補(bǔ)腎益氣活血方對(duì)胚胎著床障礙大鼠子宮內(nèi)膜孕激素受體和信號(hào)傳導(dǎo)與活化轉(zhuǎn)錄因子3表達(dá)的影響

鐘志艷 黃冬梅 黃光英

胚胎著床是制約體外受精—胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer, IVF-ET)成功的關(guān)鍵因素，其中子宮內(nèi)膜容受性發(fā)揮著重要作用。卵巢甾體激素、各類細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子以及血管活性物質(zhì)在調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜著床微環(huán)境中扮演重要角色，其中孕激素是著床所必需的，其功能主要由孕激素受體介導(dǎo)，通過促進(jìn)子宮內(nèi)膜蛻膜化的改變，促進(jìn)胚胎著床。胚胎著床過程中，類固醇激素對(duì)子宮內(nèi)膜的作用受到許多重要的細(xì)胞因子和(或)生長因子調(diào)節(jié)，其中如白介素-6(interleukin 6, IL-6)家族中多種細(xì)胞因子：白介素-11(interleukin 11, IL-11)、白血病抑制因子(leukaemia inhibitory factor, LIF)等，它們被證實(shí)與胚胎著床過程關(guān)系密切；其均通過gp130受體進(jìn)行胞內(nèi)信號(hào)傳遞，并介導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)與活化轉(zhuǎn)錄因子3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)的激活[1]。STAT3作為STAT家族中的重要成員，是一種具有轉(zhuǎn)錄作用的蛋白質(zhì)，在調(diào)控細(xì)胞生長、增殖、分化及免疫活動(dòng)中具有重要作用。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，STAT3及其下游通路對(duì)人類子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的增殖和分化至關(guān)重要[2]；條件性敲除子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的STAT3基因，雌性小鼠表現(xiàn)為不孕[3]。課題組前期臨床實(shí)踐[4]發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎益氣活血方能促進(jìn)多次人工輔助生殖治療失敗的患者受孕；且動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究[5]表明，補(bǔ)腎益氣活血方能通過調(diào)節(jié)胚泡著床障礙小鼠雌孕激素及其受體的表達(dá)，促進(jìn)胚胎著床?；谏鲜鑫墨I(xiàn)調(diào)研及結(jié)果，本研究進(jìn)一步探討補(bǔ)腎益氣活血方對(duì)胚胎著床障礙大鼠孕激素受體(progesterone receptor, PR)和STAT3的影響。通過采用米非司酮誘導(dǎo)的胚胎著床障礙大鼠模型，觀察補(bǔ)腎益氣活血方對(duì)模型大鼠子宮內(nèi)膜PR和STAT3表達(dá)的影響，探討補(bǔ)腎益氣活血法促進(jìn)胚胎著床的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用性成熟、未孕SPF級(jí)Wistar雌鼠，體重220～240 g；成年、性成熟SPF級(jí)Wistar雄鼠，體重250～300 g；所需動(dòng)物全部來自于湖北省衛(wèi)生與疾病防控中心，許可證號(hào)為SCXK(鄂)2015-0018。

1.2 主要藥品和試劑

米非司酮(華潤北京紫竹制藥公司，規(guī)格25 mg/片)由同濟(jì)醫(yī)院藥房提供，片劑碾碎后溶于無水乙醇，繼而懸浮于食用芝麻油溶液，制配為2 mg/mL的米非司酮—芝麻油懸液。補(bǔ)腎益氣活血方(桑寄生18 g、黃芪14 g、當(dāng)歸9 g、川芎9 g、丹參9 g)免煎顆粒由同濟(jì)醫(yī)院中藥房提供，用無菌蒸餾水配成1.35 g/mL生藥濃度的無菌制劑，4℃保存。黃體酮注射液(浙江仙琚制藥股份有限公司，規(guī)格1 mL∶10 mg)由同濟(jì)醫(yī)院藥房提供。大鼠孕激素酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)試劑盒(EHC9030)購自武漢欣博盛公司，DAB顯色試劑盒及Cocktail蛋白酶抑制劑由武漢谷歌生物科技有限公司提供；組織總蛋白提取試劑盒以及BCA蛋白溶度測定試劑盒由武漢博士德公司提供。設(shè)計(jì)引物、提取組織總RNA的Trizol提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR036A)、SYBR熒光定量試劑盒(RR420A)、RNA酶游離水購自Takara公司。兔抗大鼠PR多克隆抗體(DF6829)購自美國Affinity生物技術(shù)公司；兔抗大鼠STAT3(4904)單克隆抗體購自美國CST公司；兔抗大鼠GADPH內(nèi)參(ab37168)多克隆抗體購自美國Abcam公司；熒光素標(biāo)記的羊抗兔熒光二抗(072071506)購自KPL公司。

