈,不結(jié)扎及插線。

1.5 MCAO造模質(zhì)量控制

1.5.1 腦血流

MCAO大鼠造模術(shù)前、術(shù)中激光多普勒監(jiān)測(cè)大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈供血區(qū)域血流,若該區(qū)域血流量明顯降低,下降程度至基礎(chǔ)值的(45±10)%[14],則確定MCAO大鼠造模成功。

1.5.2 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分

采用Longa的4分法對(duì)大鼠的神經(jīng)功能進(jìn)行分級(jí)評(píng)分。大鼠于腦缺血再灌注麻醉清醒后,均出現(xiàn)輕重不等的神經(jīng)功能缺失體征,0分為無神經(jīng)功能缺損;1分為懸尾時(shí)左前肢屈曲;2分為爬行時(shí)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分為爬行時(shí)出現(xiàn)向左側(cè)傾倒;4分為意識(shí)障礙或者死亡。神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分為1～3分可確定MCAO大鼠造模成功。剔除評(píng)分為0分和4分的大鼠。

1.6 空間學(xué)習(xí)記憶行為學(xué)功能

用Morris水迷宮[15]觀測(cè)MCAO大鼠手術(shù)前后的空間學(xué)習(xí)與記憶能力,各組大鼠于預(yù)處理第10—14天進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn),即大鼠依次從4個(gè)象限面朝池壁進(jìn)入水中,若大鼠在90 s內(nèi)找到平臺(tái)并停留超過5 s,則記錄其從入水到爬上平臺(tái)的時(shí)間(即潛伏期);若大鼠在入水后90 s內(nèi)未能找到平臺(tái),則由測(cè)試者引至平臺(tái),并在平臺(tái)上停留30 s,潛伏期記為90 s。各組大鼠分別于定位航行試驗(yàn)結(jié)束24 h后和造模24 h后進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn),即撤除平臺(tái),在遠(yuǎn)離平臺(tái)象限的固定入水點(diǎn)將大鼠面向池壁放入水中,所有大鼠必須在同一入水點(diǎn),使其自由游泳90 s,分別記錄各組大鼠造模前后空間探索實(shí)驗(yàn)中90 s內(nèi)穿越原平臺(tái)象限的次數(shù),并進(jìn)行造模前后自身對(duì)照和造模后組間對(duì)照。

1.7 動(dòng)物處死及取材

上述實(shí)驗(yàn)完成后,行水合氯醛腹腔麻醉,用生理鹽水經(jīng)左心室灌注,直至流出液為澄清液體。用于TTC染色的操作為,斷頭取腦,于﹣20℃冰箱中速凍,20 min后置于腦槽中切片。用于免疫熒光染色的操作為,用生理鹽水灌注后再推注多聚甲醛溶液,然后滴注多聚甲醛溶液,30 min后進(jìn)行斷頭取腦,置于多聚甲醛溶液中固定過夜,然后于蔗糖溶液中梯度脫水,﹣80℃凍存后切片,重點(diǎn)取梗死區(qū)及其周圍腦組織。

1.8 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.8.1 腦梗死體積及腦缺血程度

將切片放入TTC染液中,避光,再放入37℃恒溫箱30 min,使之均勻染色,染成紅色的為正常腦組織,白色為梗死腦組織,將染色的腦片按切片順序排列,標(biāo)號(hào)、設(shè)定標(biāo)尺并拍照,利用Image-Pro Plus圖像處理軟件計(jì)算腦梗死體積(梗死體積=每個(gè)腦片梗死面積×2 mm),每個(gè)腦組織梗死的總體積由連續(xù)切割的5～6片腦組織的梗死體積相加所得。最后計(jì)算出梗死總體積相對(duì)于整個(gè)大腦體積百分比,以此結(jié)果做統(tǒng)計(jì)分析。

1.8.2 活化的小膠質(zhì)細(xì)胞和MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)

