補(bǔ)腎陽(yáng)中藥治療促性腺激素缺乏型男性不育的網(wǎng)絡(luò)分子機(jī)制初探

孟雪丹 張文婷 趙崇軍 王昭懿 馮丹 趙霞 顧念念 吳怡青 鄒迪新 林瑞超

中醫(yī)認(rèn)為，腎為先天之本，主生殖，腎陽(yáng)是腎氣的基礎(chǔ)，認(rèn)為是男性生育的“源頭”，即腎陽(yáng)是精子發(fā)生的根本，直接決定男性生育力。中醫(yī)臨床辨證治療男性不育十分重視運(yùn)用補(bǔ)腎陽(yáng)中藥，認(rèn)為腎陽(yáng)之虛得補(bǔ)，從而消除或改善男性不育。

中西醫(yī)結(jié)合臨床研究發(fā)現(xiàn)，多種補(bǔ)腎陽(yáng)中藥對(duì)促性腺激素缺乏型男性不育具有較好的療效[1]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎陽(yáng)中藥治療促性腺激素缺乏型男性不育的藥效機(jī)理在于補(bǔ)腎陽(yáng)中藥具有促性腺激素樣作用。例如，肉蓯蓉具有補(bǔ)腎壯陽(yáng)、強(qiáng)肝腎益精氣等作用，其苯乙醇苷類(lèi)成分可增強(qiáng)下丘腦-垂體-腎上功能，促進(jìn)體內(nèi)相關(guān)遞質(zhì)和激素的釋放[2]；淫羊藿中的淫羊藿苷有性激素分泌促進(jìn)作用并可產(chǎn)生性激素樣作用，通過(guò)抑制性腺細(xì)胞衰老基因的表達(dá)，延遲性腺衰老[3]；鎖陽(yáng)中含有性激素樣成分及中間體，可直接與受體結(jié)合作用，亦可作為合成性激素的原料，還可促進(jìn)體內(nèi)原有性激素發(fā)揮作用[4]；杜仲具有促進(jìn)雄性激素合成或釋放的作用，該作用機(jī)制與其陰莖神經(jīng)傳導(dǎo)通路的良好保護(hù)作用有關(guān)[5]；補(bǔ)骨脂所含的補(bǔ)骨脂素可能參與誘導(dǎo)大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞向雄性生殖細(xì)胞方向的分化[6]；鹿茸中含有雄性激素、雌激素和孕激素等甾體化合物，鹿茸的激素樣作用與其所含甾類(lèi)衍生物密切相關(guān)[7]；海馬中化學(xué)成分種類(lèi)繁多，包括氨基酸、甾體類(lèi)、脂肪酸、微量元素和磷脂等，這些有效成分是海馬發(fā)揮藥理作用的基礎(chǔ)，海馬在補(bǔ)腎壯陽(yáng)方面具有很高的價(jià)值，可通過(guò)提高機(jī)體的性激素水平，改善和提高性功能[8]。

促性腺激素缺乏型男性不育的發(fā)病機(jī)制[9]復(fù)雜，涉及大腦皮質(zhì)-下丘腦、嗅腦-下丘腦、下丘腦-垂體-睪丸等結(jié)構(gòu)的綜合調(diào)控。現(xiàn)有的治療策略，實(shí)質(zhì)上是一種類(lèi)似于“補(bǔ)充式”的辦法，往往不能從根本上治療。因此，如何在根本上綜合調(diào)控促性腺激素，是有待解決的重要科學(xué)問(wèn)題。著眼于整體發(fā)揮綜合調(diào)控作用的中藥被認(rèn)為是治療的新希望[10]。然而，由于中藥具有化學(xué)成分復(fù)雜，多成分-多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)，目前補(bǔ)腎陽(yáng)中藥促性腺激素樣作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確，其藥理分子網(wǎng)絡(luò)機(jī)制等關(guān)系未見(jiàn)國(guó)內(nèi)報(bào)道。生物信息學(xué)基于分子間相互作用，可以將復(fù)雜的成分和目標(biāo)蛋白或基因進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，在多組學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)間加以聯(lián)系，幫助研究人員更好了解多成分藥物的機(jī)制，適用于多成分多靶點(diǎn)特征的中藥研究。本研究從探討分子機(jī)制角度出發(fā)，通過(guò)檢索相關(guān)權(quán)威數(shù)據(jù)庫(kù)并使用通路分析軟件(ingenuity pathway analysis，IPA)構(gòu)建補(bǔ)腎陽(yáng)成分中受美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration ，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)的藥物的促性腺激素樣作用靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，從整體上分析補(bǔ)腎陽(yáng)中藥可能發(fā)揮促性腺激素樣作用的成分、作用靶點(diǎn)以及信號(hào)通路，初步探討補(bǔ)腎陽(yáng)中藥改善促性腺激素缺乏男性不育的系統(tǒng)藥理學(xué)機(jī)制，為補(bǔ)腎陽(yáng)中藥治療促性腺激素缺乏型男性不育奠定理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，具有一定的科學(xué)意義。

