大菱鲆(Scophthalmus maximus)不同發(fā)育階段視蛋白基因表達(dá)特征研究*

王雨濃 李 賢 吳樂(lè)樂(lè) 周 莉馬曉娜 李 軍

(1.中國(guó)科學(xué)院海洋研究所 中國(guó)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島 266071；2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋生物學(xué)與生物技術(shù)功能實(shí)驗(yàn)室 青島 266071；3.中國(guó)科學(xué)院海洋大科學(xué)研究中心 青島 266071；4.中國(guó)科學(xué)院大學(xué) 北京 100049)

動(dòng)物的視覺(jué)功能與其交配、覓食和躲避天敵等行為密切相關(guān)。視色素介導(dǎo)視覺(jué)形成的第一步是由G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)視蛋 白(opsin)和發(fā)色團(tuán)(chromophore)共價(jià)結(jié)合形成。當(dāng)光子被吸收后,發(fā)色團(tuán)由11-順式異構(gòu)化為全反式,從而引起視蛋白構(gòu)象的改變,進(jìn)而激活光感受器的下游轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,并最終傳遞光信號(hào)(Nathans,1987)。魚(yú)類(lèi)的視覺(jué)系統(tǒng)同大部分脊椎動(dòng)物一樣,基因組中都有五個(gè)視蛋白基因亞家族：視桿細(xì)胞中表達(dá)的視紫紅質(zhì)(RH1,Rhodopsin),以及視錐細(xì)胞中表達(dá)的四種：紅視蛋白(M/LWS,red-sensitive)、紫外視蛋白(SWS1,ultraviolet-sensitive)、藍(lán)視蛋白(SWS2,blue-sensitive)和綠視蛋白(RH2,green-sensitive)(李志強(qiáng)等,2009；劉楚吾等,2015)。

魚(yú)類(lèi)通過(guò)基因復(fù)制形成了多樣的視蛋白庫(kù),以此來(lái)適應(yīng)水體光環(huán)境變化的需要(Chinenet al,2003；Matsumotoet al,2006；Wardet al,2008；Rennisonet al,2012；Nakamuraet al,2013)。其在不同發(fā)育時(shí)期視蛋白表達(dá)種類(lèi)與組成的變化,被認(rèn)為與光譜環(huán)境的識(shí)別與適應(yīng)相關(guān),如鮭科魚(yú)類(lèi)(salmonid)視網(wǎng)膜中紫外敏感的視錐細(xì)胞在變態(tài)過(guò)程中消失,為進(jìn)入更深的水域做準(zhǔn)備,在其性成熟并返回淺水層后重新出現(xiàn)(Bowmakeret al,1987；Kunzet al,1994；Flamarique,2000；Allisonet al,2006)。虹鱒(Oncorhynchus mykiss)單錐細(xì)胞表達(dá)的視蛋白,隨著發(fā)育由SWS1轉(zhuǎn)變?yōu)镾WS2(Chengetal,2007)。此外,斑馬魚(yú)(Daniorerio)、慈鯛(Cichlids)、孔雀魚(yú)(Poeciliareticulata)等物種中也表現(xiàn)出視蛋白表達(dá)隨發(fā)育呈動(dòng)態(tài)變化的特征(Takechiet al,2005；Carletonetal,2008；Laveretal,2011；H?reretal,2017)。

大菱鲆(Scophthalmus maximus)隸屬于鰈形目(Pleuronectiformes)、鲆科(Bothidae)、菱鲆屬(Scophthalmus),生長(zhǎng)快、耐低溫,是我國(guó)重要的海水養(yǎng)殖品種之一。大菱鲆早期發(fā)育過(guò)程中,經(jīng)歷重要的變態(tài)過(guò)程,由浮游生活轉(zhuǎn)變?yōu)榈讞?生存環(huán)境尤其光照環(huán)境變化巨大。然而其視蛋白種類(lèi)及表達(dá)模式的研究卻未見(jiàn)報(bào)道。本研究以大菱鲆為對(duì)象,研究不同發(fā)育階段大菱鲆視蛋白組成、基因表達(dá)特征、光譜敏感性變化及其對(duì)光譜環(huán)境變化的響應(yīng),以期在理論上深入理解魚(yú)類(lèi)視覺(jué)發(fā)育規(guī)律、可塑性及對(duì)環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用魚(yú)