取玻片復(fù)溫,抗原修復(fù),PBS洗滌3×10 min,封閉,加入一抗anti-iba1(活化的小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物)/ anti-MMP-9,4℃孵育過夜,PBS洗滌5×10 min,加入二抗37℃孵育1 h,PBS洗滌5×10 min,封片。封片后,于共聚焦熒光顯微鏡下采集圖像。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間計(jì)量資料比較采用單因素方差分析,方差齊時(shí)用檢驗(yàn),方差不齊時(shí)用-檢驗(yàn)。以＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MCAO造模質(zhì)量控制

2.1.1 腦血流

MCAO大鼠術(shù)前及術(shù)中采用激光多普勒監(jiān)測(cè)大鼠腦血流,可見右側(cè)大腦中動(dòng)脈供血區(qū)域血流量明顯降低,腦血流下降至基礎(chǔ)值的(45±10)%,確定MCAO大鼠造模成功。詳見圖1、圖2。

圖1 造模模式圖

2.1.2 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分

由表1可見,與假手術(shù)組相比,各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分均顯著升高(＜0.01);與模型組相比,電針預(yù)處理組和針刺組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分均降低,但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05),這可能與每組大鼠數(shù)量較少(每組7～8只)以及可能存在評(píng)分的主觀因素有關(guān)。

2.2 Morris水迷宮

由表2可見,術(shù)前各組大鼠穿越原平臺(tái)象限次數(shù)比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05)。假手術(shù)組大鼠假手術(shù)前后穿越原平臺(tái)象限次數(shù)幾乎不變(＞0.05);其余3組大鼠術(shù)后穿越原平臺(tái)次數(shù)比術(shù)前明顯減少 (＜0.05)。與假手術(shù)組比較,各組大鼠術(shù)后穿越原平臺(tái)象限次數(shù)明顯減少(＜0.01);與模型組相比,電針預(yù)處理組和針刺組大鼠術(shù)后穿越原平臺(tái)象限次數(shù)明顯增多(＜0.05);與針刺組比較,電針預(yù)處理組大鼠術(shù)后穿越原平臺(tái)象限次數(shù)無明顯變化(＞0.05)。各組大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3、圖4。

表1 各組大鼠術(shù)后神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較 (只)

表2 各組大鼠術(shù)前術(shù)后空間探索實(shí)驗(yàn)中穿越原平臺(tái)象限次數(shù)比較 (±s,次)

注:與術(shù)前比較1)＜0.05;與假手術(shù)組比較2)＜0.01;與模型組比較3)＜0.05

注:A為假手術(shù)組,B為模型組,C為電針預(yù)處理組,D為針刺組

注:A為假手術(shù)組,B為模型組,C為電針預(yù)處理組,D為針刺組

2.3 電針預(yù)處理對(duì)MCAO大鼠腦梗死體積的影響

由圖5可見,假手術(shù)組正常腦組織染色為紅色,模型組、電針預(yù)處理組和針刺組腦組織均可見不同程度蒼白色腦組織(梗死灶)。

圖5 各組大鼠的腦組織TTC染色

由圖6可見,與假手術(shù)組相比,各組大鼠腦梗死體積明顯增大(＜0.05);與模型組相比,電針預(yù)處理組和針刺組腦梗死體積明顯減小(＜0.01);與針刺組比較,電針預(yù)處理組腦梗死體積減小不明顯(＞0.05)。

注:與假手術(shù)組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.01

2.4 電針預(yù)處理對(duì)MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)的影響

MMP-9主要位于梗死區(qū)及其周圍腦組織中。由圖7、圖8可見,與假手術(shù)組相比,其余各組大鼠梗死周圍皮質(zhì)中MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多(＜0.01);與模型組相比,電針預(yù)處理組和針刺組大鼠梗死周圍皮質(zhì)中MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少(＜0.01);與針刺組比較,電針預(yù)處理組大鼠梗死周圍皮質(zhì)中MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞減少不明顯(＞0.05)。

