白楊素對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎NLRP3炎性體的作用機(jī)制探討

張涵 丁雨琦 陳偉圣 金麗霞* 金怡

急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎（AGA）是一種因嘌呤代謝紊亂而引起尿酸鹽（MSU）沉積的關(guān)節(jié)炎癥，沉積的尿酸鹽結(jié)晶被核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（NLRP3）識別后激活炎癥信號通路，刺激機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)［1］。目前，分子對接技術(shù)應(yīng)用于研究中藥作用機(jī)制的報(bào)道屢見不鮮，通過結(jié)合結(jié)構(gòu)生物學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)等學(xué)科的研究方法，建立物質(zhì)-靶點(diǎn)-藥效關(guān)系，發(fā)掘藥物活性成分及疾病治療位點(diǎn)，預(yù)測藥物的多靶標(biāo)作用及其脫靶效應(yīng)［2］。2017年10月至12月作者通過動物實(shí)驗(yàn)，研究黃酮類單體藥物白楊素對痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制，為治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎提供藥物研究方向和治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物ICR雄性小鼠SPF級40只，體重20g左右，上海BK公司，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2013-0016。

1.2 試劑與材料秋水仙堿（國家標(biāo)準(zhǔn)品物質(zhì)）；白楊素、尿酸鈉（上海源葉生物科技有限公司）；TNF-α試劑盒、RIPA裂解液、PMSF；兔抗Caspase-1多克隆抗體、兔抗NLRP3多克隆抗體（英國abcam公司）；BCA試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 儀器及軟件XA205DU電子天平（瑞典METTLERTOLEDO公司）；Multiskan酶標(biāo)儀（美國Thermofisher公司）；高速冷凍離心機(jī)、-80℃冰箱（ThermoFisher）、SDS-PAGEN凝膠垂直電泳槽（美國BIORAD公司）；化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀（美國Aplegen公 司）；AccelrysDiscoveryStudio2.5、ChemBioOffice2010、PyMOL2.0.6、AutoDockTools1.5.6。

1.4 方法（1）分子對接數(shù)據(jù)建立：文獻(xiàn)查找白楊素（Chrysin）結(jié)構(gòu)式，于軟件ChemBio3D中設(shè)置參數(shù)進(jìn)行分子力場MM2、動力學(xué)模擬優(yōu)化，并進(jìn)行類藥性質(zhì)分析，建立分子對接配體。查詢與NLRP3炎性體、痛風(fēng)相關(guān)的報(bào)道，最終確定以NLRP3、caspase-1、ASC、pro-caspase-1、IL-1β、pro-IL-1β，6個(gè)NLRP3炎癥通路傳遞蛋白為靶點(diǎn)，從RCSB數(shù)據(jù)庫中篩選對應(yīng)的人源受體靶蛋白［3］，建立分子對接蛋白庫，見表1。（2）蛋白預(yù)處理：采用軟件DiscoveryStudio2.5預(yù)處理靶蛋白（PrepareProtein），包括清潔蛋白質(zhì)、去除水分子等操作，處理完畢后導(dǎo)出為PDB格式存儲，可得半柔性蛋白。（3）分子對接流程：使用軟件AutoDock進(jìn)行分子對接，導(dǎo)入預(yù)處理后的白楊素及經(jīng)DiscoveryStudio2.5處理的靶點(diǎn)蛋白。參數(shù)文件準(zhǔn)備：使用AutoGrid4.0進(jìn)行能量格點(diǎn)計(jì)算，以靶點(diǎn)蛋白為中心坐標(biāo)，設(shè)置GirdBox網(wǎng)格區(qū)域。使用AutoDock4.0搜索網(wǎng)格范圍內(nèi)對接區(qū)域，采用拉馬克遺傳算法（LamarckianGA4.2），每個(gè)小分子配體均設(shè)定得到20個(gè)構(gòu)象，初始種群數(shù)設(shè)置為150，能量評定最大次數(shù)為2500000，其他參數(shù)選擇默認(rèn)值。分子對接計(jì)算：運(yùn)行AutoGrid4.0進(jìn)行格點(diǎn)中相關(guān)能量的計(jì)算，運(yùn)行AutoDock4.0進(jìn)行半柔性對接，對結(jié)果進(jìn)行聚類分析，并將對接較好的蛋白構(gòu)象導(dǎo)出至PyMOL，分析觀察白楊素與NLRP3炎癥信號蛋白的結(jié)合情況。（4）動物分組及處理：40只ICR雄性小鼠，隨機(jī)分為正常組、模型組、陽性組和白楊素組，適應(yīng)性培養(yǎng)1周后，于每天早上10點(diǎn)，以0.1ml/10g為注射量，腹腔注射為給藥方式，正常組和模型組注射生理鹽水，白楊素組和陽性組分別注射白楊素和秋水仙堿溶液，1次/d，連續(xù)6d總計(jì)6次。第4次給藥即第11d時(shí)，給藥前測量小鼠右后足掌厚度，給藥1h后即第11天11點(diǎn)時(shí)造模：模型組、陽性組和白楊素組小鼠足掌底部注射0.05ml（250mg/ml）的尿酸鈉造模建立AGA模型，正常組注射等量生理鹽水，得急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎小鼠模型。（5）藥物對小鼠足掌關(guān)節(jié)炎癥的影響：造模后4、8、12、24、48h分別進(jìn)行小鼠足掌腫脹程度評估（腫脹度=測量時(shí)小鼠右后足掌厚度÷測量時(shí)小鼠左后足掌厚度）。（6）藥物對小鼠TNF-α、Caspase-1、NLRP3、臟器指數(shù)的影響：末次足掌腫脹程度評估后，處死小鼠，摘眼球取血分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法測定血清中TNF-α含量，測定步驟按照試劑盒說明書；摘取腎臟組織稱重計(jì)算臟器指數(shù)，以Westernblot檢測腎臟組織Caspase-1、NLRP3蛋白含量。臟器指數(shù)（%）=（動物腎臟重量g）/（動物體質(zhì)量g）×100%。

