血散薯塊根內(nèi)生真菌Periconia igniaria Stdif10發(fā)酵產(chǎn)物的生物活性研究

林 偉,駱海玉,鄧業(yè)成,鄧志勇,顏楨靈,張 澤,王瑞昊,湯夏安,馮蓓蓓

(珍稀瀕危動植物生態(tài)與環(huán)境保護(hù)省部共建教育部重點實驗室/廣西珍稀瀕危動物生態(tài)學(xué)重點實驗室/廣西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,廣西 桂林 541006)

血散薯學(xué)名黔桂千金藤(StephaniadielsianaY.C.Wu),又名金不換、一滴血,為防己科千金藤屬藥用植物[1]。塊根是血散薯主要藥用部位,具有多種藥理作用,如用于上呼吸道感染、咽炎、瘡癰、胃痛、胃腸炎、牙痛、神經(jīng)痛、跌打損傷等的治療[2],并對多種植物病原真菌具有良好的抑制作用[3-4]。血散薯常生于林中、山谷或溪邊多石礫的地方,主要分布于兩廣、貴州南部和湖南南部等地,分布范圍窄,資源有限。

植物內(nèi)生真菌在植物中普遍存在,是指生活史中的某一階段或全部階段生活在健康植物組織內(nèi)、對宿主植物組織并不引起明顯病害癥狀的真菌[5]。植物內(nèi)生真菌可以促進(jìn)宿主植物營養(yǎng)吸收、提高植物抗生物逆境和非生物逆境的能力、刺激植物產(chǎn)生活性物質(zhì)等,并且在與宿主植物長期協(xié)同進(jìn)化過程中,可產(chǎn)生結(jié)構(gòu)類型豐富、活性顯著的代謝產(chǎn)物[6]。植物內(nèi)生真菌已成為尋找具有農(nóng)藥活性次生代謝產(chǎn)物的重要資源[7],是植物病蟲害生物防治領(lǐng)域的重要研究內(nèi)容之一[8],也是當(dāng)前天然產(chǎn)物開發(fā)研究的熱點。

基于共生理論,血散薯內(nèi)生真菌可能具有多種生物活性功能,筆者所在實驗室(廣西師范大學(xué)珍稀瀕危動植物生態(tài)與環(huán)境保護(hù)省部共建教育部重點實驗室化學(xué)生態(tài)實驗室)首次對血散薯內(nèi)生真菌抗菌[9]、抗蟲活性進(jìn)行研究,以期為血散薯植物資源的保護(hù)以及其內(nèi)生真菌的合理開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試內(nèi)生真菌 供試內(nèi)生真菌為PericoniaigniariaStdif10,由廣西師范大學(xué)珍稀瀕危動植物生態(tài)與環(huán)境保護(hù)省部共建教育部重點實驗室化學(xué)生態(tài)實驗室前期從血散薯塊根中分離和鑒定,GenBank序列號為MF159371。

1.1.2 供試玉米象 供試玉米象為Sitophiluszeamais由本實驗室提供,將其置于培養(yǎng)罐中,在溫度28 ℃、相對濕度75%條件下,以小麥粒飼養(yǎng)。待新一代成蟲大量出現(xiàn)后14～21 d,篩選成蟲供試驗用[10]。

1.1.3 供試植物病原真菌 供試植物病原真菌為辣椒炭疽病菌(Colletotrichumcapsica)、水稻胡麻葉病菌(Cochliobolusmiyabeanus)、茶輪斑病菌(Pestalotiopsistheae)、甘藍(lán)黑斑病菌(Alternariaoleracea)、甘蔗鳳梨病菌(Ceratocystisparadoxa)、煙草黑脛病菌(Phytophthoraparasiticavar.nicotianae)、玉米大斑病菌(Exserohilumturcicum)、金橘砂皮病菌(Diaporthecitri)、貢柑鏈格孢菌(Alternariacitri),其中,金橘砂皮病菌和貢柑鏈格孢菌由廣西特色作物研究所提供,其余由廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理室提供。

1.1.4 供試動物病原細(xì)菌 供試動物病原細(xì)菌為產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)、銅綠假單孢菌(Pseudomonasaeruginosa)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、普通變形桿菌(Proteusvulgaris)、傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphi)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、炭疽桿菌(Bacillusanthraci),所有動物病原細(xì)菌均由桂林醫(yī)學(xué)院微生物實驗室提供。

1.1.5 培養(yǎng)基 培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB)、牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基。