實(shí)驗(yàn)用大菱鲆取自威海圣航水產(chǎn)科技有限公司,分別為1月齡(0.15±0.09g)、4月齡(7.24±0.18g)和9月齡(40.68±0.97g)人工繁育的健康稚、幼魚(yú)。樣本采集前用300mg/LMS-222麻醉,隨后立即摘除眼睛并置于液氮中保存,用于視蛋白qPCR分析。

1.2 數(shù)據(jù)庫(kù)搜索與引物設(shè)計(jì)

大菱鲆視蛋白序列通過(guò)BLASTn和BLASTp以默認(rèn)參數(shù)搜索NCBI和Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)獲得(Altschulet al,1990),斑馬魚(yú)和牙鲆視蛋白序列用作檢索參照(Chinenet al,2003；Kasagiet al,2018)。序列相似性由ClustalW2網(wǎng)站獲得,并利用MEGA7.0中鄰接法(Neigh-borJoining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)。qPCR引物使用PrimerPre mier 5.0設(shè)計(jì),具體見(jiàn)表1。內(nèi)參基因β-actin使用引物見(jiàn)文獻(xiàn)(Danget al,2011)。

表1 qRT-PCR所用引物及相應(yīng)退火溫度和擴(kuò)增效率Tab.1 Nucleotide sequences of oligonucleotide primers

1.3 總RNA提取與cDNA第一鏈合成

實(shí)驗(yàn)用RNA提取試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司,用Nanodrop 2000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度及純度,并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA條帶完整性。隨后,利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TAKARA)合成大菱鲆cDNA第一鏈,-20°C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

以β-actin為內(nèi)參基因,每個(gè)樣品設(shè)置三個(gè)復(fù)孔?？偡磻?yīng)體系為20μL：cDNA 1.6μL,上下游引物各0.4μL,TB Green Premix Ex Taq 10μL(TaKaRa),RNase free H2O 7.6μL。熒光定量反應(yīng)條件如下：95°C 3min；95°C 10s；57/58°C 30s；72°C 30s；40個(gè)循環(huán)。引物特異性采用CFX-96軟件(Bio-Rad公司)進(jìn)行高溫熔解曲線分析和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),并以5倍梯度稀釋模板獲得引物擴(kuò)增效率。相對(duì)表達(dá)量計(jì)算采用2-ΔΔCt法,統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS19.0軟件,以“LSD”單因素方差分析法對(duì)不同發(fā)育階段大菱鲆視蛋白表達(dá)量進(jìn)行比較。當(dāng)P＜0.05時(shí),即為差異顯著。

1.5 視蛋白表達(dá)相對(duì)比例的計(jì)算

參照相關(guān)文獻(xiàn)方法(Fulleret al,2004；H?reret al,2017),對(duì)大菱鲆不同階段,視錐細(xì)胞中各視蛋白表達(dá)比例的計(jì)算采用如下公式：

2 結(jié)果與分析

2.1 大菱鲆視蛋白基因類(lèi)別

大菱鲆擁有5類(lèi)視蛋白基因,分別為視桿細(xì)胞中的視紫紅質(zhì)(RH1),視錐細(xì)胞中的紫外視蛋白(SWS1,AWO98359)、紅視蛋白(LWS,AF385826)、藍(lán)視蛋白(SWS2,AWP03347)以及綠視蛋白(RH2),其中綠視蛋白基因有五個(gè)亞型。序列相似性分析(表2)表明RH2a1和RH2a2及RH2b1和RH2b2之間的序列相似性更高。系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)分析(圖1)表明RH2a1和RH2a2及RH2b1和RH2b2分別聚為一支,故綠視蛋白基因五個(gè)亞型暫命名為RH2a1、RH2a2、RH2b1、RH2b2和RH2c。視紫紅質(zhì)和綠視蛋白相關(guān)序列已提交到NCBI,視紫紅質(zhì)序列號(hào)為MN073188,綠視蛋白五個(gè)基因分別為MN073190-MN073194。

