柑橘醋中黃酮類化合物含量及其與總黃酮含量關(guān)系研究

黎程鳳，秦磊磊 ，楊年華 ，李素媛 ，王應喜 ，胡飛飛，鄧張雙，，*

(1.三峽大學天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點實驗室，湖北 宜昌 443002；2.三峽公共檢驗檢測中心，國家磷產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，湖北 宜昌443002；3.湖北土老憨調(diào)味食品股份有限公司，湖北 宜都 443302)

柑橘醋是以宜昌市出產(chǎn)的新鮮、成熟的柑橘類水果為原料，經(jīng)多重工藝發(fā)酵而得，具有柑橘的獨特風味和天然色澤[1]。柑橘果醋相比糧食釀制的食醋營養(yǎng)更豐富，維生素及生物活性物質(zhì)更多，具有很好的抗氧化能力[2]，產(chǎn)品附加值高，商業(yè)價值高，同時對促進我國柑橘產(chǎn)業(yè)的發(fā)展也具有積極意義。

柑橘作為柑橘醋的發(fā)酵原料，其大部分的營養(yǎng)成分也將在柑橘醋中保留，研究顯示柑橘類水果多富含黃酮類化合物[3]，具有增強人體免疫能力、抑菌消炎、預防糖尿病以及心血管疾病等功效[4]。黃酮類化合物指的是兩個具有酚羥基的苯環(huán)同中間三碳相互連接而成的一系列化合物[5]，大多數(shù)具有2-苯基色原酮(C6-C3-C6)的基本骨架，目前在柑橘中已鑒定出來約60多種黃酮類化合物，主要歸屬于黃烷酮、黃酮、黃酮醇和花青苷四大類[6]。柑橘果實中還存在一系列多甲氧基黃酮(PMFs)，該系列化合物在黃酮骨架上含有4個以上甲氧基基團，其中橘皮素、川陳皮素、5-去甲基川陳皮素等多甲氧基黃酮是柑橘屬植物表皮的特有成分[7]，柑橘類果實中由于黃酮以及多甲氧黃酮含量分布的差異，果實營養(yǎng)成分以及質(zhì)量標準也存在一定的差異[8]。

本實驗中將對柑橘醋中指標性黃酮類化合物進行分離和鑒定，同時對柑橘醋中指標性化合物含量及總黃酮含量進行檢測，分析黃酮類化合物含量與總黃酮含量的關(guān)系，更好地了解柑橘醋的特性，對醋的質(zhì)量進行監(jiān)控，提高產(chǎn)品的品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

柑橘醋原漿(成品)：由湖北省宜昌市湖北土老憨生態(tài)農(nóng)業(yè)集團出品。

1.1.2 材料與試劑

乙酸乙酯(分析純)：天津市恒興化學試劑有限公司；甲醇(分析純)：國藥集團化學試劑有限公司；無水乙醇(分析純)：天津市天力化學試劑有限公司；甲醇(色譜純)：美國Tediatedia公司；水：華潤怡寶飲料(中國)有限公司；蘆丁標準品(批號161219)：北京世紀奧科生物技術(shù)有限公司；亞硝酸鈉(分析級)、硝酸鋁(分析級)：天津市光復科技發(fā)展有限公司；氫氧化鈉(分析級)：天津市博迪化工有限公司；沒食子酸標準品(實驗室自制)：現(xiàn)存于湖北省宜昌市三峽大學天然產(chǎn)物重點實驗室；濃度1 mol/L H+福林-酚顯色劑(分析純)：天津市光復精細化工研究所；碳酸鈉(分析純)：西隴化工股份有限公司；蒸餾水。

1.1.3 儀器與設備

FA2204B萬分之一電子分析天平 上海越平科學儀器有限公司；N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 日本EYELA儀器公司；1525EF 高效液相色譜儀 美國Waters公司；Dionex Ultimate 3000高效液相色譜儀 美國DIONEX公司；Bruker-ARX-400核磁共振波譜儀；微孔濾膜(有機相，0.22 μm)；25 μL微量進樣針 上海高鴿工貿(mào)有限公司；分析型色譜柱(YMC-Pack ODS-A C18，100 ?，4.6 mm×250 mm×5 μm)；制備型色譜柱(YMC-Pack ODS-A C18，100 ?，10 mm×250 mm×5 μm)；柱層析硅膠(200～300目)；D-101大孔吸附樹脂；薄層層析硅膠板(200 mm×200 mm) 青島海洋化工廠；10 mL容量瓶、100 mL容量瓶、移液管、天波量筒；石英比色皿；UV-3010型紫外可見分光光度計 日本Hitachi公司。