1 資料和方法

1.1 數(shù)據(jù)準(zhǔn)備

1.1.1 建立常見(jiàn)補(bǔ)陽(yáng)中藥已知化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù) 于中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所化學(xué)專(zhuān)業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)( http：//www.organchem.csdb.cn)中藥與化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)-中藥材檢索模塊中，分別檢索淫羊藿、鎖陽(yáng)、肉蓯蓉、杜仲、補(bǔ)骨脂、鹿茸、海馬7味中藥，整理出每味藥中的已知化學(xué)成分列表，包含化合物名稱(chēng)、分子式、CAS號(hào)等信息。

1.1.2 收集已知治療促性腺激素缺乏藥物的靶點(diǎn) 可治療促性腺激素缺乏(gonadotropin deficiency)的藥物靶點(diǎn)來(lái)自人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，http：//www.omim.org/)、DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.drugbank.ca/)。在DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索時(shí)，僅選取受FDA批準(zhǔn)的藥物所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，并于UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.uniprot.org/)中檢索各靶點(diǎn)，完善其基因名稱(chēng)、ID等信息。

1.2 分析條件

將補(bǔ)陽(yáng)中藥單體成分分為植物成分和動(dòng)物成分兩組，分別與促性腺激素缺乏的已知藥物治療靶點(diǎn)于IPA中進(jìn)行“Path Explorer”分析，其中作用方式選擇“直接”和“間接”，對(duì)靶標(biāo)的調(diào)節(jié)選擇“上調(diào)”和“下調(diào)”。整理出作用關(guān)系后，使用IPA中的“molecule activity predictor”功能，預(yù)測(cè)有效成分單體對(duì)靶標(biāo)表達(dá)的調(diào)整作用。最后使用IPA中的“core analysis”功能，對(duì)靶標(biāo)進(jìn)行通路富集等相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)整理

對(duì)收集到的治療促性腺激素缺乏的藥物治療靶點(diǎn)進(jìn)行去除重復(fù)處理，得到已知治療靶標(biāo)可在IPA中被識(shí)別的有561個(gè)；各常見(jiàn)補(bǔ)陽(yáng)中藥單體成分?jǐn)?shù)量分別為：淫羊藿(57)、杜仲(65)、肉蓯蓉(22)、鎖陽(yáng)(12)、補(bǔ)骨脂(25)、鹿茸(47)、海馬(14)，其中IPA可識(shí)別的各常見(jiàn)補(bǔ)陽(yáng)中藥單體數(shù)量分別為：淫羊藿(10)、鎖陽(yáng)(6)、肉蓯蓉(9)、杜仲(16)、補(bǔ)骨脂(11)、鹿茸(37)、海馬(9)。