表1 人源受體蛋白信息表

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白楊素與通路蛋白作用靶點(diǎn)分析以結(jié)合能和抑制常數(shù)為判斷依據(jù)［4］，對接結(jié)果中NLRP3（PYD區(qū)）、caspase-1的抑制常數(shù)分別為9.13、5.20，提示其與白楊素結(jié)合較好。PyMOL分析靶點(diǎn)結(jié)合情況，白楊素C5上的羥基與NLRP3第23位賴氨酸的羰基形成氫鍵；白楊素C7上的羥基即可與caspase-1肽鏈上第149位絲氨酸的羰基形成氫鍵，還可與第152位的異亮氨酸上的氨基形成氫鍵；由于白楊素與靶點(diǎn)蛋白之間的這些作用力，才使化合物可以與靶標(biāo)緊密結(jié)合，從而抑制其作用，產(chǎn)生藥效，提示白楊素作用靶點(diǎn)為NLRP3炎癥通路中的NLRP3和caspase-1蛋白，作用機(jī)制為阻斷NLRP3N端PYD區(qū)域募集ASC以及改變caspase-1蛋白的正常生理活性，中斷信號傳遞，防治痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎。見表2。

表2 白楊素-受體蛋白對接結(jié)果及白楊素-受體蛋白氫鍵相關(guān)信息表

2.2 白楊素對小鼠足掌關(guān)節(jié)炎癥的影響與正常組比較，模型組足掌腫脹程度明顯升高（P<0.01），表明造模成功。與模型組比較，12h后白楊素組和陽性組腫脹程度降低（P<0.05），24h后白楊素組和陽性組腫脹程度明顯降低（P<0.01）。見表3。

表3 小鼠足掌腫脹程度（±s）

表3 小鼠足掌腫脹程度（±s）

注：與模型組相比#P<0.05；##P<0.01

組別 4h 8h 12h 24h 48h正常組 1.08±0.056 1.06±0.107 1.04±0.045 1.05±0.041 1.04±0.040模型組 1.93±0.134 2.12±0.165 1.85±0.181 2.04±0.204 2.05±0.215陽性組 1.60±0.275 1.77±0.126## 1.63±0.142# 1.48±0.087## 1.30±0.025##白楊素組 1.70±0.163 1.81±0.173 1.65±0.230# 1.66±0.069## 1.65±0.107##

2.3 白楊素對小鼠TNF-α、臟器指數(shù)的影響各組小鼠臟器指數(shù)發(fā)現(xiàn)，相對于模型組，正常組和白楊素組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖1。

圖1 白楊素對小鼠臟器指數(shù)、TNF-α表達(dá)的影響

2.4 白 楊 素 對 小 鼠 腎 臟NLRP3、caspase-1的影響與正常組比較，模型組小鼠腎臟NLRP3、Caspase-1蛋白量升高（P<0.01），提示造模成功；與模型組比較，給藥組小鼠腎臟NLRP3、Caspase-1蛋白量降低（P<0.01）。見表4。