1.1.6 試劑 石油醚、丙酮、乙酸乙酯和正丁醇等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.7 儀器 YXQ-LS-50SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、SHA-B水浴恒溫振蕩器(常州國華電器有限公司)、VS-840-1型潔凈工作臺(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、RE52-2旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海滬西分析儀器廠)ZHJH-C1112C型潔凈工作臺(上海智城分析儀器制造有限公司)、微量移液槍(日本Nichiryo公司)、LRH-250-G光照培養(yǎng)箱(廣東省醫(yī)療器械廠)、CE2069A型電磁爐(深圳艾美特有限公司)、Sartorius電子天平(北京賽多利斯系統(tǒng)有限公司)等。

1.2 試驗方法

1.2.1 內(nèi)生真菌發(fā)酵 采用經(jīng)典大米固體發(fā)酵法,先將菌種從保種管里接種至PDA培養(yǎng)基活化,將活化3 d后的菌株用滅菌后的打孔器打取菌餅(直徑0.4 cm)置于裝有150 mL PDB的錐形瓶中,放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱中,于28 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)7 d。將發(fā)酵液加至已滅菌的大米培養(yǎng)基中置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2個月,待用。

1.2.2 內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物初步分離 采用有機(jī)溶劑液-液萃取法對上一步的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行初步分離,分別以等量的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇溶劑進(jìn)行萃取,得到石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取物。

1.2.3 觸殺活性測定 參考鞠克升[11]、姜洪等[12]、余海濤等[13]的濾紙藥膜法,測定以上3種萃取物對玉米象的觸殺活性。具體操作：用丙酮作為溶劑,分別將3種萃取物配制成1.573、2.360、3.145、4.718、6.290、7.863 mg/cm2濃度梯度的藥液,在直徑為9 cm的培養(yǎng)皿底放入同樣直徑的圓形濾紙,在濾紙上滴入相應(yīng)濃度藥液1 mL,在同直徑的另一濾紙上滴加等量純丙酮作為空白對照(CK)。皿壁上涂一層聚四氟乙烯濃縮分散液防止玉米象爬出,每皿放30頭玉米象,每個處理3個重復(fù),于72 h后觀察結(jié)果,以撥針觸及成蟲尾部,觸角及足不動者為死亡。通過SPSS軟件統(tǒng)計死亡率,再按照武懷恒等[14]的方法計算得到毒力回歸方程。

1.2.4 驅(qū)避活性測定 參考張海燕等[15]的濾紙藥膜法,用丙酮將2種萃取物(石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物)分別配制成3.932、7.863、15.726 mg/cm2濃度梯度的藥液,將直徑為9 cm的圓形濾紙裁成兩半,一半濾紙滴加相應(yīng)濃度藥液作為處理組,另一半濾紙滴加等量純丙酮作為對照組,以上濾紙置于室溫下,待丙酮揮發(fā)后,將兩半濾紙重新并接,用黏膠紙固定后置于同一培養(yǎng)皿內(nèi),皿壁上涂一層聚四氟乙烯濃縮分散液防止玉米象爬出。每皿放30頭玉米象,每個處理3個重復(fù),分別于24、48、72、96 h觀察結(jié)果[16],并按如下公式計算驅(qū)避率：驅(qū)避率=(對照組試蟲數(shù)-處理組試蟲數(shù))/對照組試蟲數(shù)×100%。

1.2.5 抗真菌活性測定 參考DENG等[3]的菌絲生長速率法,測定2種萃取物(石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物)對9種植物病原真菌的抗菌活性。將相應(yīng)菌種接種至PDA中,27 ℃恒溫培養(yǎng)72 h,進(jìn)行活化。將萃取物先用丙酮配制成0.000 1、0.001 0、0.010 0、0.100 0、1.000 0、10.000 0 mg/mL的質(zhì)量濃度梯度,在超凈工作臺中將1 mL藥液與9 mL熱熔PDA混合均勻,倒入直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中制成帶藥培養(yǎng)基。在已活化的供試菌邊緣用無菌打孔器打出菌餅(直徑0.4 cm),接種至帶藥培養(yǎng)基中(菌絲面朝下),每個培養(yǎng)皿接3個菌餅(甘蔗鳳梨病菌每皿接1個),每個處理3個重復(fù)。對照組用等量丙酮代替藥液,置于27 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后,用十字交叉法測量菌落直徑,通過SPSS 10.0軟件統(tǒng)計抑制率,再按照1.2.3的方法計算得到毒力回歸方程。