表2 大菱鲆視蛋白基因序列相似性分析Tab.2 Sequence similarity among S.maximus opsins

圖1 大菱鲆視蛋白核酸序列鄰接法建樹(shù)Fig.1 A phylogenetic tree constructed by the Neighbor-Joining method for nucleotide sequences of S.maximus opsins

2.2 不同發(fā)育階段大菱鲆視紫紅質(zhì)基因表達(dá)量的變化

1月齡大菱鲆視紫紅質(zhì)基因RH1表達(dá)量較低,其后表達(dá)量逐漸增加,但4月齡和9月齡大菱鲆桿視蛋白表達(dá)量無(wú)顯著差異(圖2)。

圖2 大菱鲆稚、幼魚(yú)視紫紅質(zhì)基因(RH1)相對(duì)表達(dá)量隨生長(zhǎng)發(fā)育的變化Fig.2 Relative expression of RH1 during the development of juvenile S.maximus

2.3 不同發(fā)育階段大菱鲆錐視蛋白基因表達(dá)量的變化

大菱鲆錐視蛋白基因相對(duì)表達(dá)量隨發(fā)育的變化見(jiàn)圖3。其中,LWS相對(duì)表達(dá)量在1月齡最高,其后逐漸降低；SWS1和SWS2在9月齡的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于1、4月齡,且1、4月齡之間無(wú)顯著差異；綠視蛋白中RH2a1和RH2b2在4、9月齡相對(duì)表達(dá)量顯著低于1月齡；RH2a2和RH2b1在三個(gè)時(shí)期表達(dá)量均無(wú)顯著變化；RH2c在1、4月齡相對(duì)表達(dá)量無(wú)明顯變化,而9月齡時(shí)顯著降低。

圖3 大菱鲆稚、幼魚(yú)錐視蛋白基因相對(duì)表達(dá)量隨生長(zhǎng)發(fā)育的變化Fig.3 Relative expression of cone opsin genes during the development of juvenile S.maximus

2.4 大菱鲆個(gè)體發(fā)育中視蛋白表達(dá)比例的變化

大菱鲆錐視蛋白中,LWS、RH2b1和RH2c為表達(dá)比例最高的三個(gè)錐視蛋白基因,三者表達(dá)比例之和在三個(gè)階段均超過(guò)95%(圖4)。1月齡時(shí),LWS為表達(dá)比例最高的錐視蛋白,超過(guò)總量的50%。隨著大菱鲆的生長(zhǎng)發(fā)育,LWS表達(dá)比例逐漸降低,到9月齡時(shí)減少至約6%。RH2b1則剛好相反,1月齡時(shí)表達(dá)量約占29.9%,9月齡時(shí)升高至75.1%,成為表達(dá)量最高的錐視蛋白。RH2c的表達(dá)比例從1月齡至9月齡略微增加,由9.2%升高至14.8%。

在其他未占優(yōu)勢(shì)錐視蛋白基因中,SWS1和SWS2表達(dá)比例均在9月齡時(shí)顯著增加。綠視蛋白中RH2a1表達(dá)比例隨著發(fā)育逐漸降低,至9月齡時(shí)所占比例幾乎為零；RH2a2在三個(gè)時(shí)期表達(dá)比例無(wú)顯著變化,且均不超過(guò)0.2%；RH2b2在4月齡的表達(dá)比例不足0.2%,顯著低于1、9月齡(表3)。

圖4 大菱鲆三種主要視蛋白表達(dá)比例隨生長(zhǎng)發(fā)育的變化Fig.4 Proportional expression of three main opsin during the development of juvenile S.maximus

