基于UF、GFC及RP-HPLC的長牡蠣(Crassostrea gigas)蛋白抗衰老小分子活性肽(Zel'ner)的純化及結(jié)構(gòu)解析*

何定芬 謝 超 梁 佳 梁瑞萍 李海波

(1.浙江國際海運(yùn)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 舟山 316021；2.浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院 舟山 316022)

隨著社會的發(fā)展,海洋生物已被認(rèn)為是具有重要營養(yǎng)和藥用價(jià)值的生物活性化合物的豐富來源。牡蠣是世界養(yǎng)殖第一大貝類,也是中國養(yǎng)殖最大的貝類(闕華勇等,2003；于文超等,2015),因富有極高的營養(yǎng),被譽(yù)為“海底牛奶”(陳艷輝等,2011)。牡蠣含有鈣、磷、鋅和維生素等營養(yǎng)物質(zhì),高蛋白,低脂肪(董曉偉等,2004；葉盛權(quán)等,2009；劉慧等,2012；邱娟等,2017),具有避免過度疲勞、改善身體機(jī)能等功能(汪何雅等,2003),是我國第一批被列為藥食同源的食品之一。

近年來,海洋生物活性肽引起了人們的廣泛關(guān)注,其具有多種生物學(xué)特性,例如抗氧化、抗高血壓、抗人類免疫缺陷病毒、抗增殖、抗凝血、抗肥胖、抗糖尿病活性等(姜紅,2008),對人體健康有許多有利的影響。相比于蛋白質(zhì),小分子肽具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡單、毒副作用小且易被機(jī)體吸收等優(yōu)點(diǎn)(龐婉婷等,2018),相比大分子量的多肽活性更強(qiáng),能夠直接作用于人體細(xì)胞且效果十分迅速(范秀萍等,2008)。但是,目前我國對牡蠣的深加工能力還十分欠缺,而研究小分子肽產(chǎn)品可以使牡蠣的營養(yǎng)和價(jià)值得到高效利用,因此,牡蠣小分子肽的研究有著非常大的市場前景和社會意義。

羅齊軍等(2013)發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充牡蠣多肽可以改善長期大負(fù)荷訓(xùn)練導(dǎo)致的低血糖。牡蠣肽可在一定程度上增強(qiáng)小鼠免疫功能(陳曉文等,2016),牡蠣水解產(chǎn)物對小鼠有抗腫瘤活性和免疫作用(Wanget al,2010)。盡管有關(guān)牡蠣肽的加工國內(nèi)外已有不少報(bào)道(Zhanget al,2009；Lauet al,2013；Zhanget al,2017),但是有關(guān)牡蠣小分子肽的情況卻研究甚少。本研究通過對牡蠣小分子肽分離純化,得到牡蠣天然肽,并對其分子量和氨基酸成分進(jìn)行了分析,提高了牡蠣的綜合利用,為牡蠣的加工提供了新的方向和思路。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

牡蠣購于舟山常青海洋食品有限公司,采用低溫碎冰保鮮運(yùn)送方式30min內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室,于-80°C下保藏；DPPH梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；胰島素等標(biāo)準(zhǔn)品,美國Sigma公司；氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品,北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司。

1.2 主要儀器和設(shè)備

紫外檢測器HD-21-2,北京京普科技有限公司；高效液相色譜儀1100,上海硅儀生化科技有限公司；氨基酸分析系統(tǒng)LC98-I AAA,北京溫分公司。

1.3 方法

1.3.1 牡蠣蛋白水解液制備 在風(fēng)味蛋白酶酶添加量1.3%、pH 7、酶解5h條件下進(jìn)行酶解,煮沸12—15min滅酶,8000—9600r/min離心 30—45min,濾液即為水解液。

1.3.2 硫酸銨分級沉淀 向水解液中加入硫酸銨粉末,使之飽和度分別達(dá)到30%、70%和100%,分別得到沉淀a、b、c,再分別過0.2—0.25μm微孔濾膜得到各個(gè)組分的蛋白。