2.5 電針預(yù)處理對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響

活化的小膠質(zhì)細(xì)胞主要位于梗死區(qū)及其周圍腦組織中。由圖9可見,假手術(shù)組活化的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量較少,且形態(tài)單一、突觸不明顯;模型組、電針預(yù)處理組、針刺組腦組織均可見大量的活化的小膠質(zhì)細(xì)胞,且形態(tài)多樣。由圖10可見,與假手術(shù)組相比,其余各組大鼠活化的小膠質(zhì)細(xì)胞明顯增多(＜0.01);與模型組相比,電針預(yù)處理組和針刺組活化的小膠質(zhì)細(xì)胞明顯減少 (＜0.01);與針刺組比較,電針預(yù)處理組活化的小膠質(zhì)細(xì)胞減少不明顯(＞0.05)。

圖7 各組大鼠梗死周圍皮質(zhì)中MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞(×400)

注:與假手術(shù)組比較1)P＜0.01;與模型組比較2)P＜0.01

圖9 各組大鼠活化的小膠質(zhì)細(xì)胞(×400)

注:與假手術(shù)組比較1)P＜0.01;與模型組比較2)P＜0.01

3 討論

缺血性卒中多由腦血管血流減少或完全阻塞、腦部血液循環(huán)障礙以致腦組織受損而引起的一系列癥狀,是一個(gè)多因素的、復(fù)雜的發(fā)病過程。大量臨床實(shí)踐證明,一旦發(fā)生完全性卒中,雖有較多缺血性腦血管病的治療方法,但由于我國(guó)群眾對(duì)缺血性卒中早期識(shí)別認(rèn)知度低、農(nóng)村患者離醫(yī)院遠(yuǎn)、院前急救能力不足、院內(nèi)診治延誤、溶栓時(shí)間窗短等因素,導(dǎo)致我國(guó)缺血性卒中救治不足及溶栓率低(僅2.5%)[16],且沒有完整明確的治療方案,多數(shù)卒中患者治療效果不能令人滿意。因此,對(duì)于卒中更應(yīng)強(qiáng)調(diào)“預(yù)防為主”的方針,而研究表明,針刺預(yù)處理有很好的腦保護(hù)效應(yīng),對(duì)預(yù)防缺血性卒中有很好的效果。卒中屬中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范疇,其病機(jī)為各種原因引起氣血逆亂,產(chǎn)生風(fēng)、火、痰、瘀而致腦脈痹阻,竅閉神匿,神不導(dǎo)氣,故醒腦開竅針法是其基本療法[12],且“病變?cè)谀X,首取督脈”。本研究針刺督脈上的百會(huì)和風(fēng)府,并接上電針,以加強(qiáng)醒腦開竅的作用。

BBB是維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要結(jié)構(gòu),腦組織缺血缺氧導(dǎo)致了BBB的初始損傷,再灌注雖可部分逆轉(zhuǎn)腦缺血的級(jí)聯(lián)反應(yīng),但BBB會(huì)因再灌注損傷機(jī)制造成進(jìn)一步損傷[17]。小膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)主要的免疫效應(yīng)細(xì)胞。腦缺血后,小膠質(zhì)細(xì)胞可迅速大量活化,形態(tài)、大小、功能均發(fā)生改變,具有吞噬功能并分泌各種炎癥介質(zhì)[18-21]?；罨男∧z質(zhì)細(xì)胞可能通過以下兩種途徑在腦缺血再灌注損傷過程中發(fā)揮重要作用[22-25],①直接與神經(jīng)細(xì)胞接觸,發(fā)揮吞噬功能造成腦損傷;②進(jìn)一步釋放蛋白水解酶(如MMP-9)和炎性細(xì)胞因子(如TNF-a、IL-1b和IL-6),導(dǎo)致繼發(fā)性腦損傷。小膠質(zhì)細(xì)胞活化后,會(huì)啟動(dòng)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子(如NF-kB)入核,從而啟動(dòng)下游基因,使之表達(dá),釋放與BBB密切相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶(matrimet allopreinase, MMPs)[26]。在目前已探明的20余種MMPs中,MMP-9與腦微血管損傷關(guān)系最為密切[27-29]。MMP-9是一種主要由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞合成分泌的明膠酶,其表達(dá)與BBB的損傷密切相關(guān),與興奮性神經(jīng)毒性、神經(jīng)炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。在腦梗死及炎癥反應(yīng)過程中,MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)增多,通過降解腦血管基質(zhì)的關(guān)鍵成分如緊密連接蛋白,使基膜和緊密連接結(jié)構(gòu)遭到破壞,加重BBB破壞,導(dǎo)致腦水腫和出血性損傷[30-31];MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)增多,還會(huì)增加缺血半暗帶中的神經(jīng)元損傷,從而增大了腦梗死體積。Lin R等[32]研究發(fā)現(xiàn),電針可以減輕腦缺血對(duì)腦超微結(jié)構(gòu)的損傷和抑制BBB中MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)來改善學(xué)習(xí)與記憶能力?？梢?MMP-9分泌增加所致的BBB破壞在缺血性卒中的病理變化中起著關(guān)鍵作用,與腦梗死體積大小、神經(jīng)功能損傷程度、學(xué)習(xí)與記憶能力的喪失密切相關(guān)。因此,在防治缺血性卒中的研究中,下調(diào)MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)是關(guān)鍵。