1.2.6 抗細(xì)菌活性測定 參考慕立義[17]的帶藥培養(yǎng)基涂布法,測定2種萃取物(石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物)對10種動物病原細(xì)菌的抗菌活性。將相應(yīng)菌種接種至牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中,37 ℃水浴恒溫振蕩器培養(yǎng)12 h活化。將發(fā)酵產(chǎn)物用丙酮配制成0.031 25、0.062 50、0.125 00、0.250 00、0.500 00、1.000 00 mg/mL的質(zhì)量濃度梯度,取1 mL藥液與9 mL熱熔牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基混合均勻,倒入直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中制成帶藥培養(yǎng)基。取0.1 mL已活化的菌懸液與9.9 mL無菌水混合均勻,吸取0.1 mL加到帶藥培養(yǎng)基上,用涂布棒涂布均勻,制成帶藥培養(yǎng)平板,每個處理3個重復(fù)。陽性對照組CK用等量50 μg/mL氯霉素代替藥液,陰性對照組CK用等量無菌水代替藥液,其他條件不變,37 ℃條件下培養(yǎng)24 h后,觀察結(jié)果,以不長菌的最低質(zhì)量濃度為該藥液對動物病原細(xì)菌的最低抑制質(zhì)量濃度(MIC)。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌P.igniaria Stdif10不同溶劑萃取物對玉米象的觸殺活性

采用濾紙藥膜法測定了內(nèi)生真菌P.igniariaStdif10發(fā)酵產(chǎn)物的3種不同溶劑萃取物對玉米象的觸殺活性,結(jié)果如表1所示。石油醚萃取物對玉米象的觸殺活性最好,LC50值為2.295 1 mg/cm2；其次為乙酸乙酯萃取物,LC50值為2.582 6 mg/cm2；正丁醇萃取物效果較差,對玉米象基本無影響。上述結(jié)果說明活性物質(zhì)集中在石油醚層,屬于低極性物質(zhì)。

表1 內(nèi)生真菌P.igniaria Stdif10不同溶劑萃取物對玉米象的觸殺活性Tab.1 Contact toxicity of different solvent extracts of endophytic fungus P.igniaria Stdif10 on S.zeamais

注：“—”表示無活性。正丁醇萃取物對玉米象無觸殺活性,故未計算其毒力回歸方程及LC50值。

Note：“—”Means inactive.Because n-butanol extract had no contact toxicity toSitophiluszeamais,the toxicity regression equation and median lethal concentration were not calculated.

2.2 內(nèi)生真菌P.igniaria Stdif10不同溶劑萃取物對玉米象的驅(qū)避活性

基于以上觸殺活性結(jié)果,進(jìn)一步測定了石油醚層和乙酸乙酯層萃取物對玉米象的驅(qū)避活性,結(jié)果如表2。石油醚萃取物在15.726 mg/cm2濃度下,處理96 h內(nèi)驅(qū)避率均大于80%,并在處理96 h時達(dá)到100%的驅(qū)避率。并且,在處理48 h后石油醚萃取物3個濃度梯度的驅(qū)避率均在62%以上。乙酸乙酯萃取物的驅(qū)避率略低于石油醚萃取物,不同時間下3個濃度梯度的驅(qū)避率整體在50%以上。上述結(jié)果表明,萃取物對玉米象有較好的驅(qū)避活性,并且驅(qū)避活性物質(zhì)極性較低,集中于石油醚層。

表2 內(nèi)生真菌P.igniaria Stdif10不同溶劑萃取物對玉米象的驅(qū)避率Tab.2 Repelling rate of different solvent extracts of endophytic fungus P.igniaria Stdif10 on S.zeamais %

2.3 內(nèi)生真菌P.igniaria Stdif10不同溶劑萃取物對9種植物病原真菌的抗菌活性

采用菌絲生長速率法測定了內(nèi)生真菌P.igniariaStdif10石油醚和乙酸乙酯萃取物對9種植物病原真菌的抗菌活性。由表3可知,2種不同溶劑萃取物對9種供試植物病原真菌表現(xiàn)出不同程度的抗菌活性。石油醚萃取物抗菌活性較好,對9種植物病原真菌的EC50值介于0.054 7～0.319 8 mg/mL,均在0.32 mg/mL以下。其中,對煙草黑脛病菌和金橘砂皮病菌的抗菌活性較好,EC50值分別為0.071 6 、0.054 7 mg/mL,其次為辣椒炭疽病菌,EC50值為0.117 3 mg/mL。乙酸乙酯萃取物的抑菌活性相對較弱,對9種供試植物病原真菌的EC50值介于0.524 1～2.181 4 mg/mL。以上結(jié)果表明，內(nèi)生真菌P.igniariaStdif10抗植物病原真菌活性成分主要集中在石油醚層。

