山蒼子果渣對湖羊體外瘤胃發(fā)酵特性的影響

羅 陽，李昊幫，何 芳，浣 成，李劍波，易康樂，孫 鏖

(湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，湖南 長沙 410131)

山蒼子(Litseacubeba)別名木姜子、山胡椒，為樟科(Lauraceae)木姜子屬(Litsea)多年生落葉灌木或喬木，在我國長江流域以南有廣泛分布，因地域差異而有種群區(qū)別，僅在主產(chǎn)區(qū)湖南省就發(fā)現(xiàn)了18個(gè)種及5個(gè)變種[1-2]。其果實(shí)與葉片富含單萜烯類化合物(主成分α-檸檬醛及β-檸檬醛、檸檬烯、芳樟醇等)[3-4]，可用于制備多種食品添加劑，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

將棉籽、大豆、菜籽等農(nóng)產(chǎn)品加工副產(chǎn)物作為飼料資源開發(fā)一直是我國飼料工業(yè)緩解飼草短缺與工業(yè)廢棄物污染的有效途徑。近年來，我國每年山蒼子精油產(chǎn)量4 000余t，因提取精油而產(chǎn)生的果渣餅粕達(dá)20余萬t，成為亟待研究開發(fā)的飼料資源[5]。山蒼子因其揮發(fā)油具有抗菌活性、抗氧化性能以及消炎作用被廣泛用于食品、醫(yī)藥、化工等行業(yè)[6-9]，而飼料中添加抗氧化劑對緩解動物機(jī)體氧化應(yīng)激，增強(qiáng)動物的抗應(yīng)激能力具有重要作用[10-11]，且其抗菌活性能有效防止飼料霉變、促進(jìn)動物機(jī)體健康。有研究者認(rèn)為，植物精油極有可能成為未來動物生產(chǎn)中抗生素的替代品[12]。對反芻動物而言，植物精油因具備生物活性功能對瘤胃發(fā)酵具有積極的調(diào)控作用[13]?？梢姡缴n子果渣作為精油提取的加工副產(chǎn)品在飼料領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。為了探究山蒼子果渣資源的飼用價(jià)值，將山蒼子果渣與羊草進(jìn)行體外產(chǎn)氣試驗(yàn)，初步評定其在反芻動物飼料中的利用價(jià)值，對反芻動物新型飼料資源開發(fā)和山蒼子新功能的利用與推廣具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 樣品制備與常規(guī)營養(yǎng)成分測定

供試山蒼子由中南林業(yè)科技大學(xué)林學(xué)院提供，羊草由湖南省奶牛原種場提供。羊草65 ℃烘干，粉碎后過425 μm孔徑標(biāo)準(zhǔn)篩，在4 ℃冷庫中保存。山蒼子研磨后65 ℃烘干除去植物揮發(fā)油，研磨后的果渣經(jīng)粉碎后過425 μm孔徑標(biāo)準(zhǔn)篩，在4 ℃冷庫中保存。飼料樣品干物質(zhì)(DM)含量參照文獻(xiàn)[14]方法測定，粗灰分(Ash)含量參照文獻(xiàn)[15]方法測定，粗脂肪(EE)含量參照文獻(xiàn)[16]方法測定，粗蛋白(CP)含量參照文獻(xiàn)[17]方法測定，中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)的含量采用Van Soest氏法測定[18]。

1.2 人工瘤胃液配制

瘤胃體外產(chǎn)氣試驗(yàn)參照MENKE等[19]的方法，于晨飼前采集3頭健康狀況良好且裝有永久性瘤胃瘺管成年湖羊的瘤胃液，混合后經(jīng)4層紗布過濾，與9倍體積的人工唾液混合[20]，得到人工瘤胃液。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用壓力讀取式體外產(chǎn)氣技術(shù)(RPT)分別對山蒼子果渣和羊草的發(fā)酵特性進(jìn)行研究[21]，每組5個(gè)重復(fù)，空白對照組不加底物用于校正。稱取0.5 g(干物質(zhì)基礎(chǔ))山蒼子果渣與羊草樣品，分別置于120 mL產(chǎn)氣瓶中，在厭氧培養(yǎng)箱(型號M2000，美國Coylab公司)中除去氧氣，隨后轉(zhuǎn)移到厭氧培養(yǎng)箱 (氧氣含量低于10 mg/kg，氫氣分壓為7.2%)，然后往產(chǎn)氣瓶中注入50 mL的人工瘤胃液，取出置于39 ℃的隔水式恒溫培養(yǎng)箱連續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.4 測定指標(biāo)及方法