1.3.3 超濾(UF)膜分子量分級 收集水解液,稀釋后分別通過截留分子量1kDa、3kDa的超濾膜,收集兩組牡蠣小分子蛋白肽,組分a：Mw＜1kDa；組分b：1kDa＜Mw＜3kDa。

1.3.4 凝膠過濾層析(GFC)取2g凍干水解液樣品懸液和2mL 0.05mol/L PBS,pH 7.0,然后離心1500r/min 20min。將透明上清液涂于Sephadex G-15柱(1.6cm×80cm),用0.01mol/L PBS按流速0.3mL/min洗脫通過測定,得到洗脫曲線,用紫外分光光度計(jì)在230nm和280nm處測定吸光度。表現(xiàn)出清除羥基自由基活性的組分收集并凍干得到粉末。利用反相高效液相色譜,以乙腈為有機(jī)改性劑(叢艷君等,2017),在線性梯度洗脫條件下進(jìn)行分離；色譜柱：Kromasil ODS柱；流動相：洗脫液A(0.1%三氟乙酸),洗脫液B(90.4%乙腈和0.1%三氟乙酸)。

1.3.5 反相高效液相色譜(RP-HPLC)確定牡蠣蛋白小分子肽的分子量 選用胰島素標(biāo)準(zhǔn)品配置0.2mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液,測定分子量分布范圍。凝膠色譜柱：TSK gel 2000 PWXL(7.8mm×300mm)；流動相：含 0.1%的三氟乙酸的乙腈水溶液(1：1)；流速：0.5mL/min；柱溫：室溫；檢測波長220nm；進(jìn)樣量：10μL。組分a對照品色譜條件同上,進(jìn)樣量設(shè)置為50μL(黃丹丹等,2017)。

1.3.6 DPPH自由基清除能力的測定 取1mL H2O和樣品分別加入250μL濃度為0.02%DPPH,99.5%乙醇和1mL乙醇作為空白組和實(shí)驗(yàn)組,取1mL樣品加入250μL乙醇和1mL乙醇作為對照組,避光放置6min,于517nm處測吸光度。DPPH清除率計(jì)算公式如下：

式中：A0為對照組吸光度；Ai為樣品組吸光度；Aj為空白組吸光度(邱軍強(qiáng)等,2017)。

1.3.7 樣品溶液配制 根據(jù)北京溫分公司LC98-I AAA氨基酸分析系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)配置標(biāo)準(zhǔn)溶液。取樣品粉末100mg,加6mol/L鹽酸4mL,充入氮?dú)?于110°C下反應(yīng)22—24h,拿出后放置至室溫；參考李智等(2017)的方法進(jìn)行酸水解；參考于文清等(2014)的方法在35°C的電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中進(jìn)行衍生反應(yīng),所得樣品作為牡蠣小分子肽樣品溶液。

1.3.8 牡蠣小分子肽氨基酸的成分測定 采用北京溫分公司LC98-I AAA氨基酸分析系統(tǒng),準(zhǔn)確量取對照品、樣品溶液60μL完成進(jìn)樣,每次實(shí)驗(yàn)做兩次平行,得到牡蠣小分子多肽的色譜圖。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2007對數(shù)據(jù)進(jìn)行制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 牡蠣酶解液蛋白沉淀結(jié)果

鹽析可以從酶解液中沉淀分離目標(biāo)蛋白質(zhì),為進(jìn)一步分離牡蠣蛋白小分子肽做準(zhǔn)備(袁夢媛,2016)。將沉淀的固體用去離子水復(fù)溶后發(fā)現(xiàn),濃度為30%—100%的硫酸銨處理后的分離效果明顯優(yōu)于低于30%硫酸銨的分離效果。將牡蠣蛋白沉淀復(fù)溶后,稀釋樣品濃度約為1.0mg/mL,DPPH自由基清除能力的測定結(jié)果如表1,硫酸銨濃度30%—100%綜合的DPPH自由基清除率達(dá)52.43%,而且DPPH自由基清除率較高,說明此時(shí)的蛋白具有高生物活性(韋獻(xiàn)雅等,2014),可進(jìn)一步對其進(jìn)行分離純化。