1.2 方法

1.2.1 黃酮類化合物分離鑒定

對于柑橘醋中黃酮類化合物的分離提取方法有很多，包括溶劑萃取法、超聲波輔助醇提法、微波輔助醇提法、二氧化碳超臨界流體萃取法等[9-12]，由于本實驗樣品為液態(tài)，因此采用有機溶劑乙酸乙酯對柑橘醋樣品進行萃取。

取4 L柑橘醋樣品，采用10 L乙酸乙酯溶劑對樣品反復萃取、靜置、濃縮，得到乙酸乙酯部分浸膏10.4 g。將乙酸乙酯浸膏通過D-101大孔吸附樹脂層析柱(流動相：乙醇和水)粗分離，經(jīng)10%、30%、50%、70%、90%、100%乙醇梯度沖洗，按濃度梯度旋蒸濃縮，得到Fr.1～Fr.6號粗浸膏，分別取適量樣品用60%甲醇溶解，微孔濾膜過濾后各取10 μL通過高效液相色譜儀進行分析(流動相：甲醇/水10%～100%，紫外吸收波長：220 nm，運行時間：30 min)，選取其中化合物含量較多的Fr.2號和Fr.3號片段進行正向硅膠柱二次分離(流動相：甲醇/二氯甲烷)，梯度沖洗得到Fr.2-1～Fr.2-15以及Fr.3-1～Fr.3-14共29個片段，選取Fr.2中Fr.2-12號，F(xiàn)r.3中Fr.3-3號通過高效液相色譜儀進行制備，得到化合物2-12-1、3-3-2、3-3-3，核磁共振鑒定3個化合物結(jié)構(gòu)，經(jīng)與文獻對比分析可知3種化合物分別為：柚皮苷[13]、柚皮素[14]、橙皮素[15]。

將柑橘醋乙酸乙酯萃取物通過高效液相色譜儀進行分析(流動相：甲醇/水10%～100%梯度沖洗，紫外吸收波長：220 nm，運行時間：60 min)，分析結(jié)果見圖1。在同一樣品中，柚皮苷、柚皮素、橙皮素這3個化合物分離度好，基線分離效果好，保留時間同標準品對比差異小，樣品峰純度高，證明上述液相分析條件可用于柑橘醋中黃酮類化合物柚皮苷、柚皮素、橙皮素含量的測定，3個化合物各自保留時間分別為28.07，36.54，37.44 min。

圖1 柑橘醋半成品乙酸乙酯浸膏高效液相分析色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram analysis of semi-finished ethyl acetate extract of citrus vinegar

1.2.2 黃酮類化合物含量測定

1.2.2.1 柚皮苷含量檢測方法

a.標準品溶液和樣品溶液的配制

將分離出的2.6 mg柚皮苷標準品用60%色譜甲醇溶液稀釋定容至1 mL容量瓶中，得到柚皮苷標準品母液濃度為2.6 mg/mL。

取柑橘醋原漿溶液25 mL，用100 mL乙酸乙酯進行萃取，劇烈振搖3 min后，靜置1 min，取乙酸乙酯部分，干燥濃縮得到浸膏，用60%甲醇溶液稀釋定容至10 mL容量瓶中，得到樣品溶液。

b.繪制標準曲線

用移液槍從柚皮苷標準品母液中精確吸取標準品溶液25，50，100，150，200 μL，分別置于1 mL容量瓶中用60%甲醇溶液定容，得到0.065，0.13，0.26，0.39，0.52 mg/mL 5個不同濃度的標準溶液，各取10 μL樣品進入高效液相經(jīng)分析柱按上述分析條件進行分析，標準品保留時間為28.0 min。每份標準溶液進樣2次，其峰面積平均值為縱坐標(Y軸)，標準品濃度為橫坐標(X軸)，繪制標準曲線，得到標準曲線方程：y=0.0035x-0.0052；R2=0.9991。

c.樣品含量測定

取10 μL樣品溶液進入高效液相分析，分析條件同上，保留時間28 min左右的色譜峰即為柚皮苷樣品峰。將測量峰面積帶入上述標準曲線方程，測得濃度，經(jīng)計算得樣品柚皮苷含量。

d.計算

樣品柚皮苷含量計算公式：

1.2.2.2 柚皮素含量檢測方法

a.標準品溶液和樣品溶液的配制

將分離出的12.5 mg柚皮素標準品用色譜甲醇溶液稀釋定容至10 mL容量瓶中，得到柚皮素標準品母液濃度為1.25 mg/mL。

樣品溶液的配制方法同上。

b.繪制標準曲線

用移液槍從母液中精確吸取100，250，500，1000 μL的標準品溶液1.5 mL，分別置于10 mL容量瓶中，用100%甲醇溶液定容，得到0.0125，0.03125，0.0625，0.125，0.1875 mg/mL 5個不同濃度的標準溶液，各取10 μL樣品進入高效液相經(jīng)分析柱按上述分析條件進行分析，標準品保留時間為36.0 min。每份標準溶液進樣2次，其峰面積平均值為縱坐標(Y軸)，標準品濃度為橫坐標(X軸)繪制標準曲線，得到標準曲線方程：y=0.0023x+0.001；R2=0.9999。