本實(shí)驗(yàn)通過免疫熒光染色法觀察到模型組梗死區(qū)及其周圍腦組織灰質(zhì)中活化的小膠質(zhì)細(xì)胞和梗死周圍皮質(zhì)中MMP-9明顯增多,其可能的機(jī)制為,腦缺血時(shí),梗死區(qū)腦組織細(xì)胞氧糖剝奪,神經(jīng)細(xì)胞死亡或內(nèi)源性信號(hào)改變,信號(hào)的改變激活小膠質(zhì)細(xì)胞;也可能是缺血時(shí)神經(jīng)元去極化,細(xì)胞外的高濃度鉀離子激活小膠質(zhì)細(xì)胞;亦可能是受損的神經(jīng)細(xì)胞釋放細(xì)胞因子如白介素4(IL-4)和克隆刺激因子激活小膠質(zhì)細(xì)胞[33-34]。小膠質(zhì)細(xì)胞活化后,啟動(dòng)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子(如NF-kB)入核,啟動(dòng)下游基因,使之表達(dá),使活化的小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)一步釋放蛋白水解酶(如MMP-9)和炎性細(xì)胞因子(如TNF-a、IL-1b和IL-6),加重BBB破壞和神經(jīng)細(xì)胞損傷[26]。MMP-9以前酶原形式存在于小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi),缺血后、炎癥發(fā)生時(shí),小膠質(zhì)細(xì)胞中MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯上調(diào)[35-38],BBB結(jié)構(gòu)被破壞,發(fā)生腦梗死、神經(jīng)功能損傷、認(rèn)知功能受損等一系列不良后果。電針預(yù)處理組和針刺組活化的小膠質(zhì)細(xì)胞和MMP-9表達(dá)明顯低于模型組,其可能的機(jī)制為電針預(yù)處理和針刺預(yù)處理均能通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化,降低NF-kB的轉(zhuǎn)錄,抑制MMP-9、TNF-a、IL-1b和IL-6等的分泌,從而減輕腦缺血再灌注損傷。

通過Longa 4分法觀察到模型組大鼠術(shù)后神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分明顯高于假手術(shù)組,通過水迷宮實(shí)驗(yàn)觀察到模型組大鼠在空間探索實(shí)驗(yàn)中穿過原平臺(tái)象限的次數(shù)明顯低于假手術(shù)組,通過TTC染色觀察到模型組大鼠腦梗死體積明顯大于假手術(shù)組,說明腦缺血再灌注會(huì)造成嚴(yán)重的損傷,其可能的機(jī)制為腦缺血再灌注過程中由于自由基、NO、基質(zhì)金屬蛋白酶、細(xì)胞因子、黏附分子、水通道蛋白等物質(zhì)破壞了BBB的結(jié)構(gòu)和功能,中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)被打破,從而發(fā)生了一系列繼發(fā)損傷。電針預(yù)處理組和針刺組腦缺血再灌注損傷明顯輕于模型組,證實(shí)電針預(yù)處理和針刺預(yù)處理均有腦保護(hù)效應(yīng),其可能的機(jī)制為電針預(yù)處理和針刺預(yù)處理均可通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化,使轉(zhuǎn)錄因子NF-kB核移位減少,從而減少M(fèi)MP-9的分泌,減輕腦缺血再灌注損傷后的炎癥反應(yīng),對(duì)腦組織起保護(hù)作用,即電針預(yù)處理和針刺預(yù)處理均可通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化介導(dǎo)的MMP-9信號(hào)通路而發(fā)揮腦保護(hù)效應(yīng)。