1.4.1 體外產(chǎn)氣量測定 利用壓力傳感器及配套軟件分別讀取發(fā)酵2、4、6、9、12、24、36、48 h產(chǎn)氣瓶內(nèi)的壓力值，根據(jù)各時(shí)間點(diǎn)底物的產(chǎn)氣壓力按以下公式轉(zhuǎn)換成產(chǎn)氣體積(空白對照用于校正產(chǎn)氣量)：

GPt=Pt×(V0-50)/(101.3×W)

式中，GPt為底物在t時(shí)間段內(nèi)的產(chǎn)氣量(mL)，Pt為t時(shí)間段讀取的壓力值(kPa)，V0為產(chǎn)氣瓶體積(mL)，101.3為標(biāo)準(zhǔn)大氣壓(kPa)，W為底物干物質(zhì)質(zhì)量(kg)，產(chǎn)氣過程中的累計(jì)產(chǎn)氣量為各時(shí)間段的產(chǎn)氣量之和。

1.4.2 揮發(fā)性脂肪酸(VFA)及pH 值的測定 參照MAURICIO等[21]的方法利用氣相色譜儀測定。48 h終止培養(yǎng)后，取1 mL發(fā)酵培養(yǎng)液，加入50 μL 85%的正磷酸，4 ℃條件下20 000×g離心10 min，取上清液置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?，用氣相色譜儀測定發(fā)酵液中乙酸、丙酸、丁酸等揮發(fā)性脂肪酸的含量。利用便攜式pH計(jì)(型號PB-10，德國Sartorius公司) 測定發(fā)酵液的pH值。

1.4.3 氨態(tài)氮(NH3-N)質(zhì)量濃度及甲烷含量測定 利用比色法測定氨態(tài)氮的質(zhì)量濃度。取5 mL體外發(fā)酵培養(yǎng)液，3 500 r/min離心10 min，取上清，以氯化銨為標(biāo)準(zhǔn)品，用可見分光光度計(jì)(型號721型，上海光學(xué)儀器廠)測定700 nm波長條件下上清液中氨態(tài)氮的質(zhì)量濃度。采用氣相色譜法測定甲烷含量。用大劑量氣體進(jìn)樣器吸取1.2 mL氣體樣品，用氣象色譜儀(型號Shimadzu GC-9A，日本島津公司)分析氣體中甲烷的含量。

1.5 數(shù)據(jù)分析

原始數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 初步處理后，用SPSS 19.0 進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 山蒼子果渣與羊草常規(guī)營養(yǎng)成分分析

由表1可知，山蒼子果渣的干物質(zhì)、粗脂肪、粗蛋白以及中性洗滌纖維含量均高于羊草，差異極顯著(P<0.01)；酸性洗滌纖維含量低于羊草，差異極顯著(P<0.01)。山蒼子果渣鈣含量低于羊草，但差異不顯著(P>0.05)；磷含量低于羊草，差異顯著(P<0.05)。

表1 山蒼子果渣與羊草常規(guī)營養(yǎng)成分(干物質(zhì)基礎(chǔ))Tab.1 Nutrients of Litsea cubeba residue and Leymus chinensis (DM basis) %

注：同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

Note：In the same row,values with different capital letter superscripts mean extremely significant difference(P<0.01),and with different small letter superscripts mean significant difference(P<0.05),the same below.