1.3 主要設(shè)備與儀器

各規(guī)格微量加樣槍(德國Eppendorf)，4℃、-20℃、-80℃冰箱(中國海爾)，制冰機(jī)(日本松下)，純水系統(tǒng)(美國Millipore)，電泳槽、電泳儀及轉(zhuǎn)膜槽(美國Bio-Rad)，光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯)，核酸蛋白質(zhì)分析儀(美國Quawell)，PCR擴(kuò)增儀(德國耶拿)，一步法實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國ABI)，Quantityone分析軟件(北京六一廠)，酶標(biāo)儀(美國Bio Tek)，佳能350 d顯微照相系統(tǒng)(日本佳能)，雙色近紅外激光掃描攝像系統(tǒng)(美國Odyssey)。

1.4 動(dòng)物分組與處理

所有大鼠在適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，連續(xù)觀察雌鼠兩個(gè)動(dòng)情周期，動(dòng)情周期正常則納入實(shí)驗(yàn)。將處在動(dòng)情前期的雌鼠和雄鼠于下午6點(diǎn)按2∶1進(jìn)行合籠交配，次日上午8點(diǎn)觀察陰道涂片，以出現(xiàn)大量精子者記錄為懷孕第1天。將全部孕鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、中藥組和黃體酮組，其中正常組10只，模型組22只，中藥組15只，黃體酮組13只。除正常組外，其余三組在懷孕第3天上午9點(diǎn)皮下注射5.5 mg/kg米非司酮—芝麻油懸液進(jìn)行造模處理，正常組則皮下注射等體積芝麻油溶液。中藥組于造模當(dāng)日下午4點(diǎn)開始每日給予補(bǔ)腎益氣活血方灌胃(根據(jù)人-大鼠體表面積換算，每只大鼠每次給予2.3 mL灌胃)直至處死前一天，與此同時(shí)，黃體酮組每日給以黃體酮注射液20 mL/kg(0.5 mL/只)肌肉注射直至處死前一天。

1.5 標(biāo)本收集與指標(biāo)檢測

各組大鼠于懷孕第8天下午4點(diǎn)用1%的戊巴比妥腹腔麻醉后進(jìn)行剖腹。觀察并記錄子宮的顏色、形態(tài)、胚泡大小及數(shù)目，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血留取血液標(biāo)本后摘取子宮標(biāo)本，記錄每只大鼠妊娠情況及著床胚胎個(gè)數(shù)。血液標(biāo)本經(jīng)3000 r/min，離心15分鐘后獲取血清，分裝后存于-80℃冰箱，用于ELISA檢測。根據(jù)ELISA試劑盒使用說明檢測各組大鼠血清孕酮水平，RT-PCR法檢測各組大鼠子宮內(nèi)膜PR和STAT3 mRNA的表達(dá)，Western blot法檢測各組大鼠子宮內(nèi)膜PR及STAT3蛋白表達(dá)。

1.5.1 ELISA檢測血清孕酮水平 嚴(yán)格按照ELISA試劑盒的使用說明和操作步驟，檢測各組大鼠血清孕酮水平。ELISA試劑盒的檢測范圍為0.5～30 ng/mL，靈敏度為0.2 ng/mL，組內(nèi)及組間變異系數(shù)不超過15%。