表4 白楊素對小鼠腎臟NLRP3、Caspase-1表達(dá)的影響（±s）

表4 白楊素對小鼠腎臟NLRP3、Caspase-1表達(dá)的影響（±s）

注：與正常組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01

組別 NLRP3 Caspase-1正常組 0.41±0.01 0.12±0.01模型組 0.93±0.01* 0.55±0.02*陽性組 0.48±0.02# 0.15±0.01#白楊素組 0.59±0.02# 0.2±0.03#

3 討論

NLRP3作 為 一 種NOD樣 受 體（NODlikereceptors，NLRs）由LRR-NACHT-PYD（NALP3）三部分組成，在巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞中大量表達(dá)，可作為模式識別受體（PRR）在炎癥通路中起啟動作用，沉積的MSU被NLRP3C端的富亮氨酸區(qū)（LRR）識別，N端的熱蛋白結(jié)構(gòu)域（PYD）則與相關(guān)凋亡點(diǎn)樣蛋白（ASC）N端的PYD區(qū)相結(jié)合，而ASC的C端與半胱天冬酶（caspase）的CARD相結(jié)合，從而形成復(fù)雜的NLRP3炎性體，并在三磷酸腺苷（ATP）的作用下寡聚化，活化capase-1，酶解pro-IL-1β釋放成熟的IL-1β介導(dǎo)炎癥激活體內(nèi)炎癥因子的表達(dá)。

炎性體LRR區(qū)域不僅可在識別病原相關(guān)分子模式（PAMPs）后激活NLRP3炎性體，還與線粒體代謝有關(guān)：煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NADPH）作用下產(chǎn)生的大量ROS使硫氧還蛋白相互作用蛋白（TXNIP）游離，并與NLRP3的LRR區(qū)結(jié)合，激活炎性體［5］，抑制LRR區(qū)正?；钚钥芍袛郚LRP3炎性體活化，而在LRR活化后，熱休克蛋白90（HSP90）、泛素連接酶相關(guān)蛋白SGT1（SGT1）脫離NLRP3［6］，使NACHT寡聚化結(jié)構(gòu)域暴露，在ATP聚合作用下發(fā)生寡聚化，刺激PYD募集Caspase-1，通過酶解pro-IL-1β產(chǎn)生IL-1β炎癥因子，同時(shí)體內(nèi)被活化的免疫細(xì)胞可將胞內(nèi)ATP轉(zhuǎn)移至細(xì)胞間隙激活嘌呤能離子通道型受體7（P2X7R），促進(jìn)IL-1β、IL-18、IL-6及腫瘤壞死因子（TNF）-α等的釋放，激活多條胞內(nèi)信號通路［7］，與藥物治療研究過程中發(fā)現(xiàn)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型小鼠不僅caspase-1蛋白濃度明顯升高，TLRs/NF-κB通路、MAPK、氧化損傷等機(jī)制也被激活的相關(guān)報(bào)道一致［8-9］，不僅提示白楊素可能具有多靶性，也指出P2X7可作為痛風(fēng)治療研究靶點(diǎn)，現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道黃酮類化合物因其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)而具有抗炎抗氧化能力，發(fā)現(xiàn)如果A環(huán)上的C-5，7位均有羥基取代時(shí)，有利于抗氧化活性，并會對細(xì)胞的增殖、分泌以及細(xì)胞的相互作用產(chǎn)生影響，產(chǎn)生強(qiáng)烈的抗炎作用［10］，現(xiàn)有研究也證明白楊素具有抗氧化損傷的作用［11］，而NLRP3炎性體具有雙重性，既可介導(dǎo)正常的生理反應(yīng)，保護(hù)機(jī)體，也可放大炎癥效應(yīng)，因此在對NLRP3炎性體過程中要避免影響其正常生理活性［12］。

分子對接方法均通過構(gòu)象搜索和能量評估兩個(gè)階段，對已知結(jié)構(gòu)的配體和蛋白質(zhì)的結(jié)合模式及結(jié)合自由能進(jìn)行預(yù)測［13］。在構(gòu)象搜索中，全局搜索算法和啟發(fā)式搜索算法的應(yīng)用最為廣泛，前者采用剛性的對接模式，雖然可加快對復(fù)合物全局的位點(diǎn)搜索，但并不適合配體與蛋白質(zhì)未知結(jié)合部位的研究；后者為AutoDock、Vina、GOLD、Glide等常用軟件的算法，研究范圍局限于結(jié)合位點(diǎn)附近，但是將柔性對接納入考慮范圍，準(zhǔn)確性更高；此外，進(jìn)行能量評估的打分函數(shù)也有不同的特點(diǎn)，因此合適的計(jì)算模式，可提高對接研究的可靠性。