通過以上研究和論述,筆者認(rèn)為取百會(huì)、風(fēng)府電針預(yù)處理可通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化介導(dǎo)的MMP-9的信號(hào)通路來減輕腦缺血后BBB的破壞程度,保護(hù)了BBB結(jié)構(gòu)和功能的相對(duì)完整性,從而減輕了腦缺血再灌注損傷,即發(fā)揮了腦保護(hù)效應(yīng)。且筆者認(rèn)為電針預(yù)處理的腦保護(hù)效應(yīng)比針刺預(yù)處理強(qiáng),但由于每組大鼠數(shù)量有限,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05),還需進(jìn)一步深入研究。本研究注重中醫(yī)學(xué)治未病的思想,采用電針預(yù)處理的干預(yù)方法來預(yù)防缺血性卒中,用科學(xué)的數(shù)據(jù)為中醫(yī)學(xué)治未病提供科學(xué)依據(jù),這對(duì)日后預(yù)防缺血性腦血管病提供了新思路,并可能成為易患缺血性腦血管病的高危人群的預(yù)防保健療法。

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Effect of Matrix Metalloproteinase-9 Pathway Mediated by Microglia Activation on the Brain Protective Effect of Electroacupuncture Pretreatment in A Rat Model of Middle Cerebral Artery Occlusion

-,-,-,-,,-,-,,-.

,310053,

By studying the effect of electroacupuncture pretreatment on the cerebral infarct volume, activation of microglia and expression of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) positive cells in a rat model of middle cerebral artery occlusion (MCAO), to evaluate the brain protective effect of electroacupuncture pretreatment on MCAO rats and its related mechanism.Thirty-two health Sprague Dawley (SD) rats were randomized into a sham operation group, a model group, an electroacupuncture pretreatment group and an acupuncture group, with 8 rats in each group. After the electroacupuncture at Baihui (GV20) and Fengfu (GV16) for 15 days, the modified Zea Longa’s thread occlusion method was adopted to prepare the rat model of MCAO. The neurobehavioral score and the ability of learning and memory were observed by using Longa 4-point method and the Morris water maze. The cerebral infarct volume was examined by using 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining method. The activated microglia and MMP-9 positive cells were examined by using immunofluorescence method.Compared with the sham operation group, the cerebral infarct volume, the number of MMP-9 positive cells and the activation of microglia in the model group were significantly increased (＜0.01). Compared with the model group, the cerebral infarct volume, the number of MMP-9 positive cells and the activation of microglia in the electroacupuncture pretreatment group and acupuncture group decreased significantly (＜0.05).The electroacupuncture pretreatment at Baihui (GV20) and Fengfu (GV16) can decrease the cerebral infarct volume in MCAO rats, improve the loss of learning and memory, and exert the brain protective effect. The action mechanism is possibly related to the inhibition of MMP-9 pathway mediated by microglia activation.

Acupuncture therapy; Electroacupuncture pretreatment; Reperfusion injury;Brain ischemia; Microglia; Matrix metalloproteinase-9; Rats

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2020.01.0090

1005-0957(2020)01-0090-08

2019-06-03

國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃(201810344028)

陳麗瑩(1996—),女,2015級(jí)學(xué)生,Email:870717938@qq.com

林咸明(1966—),男,教授,Email:linxianming66@126.com