1.5.2 RT-PCR檢測子宮內(nèi)膜中PR及STAT3 mRNA含量 從-80℃冰箱中取出適當(dāng)保存的子宮胚胎標(biāo)本，在冰面上解凍數(shù)分鐘后，將組織放入無菌的一次性培養(yǎng)皿中，刮取子宮內(nèi)膜組織(第8天子宮組織在體視顯微鏡下小心去除胚胎)，加入1 mL預(yù)冷的Trizol裂解液，在冰上充分碾磨，按試劑盒說明書步驟提取內(nèi)膜組織總RNA，各管取2 μL檢測樣本RNA的純度和濃度，A260/A280在1.8～2.0便可進(jìn)入下一步逆轉(zhuǎn)錄過程。根據(jù)公式(2 μg樣本=濃度μg/μL×體積20μL=樣本體積+ Mix體積+ dH2O體積)計(jì)算出樣本和dH2O的體積，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。用逆轉(zhuǎn)錄所得的cDNA做模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，SYBR?Premix Ex TaqTM(2×) 10 μL、Rox Reference Dye(50×) 0.4 μL、稀釋后上游引物(10μm) 0.4μL、稀釋后下游引物(10 μm) 0.4μL、cDNA 2 μL和RNase-Free H2O組成20 μL反應(yīng)體系，每個(gè)樣本做3個(gè)平行復(fù)孔，以β-actin為內(nèi)參。采用Comparative Delta-delta CT法，每個(gè)標(biāo)本的相對(duì)RNA含量通過2-ΔΔCT計(jì)算得到。具體引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5.3 Western blot檢測子宮內(nèi)膜中PR及STAT3蛋白表達(dá) 從-80℃冰箱中取除凍存的子宮胚胎標(biāo)本，在冰上解凍數(shù)分鐘后，于冰上將組織置于無菌的一次性培養(yǎng)皿中，刮取子宮內(nèi)膜組織(第8天子宮組織在體視顯微鏡下小心去除胚胎)，按1 mL∶20 μL∶10 μL的比例配備組織蛋白提取液、蛋白酶抑制劑及PMSF的混合液，子宮內(nèi)膜組織與該混合液與按1∶10加入。在冰面靜置30分鐘后，經(jīng)4℃低溫離心機(jī)獲取上清液，轉(zhuǎn)速12000 r/min，離心15分鐘。經(jīng)BCA蛋白濃度測定試劑盒測定樣品蛋白濃度后，每個(gè)蛋白提取物樣品大致定容，再加1/4體積的上樣緩沖液，煮沸10分鐘蛋白變性，所得樣品分裝后保存在-80℃冰箱。制備10%SDS-PAGE膠，加樣后進(jìn)行電泳，先80伏特30分鐘而后120伏特1小時(shí)跑膠，將跑膠后分離的目的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，在室溫條件下，經(jīng)過5%的脫脂牛奶封閉2小時(shí)后，去除多余牛奶，給予相應(yīng)一抗于4℃冰箱孵育過夜。PR、STAT3和GAPDH(內(nèi)參)的一抗稀釋濃度分別為1∶1000、1∶2000、1∶5000。第二天PBST洗5次,每次10分鐘，避光加入恰當(dāng)?shù)臒晒舛?按1∶10000稀釋)室溫孵育1小時(shí)，PBST避光洗4次,每次5分鐘，用雙色近紅外激光攝像系統(tǒng)掃膜。所得圖片用Image J計(jì)算灰度比值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠胚胎著床情況比較

肉眼觀察可見正常組子宮血供豐富，胚泡呈串珠狀隆起，大小均等，分布均勻；模型組子宮蒼白，部分子宮腔變細(xì)，胚泡數(shù)減少，胚泡較多融合；中藥組子宮血供較模型組豐富，胚泡數(shù)較模型組增多，胚泡大小及分布較為均等；黃體酮組子宮血供較為豐富，但不及正常組，胚泡數(shù)較模型組增多，胚泡大小及分布較模型組均勻。見圖1。與正常相比，模型組懷孕率明顯下降(P<0.05)，平均著床胚胎數(shù)明顯減少(P<0.05)；與模型組比較，中藥組和黃體酮組懷孕率及平均著床胚胎數(shù)均明顯增加(P<0.05)；與黃體酮組相比，中藥組妊娠情況無顯著性差異(P>0.05)。見表2。