3 討論

3.1 大菱鲆綠視蛋白基因的多拷貝性

魚(yú)類(lèi)視蛋白基因的多拷貝事件報(bào)道較多,其中以綠視蛋白基因RH2最為常見(jiàn)(劉楚吾等,2015)。如斑馬魚(yú)(Danio rerio)的RH2基因通過(guò)復(fù)制形成了光譜敏感峰值(λmax)各不相同的四個(gè)基因,串聯(lián)排列在基因組上(Chinenet al,2003)。而紅鰭東方鲀(Takifugu rubripes)和黑青斑河豚(Tetraodon nigroviridis)的RH2也發(fā)生了加倍,但它們的RH2-2趨同退化為假基因(Neafseyet al,2005)。在已有報(bào)道中,太平洋藍(lán)鰭金槍魚(yú)(Thunnus orientalis)RH2基因最多,其至少有5個(gè)旁系同源基因。相關(guān)氨基酸位點(diǎn)替換導(dǎo)致光譜敏感藍(lán)移,形成不同λmax的綠視蛋白亞型,進(jìn)而增強(qiáng)了太平洋藍(lán)鰭金槍魚(yú)對(duì)藍(lán)光的識(shí)別能力(Nakamuraet al,2013)。在大菱鲆視蛋白基因中,我們發(fā)現(xiàn)其有五個(gè)RH2基因,推測(cè)RH2基因的堿基替換引起λmax的改變,可能是變態(tài)后大菱鲆對(duì)深海短光譜為主的光照環(huán)境的一種適應(yīng)表現(xiàn)。

表3 大菱鲆錐視蛋白各基因表達(dá)比例(%)Tab.3 Proportional expression of different cone opsin during the development of juvenile S.maximus

3.2 大菱鲆發(fā)育過(guò)程中視蛋白基因表達(dá)特征變化

視蛋白基因在魚(yú)體發(fā)育不同階段表達(dá)的不一致性,是其適應(yīng)不同發(fā)育階段下各異光譜環(huán)境的強(qiáng)大機(jī)制之一(Chenget al,2004；Carletonet al,2008)。大菱鲆在仔稚魚(yú)期營(yíng)浮游生活,變態(tài)后則轉(zhuǎn)營(yíng)底棲生活。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,大菱鲆雖然經(jīng)歷長(zhǎng)時(shí)間的養(yǎng)殖馴化,但其可能仍保留了野生狀態(tài)的視蛋白表達(dá)模式：從1月齡至9月齡,大菱鲆桿視蛋白基因表達(dá)量增加；大菱鲆在進(jìn)入更深的水層后,棲息環(huán)境光線逐漸變暗,需要更多的視紫紅質(zhì)。

在錐視蛋白中,LWS表達(dá)量逐漸降低,SWS1和SWS2表達(dá)量逐漸升高,綠視蛋白中占主導(dǎo)的RH2b1表達(dá)量無(wú)顯著變化。大菱鲆變態(tài)前生存在表層水域,光線以長(zhǎng)波長(zhǎng)為主,變態(tài)后向更深的水層移動(dòng),光譜以中短波長(zhǎng)為主。我們的結(jié)果表明大菱鲆變態(tài)前后顏色識(shí)別能力的轉(zhuǎn)變,正好與大菱鲆生活史(從浮游向底棲生活轉(zhuǎn)變)的視覺(jué)需求相吻合。條斑星鰈(Verasper moseri)有著與大菱鲆類(lèi)似的生活史和光譜環(huán)境轉(zhuǎn)變,其在3—27月齡的發(fā)育過(guò)程中LWS表達(dá)逐漸降低,RH1表達(dá)升高,但SWS1和SWS2b表達(dá)量下降(Kasagiet al,2015)。南地刺鯛(Acanthopagrus butcheri)在仔魚(yú)期視蛋白表達(dá)以SWS1、SWS2b和RH2aα為主,而SWS2a、RH2aβ和LWS表達(dá)水平很低；然而在成魚(yú)中,視蛋白表達(dá)情況剛好相反,并且從仔魚(yú)到成蟲(chóng),RH1的相對(duì)表達(dá)水平上升了25倍(Shandet al,2008),這種變化可能與其稚魚(yú)期到以長(zhǎng)波長(zhǎng)為主的單寧酸污染河口水域生活有關(guān)(Shandet al,2002)?？梢?jiàn),魚(yú)類(lèi)視蛋白表達(dá)的階段特征與發(fā)育中環(huán)境光譜變化密切相關(guān)。