2.2 基于IPA的補(bǔ)陽(yáng)中藥與疾病靶標(biāo)的作用關(guān)系

通過(guò)IPA中“Path explorer”和“molecule activity predictor”功能，將上述靶標(biāo)和成分分別導(dǎo)入IPA分析模塊，匹配出植物藥、動(dòng)物藥對(duì)已知藥物治療靶點(diǎn)進(jìn)行直接和間接調(diào)節(jié)的中藥單體成分，植物藥中，可作用于靶標(biāo)分子的單體成分為14個(gè)，單體及其在實(shí)驗(yàn)選取的補(bǔ)腎陽(yáng)中藥中的分布見(jiàn)表1，共可調(diào)節(jié)31個(gè)靶標(biāo)；動(dòng)物藥中，可作用于靶標(biāo)分子的單體成分為16個(gè)，單體及其分布見(jiàn)表2，共可調(diào)節(jié)43個(gè)靶標(biāo)。它們的作用關(guān)系如圖1、圖2所示，其中橙色為上調(diào)，藍(lán)色為下調(diào)，直線代表直接作用，虛線代表間接作用，筆者在IPA提供的相互作用關(guān)系基礎(chǔ)上添加細(xì)胞結(jié)構(gòu)示意圖，并將各個(gè)靶標(biāo)定位在其對(duì)應(yīng)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)中，使其層次更加明確。各靶標(biāo)對(duì)應(yīng)的蛋白或分子均按照其在細(xì)胞中的分布區(qū)域標(biāo)注于圖上。

表1 植物類(lèi)藥所含單體成分中英文名稱(chēng)及其歸屬

表2 動(dòng)物類(lèi)藥所含單體成分中英文名稱(chēng)及其歸屬

注：黃色：?jiǎn)误w名稱(chēng)；白色：靶標(biāo)名稱(chēng)

圖1植物藥中單體成分-疾病靶標(biāo)作用關(guān)系

注：黃色：?jiǎn)误w名稱(chēng)；白色：靶標(biāo)名稱(chēng)

圖2動(dòng)物藥藥中單體成分-疾病靶標(biāo)作用關(guān)系

2.3 基于IPA的靶點(diǎn)核心分析

通過(guò)IPA中“core analysis”功能，對(duì)植物藥和動(dòng)物藥可調(diào)節(jié)的靶標(biāo)分別進(jìn)行通路富集及分析，選取-Logp值及ratio值(代表該通路中可與數(shù)據(jù)匹配上的靶點(diǎn)個(gè)數(shù)與通路靶點(diǎn)及分子總個(gè)數(shù)的比值)作為指標(biāo)，左側(cè)y軸為-Logp值，右側(cè)y軸為ratio值，按照-Logp值從大到小的順序排序從IPA中導(dǎo)出前十名通路的柱形圖，見(jiàn)圖3、圖4。植物藥和動(dòng)物藥2組通路中相關(guān)性最高的分別為芳基烴受體信號(hào)通路和孕烷X受體/類(lèi)視黃醇X受體激活途徑，相關(guān)性降序前十名中共有通路為血小板反應(yīng)蛋白1(TSP1)抑制血管生成途徑和缺氧誘導(dǎo)因子1-α(HIF1α)信號(hào)途徑。

圖3 植物藥靶標(biāo)經(jīng)IPA富集的通路(1～10)

圖4 動(dòng)物藥靶標(biāo)經(jīng)IPA富集的通路(1～10)

分別統(tǒng)計(jì)植物藥和動(dòng)物藥富集到的前十名通路中可匹配到的靶標(biāo)蛋白的名稱(chēng)和出現(xiàn)頻數(shù)，將出現(xiàn)次數(shù)為2及以上的靶標(biāo)及可受2種及以上中藥單體成分調(diào)節(jié)的靶標(biāo)進(jìn)行整理，如表3、表4所示，表中提供了各靶標(biāo)蛋白于前十名通路中的出現(xiàn)頻數(shù)，以及各補(bǔ)陽(yáng)藥材中對(duì)應(yīng)中藥單體的存在情況。