表1 硫酸銨分級沉淀牡蠣蛋白結(jié)果Tab.1 Ammonium sulfate fractional precipitation of oyster protein results

2.2 牡蠣兩組小分子蛋白肽的凝膠過濾層析(GFC)

實(shí)驗(yàn)通過葡聚糖凝膠SephadexG-50對兩組牡蠣小分子肽組分進(jìn)行凝膠過濾層析,如圖1中分別為組分a、組分b的洗脫曲線。由圖1可知,洗脫曲線都出現(xiàn)兩種明顯的峰,前者是鹽等雜質(zhì)被洗脫出來,后者是多肽被洗脫出來。分光光度計(jì)測量吸光值,收集兩個(gè)組分的多肽,然后冷凍干燥,即得到純化后的兩種牡蠣天然肽：組分a(Mw＜1kDa)、組分 b(1kDa＜Mw＜3kDa)。

圖1 牡蠣兩組小分子肽的洗脫曲線Fig.1 Elution curves of two groups of small molecular peptides in oyster

2.3 牡蠣兩組小分子肽的分子量分布

采用RP-HPLC來估計(jì)牡蠣酶解多肽組分a的分子量分布情況,結(jié)果如圖2,通過各標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的出峰時(shí)間繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,可知標(biāo)準(zhǔn)品的分子量對數(shù)與出峰時(shí)間呈良好的線性關(guān)系,線性相關(guān)系數(shù)為0.9958,擬合程度較好,線性回歸方程為：y=-0.1469x+6.1883。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)對照品分子量分布標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of molecular weight distribution of standard reference material

圖3和圖4分別為胰島素對照品和組分a的RP-HPLC圖譜,可知主要有4種物質(zhì)組成牡蠣小分子多肽組分a中的蛋白,這四個(gè)峰出峰時(shí)間分別為18.708、19.857、20.552、23.591min,其中出峰時(shí)間為18.708min的峰為主要峰,說明該組分中分離提純的牡蠣小分子肽純度較高,具有研究價(jià)值。結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算,組分a中的牡蠣酶解液中小分子肽分子量分布約為 1995.2、1258.9、1023.3、398.1Da。因此,可以看出分離的活性多肽分子量較小,而小分子肽在各方面存在廣泛的應(yīng)用(Gaoet al,2010；馬國興等,2015；龐秀枰等,2015),此研究為更深層次探討牡蠣多肽的組成提供研究依據(jù),為探究牡蠣小分子肽的營養(yǎng)組分做準(zhǔn)備。

2.4 牡蠣小分子肽氨基酸圖譜分析

如圖5和圖6所示,分別為18種混合氨基酸對照品圖譜和牡蠣小分子肽樣品氨基酸圖譜。經(jīng)單一對照品預(yù)實(shí)驗(yàn)可知,18種氨基酸出峰順序分別為：天門冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、絲氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、組氨酸(His)、蘇氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、脯氨酸(Pro)、酪氨酸(Tyr)、纈氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、胱氨酸(Cys)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、賴氨酸(Lys)。對應(yīng)的出峰時(shí)間分別為：3.232、3.290、10.698、12.273、15.898、16.973、17.757、18.023、18.365、24.373、25.390、26.832、28.932、29.448、29.832、32.332、33.340min。