2.2 山蒼子果渣和羊草的產(chǎn)氣分析

從表2可以看出，山蒼子果渣在整個(gè)試驗(yàn)階段產(chǎn)氣量均極顯著(P<0.01)低于羊草，且山蒼子果渣在發(fā)酵前9 h內(nèi)產(chǎn)氣量為負(fù)值，6 h后產(chǎn)氣速率雖有所上升，但在36 h后基本停止產(chǎn)氣。而羊草在前12 h內(nèi)產(chǎn)氣速率穩(wěn)定，但速率較低，24 h時(shí)速率達(dá)到峰值，24～48 h產(chǎn)氣速率逐漸下降。

2.3 山蒼子果渣和羊草發(fā)酵參數(shù)

由表3可知，整個(gè)試驗(yàn)中山蒼子果渣甲烷產(chǎn)量為0，顯著低于羊草組(P<0.01)。體外產(chǎn)氣發(fā)酵48 h后，山蒼子果渣和羊草體外發(fā)酵培養(yǎng)液pH值分別為6.67、6.54，差異極顯著(P<0.01)；氨態(tài)氮質(zhì)量濃度分別為0.66 mg/mL、0.71 mg/mL，無顯著性差異(P>0.05)。山蒼子果渣培養(yǎng)液中總揮發(fā)性脂肪酸、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、異戊酸濃度均極顯著(P<0.01)低于羊草，戊酸濃度顯著(P<0.05)低于羊草，但乙酸/丙酸與羊草差異不顯著(P>0.05)。

表2 不同發(fā)酵時(shí)間段山蒼子果渣與羊草累計(jì)產(chǎn)氣量

表3 山蒼子果渣和羊草單獨(dú)作為底物時(shí)的發(fā)酵參數(shù)Tab.3 Fermentation parameters of Litsea cubeba residue and Leymus chinensis as substrate alone

3 結(jié)論與討論

3.1 山蒼子果渣營養(yǎng)成分分析

餅粕、糟渣類飼料經(jīng)常被用來替代反芻動物日糧中精料組成部分，我國南方由于優(yōu)質(zhì)飼料資源匱乏，使得因地制宜開發(fā)供應(yīng)量大、飼喂價(jià)值高的地方性飼草資源成為熱門關(guān)注話題。飼料中粗蛋白、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量是初步評判反芻動物飼料營養(yǎng)價(jià)值和飼用價(jià)值的重要依據(jù)。本試驗(yàn)中，山蒼子果渣粗蛋白含量較羊草高，說明山蒼子果渣是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)資源，具有一定的利用價(jià)值；山蒼子果渣粗脂肪含量明顯高于羊草，主要原因是籽實(shí)類原料油脂含量較高，研磨后僅去除了可揮發(fā)的植物精油，不可揮發(fā)的類脂肪依然有殘留。從數(shù)據(jù)上分析，山蒼子果渣具有成為一種非常規(guī)飼料進(jìn)行開發(fā)利用的潛力。

3.2 山蒼子果渣對瘤胃產(chǎn)氣的影響

相對于中性洗滌纖維，飼料中的粗蛋白更容易被反芻動物瘤胃降解發(fā)酵，這兩項(xiàng)營養(yǎng)指標(biāo)與瘤胃產(chǎn)氣發(fā)酵特性直接相關(guān)，NSAHLAI等[22]也證實(shí)了粗蛋白、中性洗滌纖維與產(chǎn)氣量之間的關(guān)系。本試驗(yàn)中，山蒼子果渣粗蛋白和中性洗滌纖維都高于羊草，但產(chǎn)氣試驗(yàn)數(shù)據(jù)卻出現(xiàn)反常，整個(gè)產(chǎn)氣階段山蒼子果渣組發(fā)酵受到抑制，這可能與發(fā)酵底物自身特性以及瘤胃微生物降解能力有關(guān)[23]。大量研究證明，山蒼子精油對真菌、細(xì)菌等微生物具有廣譜的抑菌效果[24-27]，吳均等[28]研究山蒼子精油的抑菌效果發(fā)現(xiàn)，5%的山蒼子精油對金黃色葡萄球菌與枯草芽孢桿菌有明顯的抑制功能；HU等[29]以耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)為研究對象，發(fā)現(xiàn)山蒼子精油對其細(xì)胞膜具有破壞作用，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)生物大分子滲漏而死亡。本試驗(yàn)中，山蒼子果渣對瘤胃微生物的抑制，很可能與底物中殘留的山蒼子精油和精油之外的萜類物質(zhì)有關(guān)，石寧等[30]研究發(fā)現(xiàn)，添加400 mg/L山蒼子精油對肉羊體外瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生抑制作用，與本研究結(jié)果一致。