表3 植物藥單體成分調(diào)控的核心靶標(biāo)及其歸屬

表4 動(dòng)物藥單體成分調(diào)控的核心靶標(biāo)及其歸屬

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為腎為臟腑之本，十二經(jīng)之根，對(duì)各臟腑有推動(dòng)和溫煦作用，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的男性生育力高度關(guān)聯(lián)。腎陽(yáng)衰微，命火不足，內(nèi)生陰寒等原因造成腎陽(yáng)虛證，是促性腺激素缺乏型男性不育的主要病機(jī)[11]。促性腺激素(gonadotropin，Gn)是一類(lèi)糖蛋白激素，男性促性腺激素包括卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)、促黃體激素(luteinizing hormone，LH)，其合成和分泌涉及大腦皮質(zhì)-下丘腦、嗅腦-下丘腦、下丘腦-垂體-睪丸等結(jié)構(gòu)的綜合調(diào)控，任何一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)紊亂，都可能引起促性腺激素失調(diào)和性腺機(jī)能障礙，導(dǎo)致促性腺激素缺乏型男性不育。由于其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，單純外源性補(bǔ)充某種男性促性腺激素很少能夠獲得滿意的療效，因此仍是男科臨床上面臨的難點(diǎn)[12]。越來(lái)越多的臨床和實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，補(bǔ)腎陽(yáng)藥具有促性腺激素樣作用，且補(bǔ)腎陽(yáng)中藥對(duì)促性腺激素的多成分-多靶點(diǎn)的綜合調(diào)節(jié)作用，使得補(bǔ)腎陽(yáng)藥逐漸引起科研和中西醫(yī)臨床的關(guān)注[11]。生命是由各種分子互相作用共同構(gòu)成的一個(gè)復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)體系，而疾病的出現(xiàn)往往伴隨著多分子水平的變化，涉及到多種具有關(guān)聯(lián)性的病理過(guò)程[13]。生物信息學(xué)可基于已知的分子、蛋白、化合物等之間的互作機(jī)制，對(duì)目標(biāo)成分與分子進(jìn)行檢索和關(guān)聯(lián)性分析，這種整合的分析方法與探索中藥機(jī)制與藥理作用的目標(biāo)相符。

本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法對(duì)補(bǔ)腎陽(yáng)中藥改善促性腺激素缺乏作用的分子機(jī)制進(jìn)行了初步探討，結(jié)果發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎陽(yáng)中藥化學(xué)庫(kù)中的30個(gè)化學(xué)成分可對(duì)FDA批準(zhǔn)用于治療促性腺激素缺乏男性不育的藥物靶標(biāo)庫(kù)的60個(gè)核心靶點(diǎn)直接激活或抑制，參與HIF1α信號(hào)途徑、TSP1抑制血管生成途徑、芳基烴受體信號(hào)途徑，孕烷X受體/類(lèi)視黃醇X受體激活等18條通路的直接調(diào)控。在此基礎(chǔ)上，以藥物成分在單味中藥的分布為分析對(duì)象，發(fā)現(xiàn)在植物類(lèi)補(bǔ)腎陽(yáng)藥中分布頻率較高的化學(xué)成分是槲皮素、山奈酚、熊果酸、亞油酸、咖啡酸、綠原酸和琥珀酸；動(dòng)物類(lèi)是β-雌二醇、前列腺素E2、煙酸、精胺、L-精氨酸和膽固醇。以藥物靶標(biāo)為分析對(duì)象，發(fā)現(xiàn)植物類(lèi)與動(dòng)物類(lèi)補(bǔ)腎陽(yáng)藥在治療促性腺激素缺乏型男性不育過(guò)程中直接作用次數(shù)較多的靶標(biāo)是腫瘤蛋白p53(tumor protein p53，TP53)，基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metallopeptidase 9，MMP9)，雌激素受體1(estrogen Receptor 1，ESR1)、核受體亞家族1第一組成員2(nuclear receptor subfamily 1 group I member 2，NR1I2)。以藥物通路為分析對(duì)象，發(fā)現(xiàn)植物類(lèi)與動(dòng)物類(lèi)補(bǔ)腎陽(yáng)藥在治療促性腺激素缺乏型男性不育過(guò)程中均調(diào)控的信號(hào)通路有4條，分別是HIF1α信號(hào)途徑、TSP1抑制血管生成途徑、芳基烴受體信號(hào)途徑和孕烷X受體/類(lèi)視黃醇X受體激活途徑。另外，為了保證研究結(jié)果的可靠和準(zhǔn)確，本研究只關(guān)注了與藥物成分有直接關(guān)系的靶標(biāo)，即實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)源于SCI發(fā)表的研究性論文(影響因子大于3分)，因此，本部分研究對(duì)這些藥物成分、靶標(biāo)及通路予以了更多關(guān)注。