2.4 內(nèi)生真菌P.igniaria Stdif10不同溶劑萃取物對10種動物病原細(xì)菌的抗菌活性

采用帶藥培養(yǎng)基涂布法測定了內(nèi)生真菌P.igniariaStdif10石油醚和乙酸乙酯萃取物對10種動物病原細(xì)菌的MIC值。由表4可知,2種不同溶劑萃取物對10種供試動物病原細(xì)菌有較好的抑制效果。石油醚萃取物對10種供試動物病原細(xì)菌的MIC值介于0.125～0.500 mg/mL,其中對蠟樣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的MIC值為0.125 mg/mL。乙酸乙酯萃取物對10種供試動物病原細(xì)菌的MIC值為0.250～1.000 mg/mL。石油醚萃取物抗細(xì)菌活性優(yōu)于乙酸乙酯萃取物,即內(nèi)生真菌P.igniariaStdif10抗動物病原細(xì)菌的活性成分主要集中在石油醚層。此外,由表4結(jié)果可以看出，2種不同溶劑萃取物對革蘭氏陽性菌的抑制效果要優(yōu)于革蘭氏陰性菌。

表3 內(nèi)生真菌P.igniaria Stdif10不同溶劑萃取物的抗真菌活性Tab.3 Antifungal activity of different solvent extracts from endophytic fungus P.igniaria Stdif10

表4 內(nèi)生真菌P.igniaria Stdif10不同溶劑萃取物的抗細(xì)菌活性Tab.4 Antibacterial activity of different solvent extracts from endophytic fungus P.igniaria Stdif10

3 結(jié)論與討論

本研究首次報道了血散薯內(nèi)生真菌P.igniariaStdif10發(fā)酵產(chǎn)物不同溶劑萃取物的抗蟲活性。血散薯內(nèi)生真菌P.igniariaStdif10萃取物對玉米象具有良好的觸殺活性和驅(qū)避活性,對辣椒炭疽病菌、水稻胡麻葉病菌、茶輪斑病菌、甘藍(lán)黑斑病菌、甘蔗鳳梨病菌、煙草黑脛病菌、玉米大斑病菌、金橘砂皮病菌、貢柑鏈格孢菌9種植物病原真菌具有一定的抗菌活性,對產(chǎn)氣腸桿菌、銅綠假單孢菌、大腸桿菌、普通變形桿菌、傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、炭疽桿菌10種動物病原細(xì)菌具有較好的抗菌活性。并且石油醚萃取物表現(xiàn)出較好的抗蟲和抗菌活性,其中,對玉米象的觸殺活性LC50值為2.295 1 mg/cm2。汪玉平等[18]報道，土荊芥的石油醚萃取物為25.52 mg/cm2時對玉米象有66.50%的觸殺死亡率,與之相比,本研究的石油醚萃取物對玉米象有良好的觸殺活性。同時,對玉米象處理48 h后,石油醚萃取物3個濃度梯度的驅(qū)避率均大于62%,同濃度相同時間下,驅(qū)避效果總體要優(yōu)于水菖蒲的4種溶劑萃取物(44.41%～72.26%)[19]。另外,其對9種植物病原真菌的EC50值介于0.054 7～0.319 8 mg/mL,略高于分離自同屬植物廣西地不容內(nèi)生真菌DBR-23的萃取物,后者對同樣9種病原真菌的EC50值介于0.020 6～0.174 6 mg/mL[20]；對10種動物病原細(xì)菌的MIC值介于0.125～0.500 mg/mL,抑菌效果要優(yōu)于地不容內(nèi)生真菌DBR-23萃取物,后者對相應(yīng)的10種動物病原細(xì)菌的MIC值介于2.500～10.000 mg/mL[21]。

綜上,本研究結(jié)果表明,血散薯內(nèi)生真菌P.igniariaStdif10中含有廣譜的抗菌活性物質(zhì),這與其宿主植物血散薯抗菌活性作用相互印證[3-4],同時具有較好的抗蟲活性,并且活性物質(zhì)主要集中在石油醚層,為一些極性較小的物質(zhì),這為進(jìn)一步在其中尋找生物活性成分提供了依據(jù)。下一步計劃將薄層色譜法(TLC)、硅膠柱層析、高效液相色譜法(HPLC)等多種方法相結(jié)合,對石油醚萃取物進(jìn)行系統(tǒng)分離。用TLC確定洗脫劑的最佳溶劑配比,采用硅膠柱層析進(jìn)行初步分離,用紫外線燈以及碘缸分析餾分,再用HPLC進(jìn)一步分離純化。將得到的單體化合物采用多孔板-MTT細(xì)胞活力測定法,借助酶標(biāo)儀檢測其抗菌活性。采用紫外光譜(UV)、紅外光譜(IR)、質(zhì)譜(MS)、核磁共振氫譜(1H NMR)和核磁共振碳譜(13C NMR)等方法并結(jié)合相關(guān)的文獻(xiàn)資料,比對鑒定分離得到的單體化合物的結(jié)構(gòu),從而明確該單體化合物。