3.3 大菱鲆發(fā)育過(guò)程中的光譜敏感性變化

發(fā)育過(guò)程中視蛋白基因表達(dá)比例的變化,可以在一定程度上推測(cè)魚(yú)類(lèi)在不同發(fā)育階段的光譜敏感性。各錐視蛋白表達(dá)比例的計(jì)算結(jié)果表明,大菱鲆錐視蛋白在1月齡時(shí)LWS占主導(dǎo),隨著發(fā)育,RH2b1逐漸取代了LWS高表達(dá)的地位。據(jù)此可推測(cè)：大菱鲆在變態(tài)前的1月齡可能對(duì)長(zhǎng)波長(zhǎng)的紅光更為敏感,而變態(tài)后可能對(duì)中短波長(zhǎng)的綠光更敏感,與其生活史中光譜環(huán)境變化吻合。美洲擬鰈(Pleuronectes Americanus)擁有與大菱鲆類(lèi)似的生活史,但其變態(tài)前只有RH2表達(dá),意味著仔魚(yú)期的綠光高敏感性；變態(tài)后SWS2和LWS兩類(lèi)錐視蛋白基因亦有表達(dá),其光譜敏感性可能有所轉(zhuǎn)變(Maderet al,2004)。

本實(shí)驗(yàn)中,9月齡大菱鲆SWS1表達(dá)比例顯著高于1、4月齡。然而大部分研究表明紫外敏感性的增強(qiáng)可能是不利的(Loseyet al,1999)。如羅非魚(yú)(Oreochromis niloticus)的紫外敏感性隨著發(fā)育逐漸降低,其仔魚(yú)期對(duì)紫外的高敏感性與攝食習(xí)性有關(guān)。浮游動(dòng)物會(huì)吸收紫外線,仔魚(yú)的紫外視覺(jué)能夠增強(qiáng)浮游動(dòng)物與海水背景顏色的對(duì)比,從而有助于其對(duì)浮游生物的捕捉(Sabbahet al,2012)；羅非魚(yú)成魚(yú)為雜食性,由于紫外線在水中的強(qiáng)烈散射造成視網(wǎng)膜圖像形成的模糊化,不利于其對(duì)大型水生植物及無(wú)脊椎動(dòng)物的捕食。但大菱鲆9月齡SWS1所占比例依然很低,可能對(duì)光譜敏感性影響微乎其微。SWS2的表達(dá)比例變化亦不大,表明大菱鲆對(duì)藍(lán)光敏感程度可能亦無(wú)顯著變化。

4 結(jié)論

大菱鲆視蛋白基因在不同發(fā)育階段表達(dá)特征不同。1月齡LWS表達(dá)比例為57.2%,9月齡時(shí)降至11.4%；綠視蛋白從 1月齡 29.9%升高至 9月齡73.3%。表達(dá)占據(jù)主導(dǎo)地位的LWS逐漸被RH2b1取代,進(jìn)而可能引起視覺(jué)敏感性由長(zhǎng)波長(zhǎng)轉(zhuǎn)變?yōu)橹卸滩ㄩL(zhǎng)敏感。不同階段視蛋白表達(dá)特征變化引發(fā)的光譜敏感性轉(zhuǎn)變,可能是大菱鲆應(yīng)對(duì)底棲光環(huán)境變化的一種適應(yīng)策略。