3.3 山蒼子果渣對瘤胃體外發(fā)酵特性的影響

常規(guī)營養(yǎng)指標(biāo)并不能準(zhǔn)確地評定飼料的營養(yǎng)價(jià)值，飼料的資源化利用還與其適口性、消化率以及飼喂動物種類等因素有關(guān)。反芻動物瘤胃中棲息著數(shù)量龐大、復(fù)雜多樣的微生物菌群，瘤胃發(fā)酵特性直接影響飼料消化、營養(yǎng)物質(zhì)吸收和能量代謝。瘤胃pH值反映底物發(fā)酵產(chǎn)生堿性物質(zhì)和有機(jī)酸的生成，山蒼子果渣經(jīng)48 h體外產(chǎn)氣發(fā)酵后，發(fā)酵液pH值略高于羊草，可能是由于羊草在發(fā)酵時(shí)產(chǎn)生了較多的揮發(fā)性脂肪酸。山蒼子果渣在整個(gè)產(chǎn)氣階段甲烷產(chǎn)量為0，顯著低于羊草組，可能是山蒼子果渣殘留有揮發(fā)性精油，抑制了瘤胃微生物的生長，使得甲烷生成也受到抑制，OSKOUEIAN等[31]也證實(shí)了植物精油在抑制瘤胃產(chǎn)氣的同時(shí)，還能降低甲烷的產(chǎn)量。另外，山蒼子精油本身也有抑制甲烷生成的能力，石寧等[30]在添加400 mg/L山蒼子精油時(shí)，甲烷產(chǎn)量降低了48.6%，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

乙酸、丙酸、丁酸等揮發(fā)性脂肪酸是瘤胃碳水化合物發(fā)酵的主要產(chǎn)物，其主要作用是維持瘤胃內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，并能給反芻動物提供70%～80%的能量[32]。本試驗(yàn)中，山蒼子果渣抑制瘤胃產(chǎn)氣發(fā)酵，導(dǎo)致乙酸、丙酸、丁酸等揮發(fā)性脂肪酸生成均低于羊草，除了與山蒼子果渣殘留抑菌物質(zhì)有關(guān)外，還可能是因?yàn)轱炂深愶暳侠w維素與半纖維素含量低于羊草，再加上木質(zhì)素的屏障作用，使得揮發(fā)性脂肪酸生成的前體物質(zhì)不足，這與武月雷等[33]研究油茶籽粕體外發(fā)酵結(jié)果一致。本試驗(yàn)中，山蒼子果渣發(fā)酵氨態(tài)氮含量低于羊草，可能是殘留植物精油抑制瘤胃超級產(chǎn)氨菌的生長而引起的。張然等[34]研究發(fā)現(xiàn)，添加牛至油質(zhì)量濃度為400 mg/L時(shí)，氨態(tài)氮含量降低了20.3%，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。雖然山蒼子果渣對瘤胃產(chǎn)氣表現(xiàn)出抑制性，但由于果渣中某些養(yǎng)分易被降解，在產(chǎn)氣試驗(yàn)初已產(chǎn)生氨態(tài)氮，產(chǎn)氣中后期微生物生長又受到抑制，氮源無法被微生物利用合成微生物蛋白，在發(fā)酵液中長時(shí)間累積，導(dǎo)致最終氨態(tài)氮含量與羊草組差異不顯著。

山蒼子果渣對瘤胃產(chǎn)氣發(fā)酵有抑制作用，能有效降低甲烷產(chǎn)量，在反芻動物飼料中不宜大量添加，其添加上限以及抑制產(chǎn)氣的原因還需進(jìn)一步研究。