c.樣品含量測定

樣品溶液按上述條件分析，保留時間36 min左右的色譜峰即為柚皮素樣品峰。將測量峰面積帶入上述標準曲線方程，測得濃度，經(jīng)計算得樣品柚皮素含量。

d.計算

樣品柚皮素含量計算公式：

1.2.2.3 橙皮素含量檢測方法

a.標準品溶液和樣品溶液的配制

將分離出的橙皮素標準品5.7 mg用色譜甲醇溶液將標準品稀釋定容至10 mL容量瓶中，得到橙皮素標準品母液濃度為0.57 mg/mL。

樣品溶液的配制方法同上。

b.繪制標準曲線

用移液槍從母液中精確吸取250，500，1000 μL的標準品溶液1.5，2 mL，分別置于10 mL容量瓶中，用100%甲醇溶液定容，得到0.01425，0.0285，0.057，0.0855，0.114 mg/mL 5個不同濃度的標準溶液，各取10 μL樣品進入高效液相經(jīng)分析柱按上述分析條件進行分析，標準品保留時間為36.0 min。每份標準溶液進樣2次，其峰面積平均值為縱坐標(Y軸)，標準品濃度為橫坐標(X軸)，繪制標準曲線，得到標準曲線方程：y=0.0027x+0.0024；R2=0.9992。

c.樣品含量測定

樣品溶液按上述條件分析，保留時間37 min左右的色譜峰即為橙皮素樣品峰。將測量峰面積帶入上述標準曲線方程，測得濃度，經(jīng)計算得樣品橙皮素含量。

d.計算

樣品橙皮素含量計算公式：

1.2.3 總黃酮含量測定方法

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物柚皮苷，為黃色粉末(CH3OH)，化合物分子式為C27H32O14。13C NMR (100 MHz,DMSO-d6) δ:198.2(C-4),163.9(C-7),166.0(C-2),163.7(C-4′),163.6(C-5),158.8(C-9),129.526(C-2′), 129.4(C-6′),116.2(C-1′),116.2(C-3′,5′),106.2(C-10),104.3(C-3),101.6(C-1?),100.3(C-6),100.3(C-1″),96.4(C-8),79.6(C-3?),79.5(C-2″),77.2(C-3″),76.5(C-5″),73.9(C-5?),73.0(C-4?),71.7(C-2?),71.2(C-4″),66.9(C-6″),18.8(C-6?)。

化合物柚皮素，為黃色粉末(CH3OH) ，化合物分子式為C15H12O5。13C NMR (DMSO-d6,100 MHz) δ:196.6(C-4),167.8(C-7),163.9(C-5),163.4(C-9),158.2(C-4′),129.4(C-1′),128.8(C-2′,6′), 115.6(C-3′,5′), 102.0(C-10),96.4(C-6),95.6(C-8),78.8(C-2),42.5(C-3)。

化合物橙皮素，為黃色粉末(CH3OH) ，化合物分子式為C16H14O6。13C NMR (DMSO-d6,100 MHz)δ:196.6(C-4),167.3(C-7),163.9(C-5),163.3(C-9),148.4(C-4′),146.9(C-3′),131.6(C-1′),118.1(C-6′),114.5(C-2′),112.4(C-5′),102.2(C-10),96.3(C-6),95.5(C-8),78.7(C-2),56.1(4′-OCH3),42.6(C-3)。

2.2 黃酮類化合物含量

2.2.1 樣品柚皮苷含量

取9個批次樣品溶液各3份進入高效液相按上述檢測條件分析，將3次樣品測得峰面積帶入標準曲線方程 y=0.0035x-0.0052，測得濃度，帶入公式進行換算，取其平均值即為樣品柚皮苷含量，見表1。

表1 9個不同批次柑橘醋樣品柚皮苷含量Table 1 Content of naringin in 9 different batches of citrus vinegar

測得9個批次柑橘醋樣品柚皮苷含量最高為134.1 mg/L，最低為57.7 mg/L，9個批次樣品相對標準偏差平均值為0.22%，該檢測方法準確性與重復性高。

2.2.2 樣品柚皮素含量

取9個批次樣品溶液各3份進入高效液相按上述檢測條件分析，將3次樣品測得峰面積帶入標準曲線方程y=0.0023x+0.001，測得濃度，帶入公式進行換算，取其平均值即為樣品柚皮素含量，見表2。