腫瘤蛋白p53基因和MMP-9均為垂體腺瘤相關(guān)的常見(jiàn)抑癌基因。TP53是一種腫瘤抑制基因，表達(dá)的p53蛋白可保持基因組的穩(wěn)定性，避免突變發(fā)生。垂體腺瘤是位于腦垂體的良性腫瘤，發(fā)生率較高，以中年人居多，解剖發(fā)現(xiàn)率約為20%～30%[14]。但有部分腫瘤有侵襲性生長(zhǎng)的特性，可能對(duì)垂體組織產(chǎn)生壓迫，導(dǎo)致垂體促激素的減少，其主要的臨床表現(xiàn)為性腺功能低下。垂體腺瘤中p53的陽(yáng)性率與腫瘤的惡性程度成正比關(guān)系，嚴(yán)重情況如垂體癌中，p53陽(yáng)性率可達(dá)100%[15]。p53分為野生型和突變型，二者作用各不相同：野生型p53可抑制腫瘤發(fā)生，平時(shí)表達(dá)水平較低；突變后的p53則可通過(guò)刺激細(xì)胞生長(zhǎng)的方式促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。淫羊藿、鎖陽(yáng)、杜仲、補(bǔ)骨脂中含有的槲皮素、熊果酸、咖啡酸、亞油酸，鹿茸中的前列腺素E2，這些中藥單體成分對(duì)p53既有上調(diào)作用也有下調(diào)作用，與文獻(xiàn)依據(jù)相符[16]。MMP-9屬于Ⅳ型膠原酶，是鋅依賴(lài)性內(nèi)肽酶家族的一員，可介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)的降解和血管生成[17]，在垂體腺瘤的侵襲性生長(zhǎng)中起重要促進(jìn)作用[16]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，淫羊藿中的槲皮素，鎖陽(yáng)、杜仲中的熊果酸，鹿茸中的前列腺素E2等成分對(duì)MMP-9有抑制作用，與現(xiàn)已知的機(jī)制相符。

雌激素受體α(estrogen receptorαlpha，ERα)由雌激素受體1基因(ESR1)編碼，主要分布在細(xì)胞核內(nèi)，在不同器官和生理發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮作用，如生殖系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等，在男性中的生殖器官、下丘腦、垂體等中均有表達(dá)[18]。ERα水平的降低造成機(jī)體對(duì)雌激素不敏感，同時(shí)伴有促性腺激素分泌異常，男性患者會(huì)伴有精子活力差，且外源性激素治療對(duì)其效果不佳[19]。淫羊藿中的槲皮素、杜仲中的山奈酚，可上調(diào)ESR1的表達(dá)，猜測(cè)可能通過(guò)增加ERα的表達(dá)，提高機(jī)體對(duì)雌激素敏感性，進(jìn)而調(diào)整促性腺激素分泌。TP53和ESR1共同參與芳基烴受體信號(hào)途徑，在沒(méi)有雌激素或雌激素水平過(guò)低的情況下，配體與該受體結(jié)合，形成芳基烴受體復(fù)合物可與雌激素受體結(jié)合，激活對(duì)雌激素效應(yīng)元件有依賴(lài)性的一系列基因的轉(zhuǎn)錄。

孕烷X受體是由NR1I2編碼的轉(zhuǎn)錄因子，屬于核受體。通過(guò)與配體結(jié)合參與藥物代謝相關(guān)酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)。孕烷X受體于肝和小腸中表達(dá)活躍，部分中草藥活性成分經(jīng)腸道及其他靶器官攝取后作為配體可激活孕烷X受體，從而影響藥物的代謝和作用[20]。鹿茸中的β-雌二醇可上調(diào)NR1I2的表達(dá)。在孕烷X受體/類(lèi)視黃醇X受體激活途徑中，激活的孕烷X受體與類(lèi)視黃醇X受體可共同誘導(dǎo)細(xì)胞色素P450 3A4酶(Cytochrome P450 3A4，CYP3A4)的表達(dá)，CYP3A4負(fù)責(zé)近過(guò)半數(shù)常用藥物的I期代謝，推測(cè)其可通過(guò)該途徑，在一定程度上提升機(jī)體對(duì)其他可吸收有效成分的利用。

本研究結(jié)合生物信息學(xué)方法成功構(gòu)建了補(bǔ)腎陽(yáng)中藥治療促性腺激素缺乏型男性不育的“成分-靶標(biāo)”分子網(wǎng)絡(luò)，為補(bǔ)腎陽(yáng)中藥抗促性腺激素缺乏型男性不育的治療奠定理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，具有一定的科學(xué)意義。