注：A：正常組；B：模型組；C：中藥組；D：黃體酮組。

圖1各組胚胎著床障礙大鼠第8天子宮形態(tài)圖

表2 各組胚胎著床障礙大鼠第8天 懷孕率及平均著床胚胎數(shù)比較

注： 與正常組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05。

2.2 各組胚胎著床障礙大鼠血清孕酮含量比較

與正常組比較，模型組血清孕酮含量明顯下降(P<0.05)；與模型組相比，中藥組和黃體酮組血清孕酮含量均顯著增加(P<0.05)；與黃體酮組比較，中藥組血清孕酮含量明顯降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組胚胎著床障礙大鼠血清孕酮含量比較

注： 與正常組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05；與黃體酮組相比，cP<0.05。

2.3 各組胚胎著床障礙大鼠子宮內(nèi)膜中PR及STAT3的mRNA表達(dá)情況

與正常組相比，模型組子宮內(nèi)膜PR mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)，STAT3 mRNA表達(dá)無顯著差異(P>0.05)；與模型組相比，中藥組子宮內(nèi)膜PR mRNA表達(dá)顯著增加(P<0.05)，STAT3 mRNA表達(dá)無顯著差異(P>0.05)，與模型組相比，黃體酮組子宮內(nèi)膜PR及STAT3 mRNA表達(dá)均無顯著差異(P>0.05)；與黃體酮組相比，中藥組子宮內(nèi)膜PR及STAT3 mRNA表達(dá)均無顯著差異(P>0.05)。見表4。

表4 各組胚胎著床障礙大鼠子宮內(nèi)膜中PR及STAT3 的mRNA表達(dá)比較

注： 與正常組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05。

2.4 各組胚胎著床障礙大鼠子宮內(nèi)膜PR及STAT3蛋白表達(dá)情況

與正常組相比，模型組子宮內(nèi)膜PR及STAT3蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，中藥組和黃體酮組子宮內(nèi)膜PR及STAT3蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)。與黃體酮組相比，中藥組子宮內(nèi)膜PR及STAT3蛋白表達(dá)無顯著差異(P>0.05)。見圖2表5。

注：N：正常組；M：模型組；BR：中藥組；P：黃體酮組。

圖2 各組胚胎著床障礙大鼠子宮內(nèi)膜PR 及STAT3蛋白表達(dá)(Western blot)表5 各組胚胎著床障礙大鼠子宮內(nèi)膜中PR 及STAT3蛋白表達(dá)比較

注： 與正常組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05。

3 討論

眾所周知，孕激素是維持妊娠的重要激素；在胚胎著床過程中，孕激素是子宮內(nèi)膜轉(zhuǎn)化為分泌組織的必備因素，其有利于胚胎的黏附及維持黏附之后的蛻膜化反應(yīng)[6]。孕激素的效應(yīng)主要由PR介導(dǎo)，PR缺失的雌性小鼠表現(xiàn)為不孕，并在子宮和卵巢功能方面有著不同程度的缺陷。米非司酮作為PR的競爭性拮抗劑，能阻斷孕激素的靶效應(yīng)從而干擾著床。胚胎著床前期米非司酮的應(yīng)用，可阻滯子宮內(nèi)膜的發(fā)育，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜與胚胎發(fā)育不同步，而影響著床。在嚙齒動(dòng)物中，胚胎著床發(fā)生于懷孕的第4天傍晚至第5天凌晨[7]，此時(shí)子宮內(nèi)膜在雌、孕激素等的調(diào)節(jié)下，發(fā)生一系列復(fù)雜而精密的變化，為胚胎植入創(chuàng)造適宜的微環(huán)境。大鼠妊娠第3天，發(fā)育良好的胚泡開始移行于子宮腔，此時(shí)皮下注射米非司酮可排除其對(duì)胚胎本身發(fā)育及輸卵管運(yùn)動(dòng)的影響，較好地建立大鼠胚胎著床障礙動(dòng)物模型[8]。此外，此模型可以較好地模仿IVF-ET過程中子宮內(nèi)膜容受性低下的狀態(tài)，為進(jìn)一步探討有關(guān)機(jī)制并尋求解決手段提供基礎(chǔ)。