2.5 牡蠣小分子肽氨基酸含量

圖3 胰島素對照品的HPLC圖譜Fig.3 HPLC spectrum of insulin reference substance

圖4 牡蠣小分子組分a的HPLC圖譜Fig.4 HPLC spectrum of micromolecule component a in oyster

圖5 18種混合氨基酸對照品圖譜Fig.5 Diagram of 18 mixed amino acid reference substances

氨基酸的檢測結(jié)果見表2,樣品中能夠檢測到17種氨基酸,其中胱氨酸檢測值為0。由表2可知,牡蠣小分子肽中含量最多的氨基酸是谷氨酸6.1632%,其次是賴氨酸5.2110%,說明經(jīng)酶解提取的牡蠣小分子肽中氨基酸含量豐富。檢測到8種必需氨基酸均存在,其余為9種非必需氨基酸。牡蠣小分子肽樣品中均含有豐富的賴氨酸(5.2110%)、谷氨酸(6.1632%)、甘氨酸(3.0640%)、精氨酸(1.3473%)和酪氨酸(0.9171%),這些氨基酸有助于維持蛋白質(zhì)的營養(yǎng)平衡,調(diào)節(jié)氨基酸的吸收。

牡蠣的營養(yǎng)價(jià)值與必需氨基酸的含量以及氨基酸的種類有密切的關(guān)聯(lián),由表3可知,牡蠣小分子多肽必需氨基酸(EAA)含量為18.863%,總氨基酸(TAA)含量為43.3748%,必需氨基酸占總氨基酸的43.49%,必需氨基酸與非必需氨基酸(NEAA)的比例為76.95%；風(fēng)味氨基酸(FAA)含量為18.9147%,占總氨基酸含量43.61%。由此可知,將牡蠣蛋白質(zhì)提純或酶解成小分子多肽后,營養(yǎng)成分豐富,富含多種氨基酸種類,可作為營養(yǎng)強(qiáng)化劑添加到嬰兒食品、保健食品或飼料中(劉娜等,2016；張?jiān)傻?2019),補(bǔ)充營養(yǎng)從而改善體質(zhì)。

3 結(jié)論

通過對牡蠣蛋白酶解液進(jìn)行分離純化,發(fā)現(xiàn)濃度為30%—100%的硫酸銨處理后的分離效果明顯優(yōu)于低于30%硫酸銨的分離效果,其DPPH自由基清除率達(dá)52.43%；得到純化后的兩種牡蠣天然肽：組分a(Mw＜1kDa)、組分b(1kDa＜Mw＜3kDa)。采用高效液相法分析組分a的分子量組成,結(jié)果表明主要有4種物質(zhì)組成牡蠣小分子多肽組分a中的蛋白,這四種物質(zhì)對應(yīng)峰出峰時(shí)間分別是 18.708、19.857、20.552、23.591min,其中出峰時(shí)間為18.708min的峰為主要峰,說明該組分中分離提純的牡蠣小分子肽純度較高,具有研究價(jià)值。其中小分子肽分子量分布約為 1995.2、1258.9、1023.3、398.1Da。

圖6 牡蠣小分子肽樣品氨基酸圖譜Fig.6 Graph of amino acid of oyster small-molecule peptide sample

表2 氨基酸分子量、濃度及峰面積Tab.2 Molecular weight,concentration and peak area of amino acids

表3 牡蠣小分子多肽各種類氨基酸占比情況Tab.3 Proportions of various amino acids in oyster small-molecule polypeptides

經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)牡蠣小分子多肽氨基酸種類及含量豐富,其中必需氨基酸(EAA)含量為18.863%,總氨基酸含量(TAA)為43.3748%,必需氨基酸占總氨基酸的43.49%,必需氨基酸與非必需氨基酸(NEAA)的比例為76.95%；風(fēng)味氨基酸(FAA)含量為18.9147%,占總氨基酸含量的43.61%。隨著生活水平的提高,食品越來越追求安全、營養(yǎng)和功能,牡蠣小分子肽在食品中將得到更廣泛的應(yīng)用。