表2 9個不同批次柑橘醋樣品柚皮素含量Table 2 Content of naringenin in 9 different batches of citrus vinegar

測得9個批次柑橘醋樣品柚皮素含量最高為28.3 mg/L，最低為9.9 mg/L，9個批次樣品相對標準偏差平均值為0.88%，該檢測方法準確性與重復性高。

2.2.3 樣品橙皮素含量

取9個批次樣品溶液各3份進入高效液相按上述檢測條件分析，將3次樣品測得峰面積帶入標準曲線方程y=0.0027x+0.0024測得濃度，帶入公式進行換算，取其平均值即為樣品橙皮素含量，見表3。

表3 9個不同批次柑橘醋樣品橙皮素含量Table 3 Content of hesperitin in 9 different batches of citrus vinegar

測得9個批次柑橘醋樣品橙皮素含量最高為20.7 mg/L，最低為6.1 mg/L，9個批次樣品相對標準偏差平均值為0.99%，該檢測方法準確性與重復性高。

2.3 總黃酮含量

取9個批次柑橘醋(成品)按上述方法檢測，將5次測得樣品吸光度帶入標準曲線方程y=16.858x-0.2014，測得濃度，帶入公式進行換算，取其平均值即為樣品總黃酮含量，見表4。

表4 9個批次柑橘醋(成品)總黃酮含量Table 4 Total flavonoids content of 9 batches of citrus vinegar (finished product)

測得9個批次柑橘醋樣品總黃酮含量最高為640.9 mg/L，最低為449.1 mg/L，9個批次樣品相對標準偏差平均值為1.85%，該檢測方法準確性與重復性高。

3 結(jié)論

本實驗采用大孔吸附樹脂、正相硅膠色譜以及制備型HPLC等分離方法，從柑橘醋乙酸乙酯萃取物中分離鑒定出柑橘醋中指標性化合物柚皮苷、柚皮素、橙皮素，證明這3種化合物的含量及比例分配可以有效地反映出柑橘醋發(fā)酵質(zhì)量。采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法對柑橘醋成品中總黃酮含量進行測定。通過對9個批次柑橘醋成品總黃酮含量進行測定測得：9個批次柑橘醋樣品總黃酮含量為449.1～640.9 mg/L，相對標準偏差平均值為1.85%，證明該檢測方法重復性高，加標回收率測定結(jié)果相對標準偏差為1.96%，<2%，證明該方法具有良好的準確性，適用于柑橘醋中總黃酮含量的測定。

對9個批次樣品中柚皮苷、柚皮素、橙皮素含量及總黃酮含量進行分析。其中4號和8號兩個批次總黃酮含量較其他批次高，其柚皮素與橙皮素含量與其他批次相比較低，柚皮苷含量較高；2號和9號兩個批次樣品總黃酮含量較其他批次低，其柚皮素與橙皮素含量與其他批次相比較高，柚皮苷含量偏低。證明樣品總黃酮含量的高低與樣品中柚皮苷、柚皮素、橙皮素的含量及比例分配存在一定關(guān)系，總黃酮含量的高低與柚皮苷含量呈正比例關(guān)系，與柚皮素、橙皮素的含量呈反比例關(guān)系。但其中3號批次樣品實驗結(jié)果不符合上述結(jié)論，其總黃酮含量低于其他批次樣品，但其柚皮苷高于部分批次樣品，柚皮素與橙皮素含量也較低。對于這一反常情況，我們通過文獻調(diào)研了解到，柚皮素和橙皮素兩種化合物均難溶于水，根據(jù)實驗研究顯示，在柑橘醋發(fā)酵的過程中能溶于水的柚皮苷會轉(zhuǎn)化為難溶于水的柚皮素、橙皮素產(chǎn)生沉淀，導致柑橘醋成品中柚皮素與橙皮素含量低。因此，柑橘醋中黃酮類化合物的含量與總黃酮含量的關(guān)系還需要多項實驗結(jié)果綜合分析，并對更多批次樣品檢測結(jié)果統(tǒng)計分析進行確定。

在后期實驗中還需要對柑橘醋發(fā)酵過程中的沉淀物進行分析，了解柑橘醋發(fā)酵過程中化合物的變化。同時對大量批次的柑橘醋樣品進行上述實驗分析，得到統(tǒng)計學數(shù)據(jù)以驗證目前所得的結(jié)論，對于分析柑橘醋中黃酮類化合物的含量與總黃酮含量的關(guān)系以及在工業(yè)上對柑橘醋質(zhì)量分析進行進一步的研究。