一般認(rèn)為，IL-6家族細(xì)胞因子對(duì)于胚胎植入的意義重大[9]。STAT3是IL-6家族細(xì)胞因子活化的重要通路和中心環(huán)節(jié)，STAT3的活化能幫助提高子宮內(nèi)膜容受性[10]。此外，有研究[11]表明，STAT3通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用協(xié)同PR在胚胎著床中發(fā)揮重要作用。本研究著眼于PR及STAT3在胚胎著床中的作用，探討補(bǔ)腎益氣活血方對(duì)胚胎著床障礙大鼠子宮內(nèi)膜PR及STAT3表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，模型組大鼠第8天子宮內(nèi)膜PR及STAT3蛋白表達(dá)顯著減少，提示米非司酮所致的大鼠胚胎著床障礙通過降低PR及STAT3蛋白表達(dá)而減少著床，而補(bǔ)腎益氣活血方能顯著增加子宮內(nèi)膜PR及STAT3蛋白表達(dá)，促進(jìn)基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化，從而促進(jìn)胚胎著床。各組STAT3 mRNA表達(dá)雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(可能與樣本數(shù)有限以及動(dòng)物個(gè)體差異過大有關(guān))，但模型組STAT3 mRNA含量低于其他三組，提示STAT3在促進(jìn)胚胎著床、維持基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化中有著重要作用。模型組子宮內(nèi)膜PR mRNA與正常組相比顯著降低，這與文獻(xiàn)[12]報(bào)道米非司酮能降低妊娠大鼠PR基因及蛋白的表達(dá)相一致。中藥組與模型組相比PR mRNA有顯著增加，而黃體酮組與模型組相比PR mRNA無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示補(bǔ)腎益氣活血方可能存在其他途徑改善子宮內(nèi)膜PR基因表達(dá)。而補(bǔ)腎益氣活血方能顯著提高模型大鼠第8天子宮內(nèi)膜PR的蛋白和mRNA表達(dá)，表明該方改善胚胎著床的效應(yīng)與增加子宮內(nèi)膜PR表達(dá)密切相關(guān)。

補(bǔ)腎益氣活血方以補(bǔ)腎為立方之本，兼以益氣、活血，其中桑寄生等補(bǔ)腎固沖之要藥，有取自古方壽胎丸之意；另有丹參、當(dāng)歸活血養(yǎng)血，黃芪益氣以生血，全方發(fā)揮補(bǔ)腎、益氣、活血、安胎的功效。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給予補(bǔ)腎益氣活血方后，模型大鼠懷孕率及平均著床胚胎數(shù)均顯著增加，子宮內(nèi)膜發(fā)育趨于同步化，且血清孕酮水平、子宮內(nèi)膜PR及STAT3表達(dá)顯著提高，表明補(bǔ)腎益氣活血方在一定程度能上提高子宮內(nèi)膜PR及STAT3表達(dá)，改善子宮內(nèi)膜容受性，促進(jìn)胚泡成功著床。中藥組與黃體酮組相比，懷孕率、平均著床胚胎數(shù)及子宮內(nèi)膜PR及STAT3表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；中藥組血清孕酮水平雖低于黃體酮組，但結(jié)合中藥組的懷孕率及平均著床胚胎數(shù)可推測：補(bǔ)腎益氣活血方可能不僅限于通過補(bǔ)充孕激素來改善胚胎著床。

綜上，補(bǔ)腎益氣活血方能改善大鼠胚胎著床及促進(jìn)胚胎生長，其作用與改善子宮內(nèi)膜PR及STAT3的表達(dá)密切相關(guān)，但二者的具體協(xié)同作用機(jī)理有待于進(jìn)一步發(fā)掘證實(shí)。