塞尼卡谷病毒3ABC蛋白的表達(dá)、純化及多克隆抗體制備

連凱琪，周玲玲，張明亮，張 慢，王英杰，林正丹，宋玉偉

(安陽工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院/河南省動物疫病防控與營養(yǎng)免疫院士工作站/河南省獸用生物制品研發(fā)與應(yīng)用國際聯(lián)合實驗室，河南 安陽 455000)

2002年，美國首次報道SVV，確認(rèn)該病毒存在于PER.C6細(xì)胞培養(yǎng)物中，認(rèn)為是細(xì)胞培養(yǎng)基的污染物。在對先前患有水皰癥狀的病豬保藏樣品進(jìn)行測序分析發(fā)現(xiàn)，自20世紀(jì)80年代，美國豬群中便存在該病毒[6]。2002—2015年，豬感染SVV的病例只有在美國和加拿大零星發(fā)生，但自2015年下半年起，在美國、巴西、哥倫比亞、中國等相繼出現(xiàn)了SVV感染豬的病例。2015年初，巴西有6個州報告了SVV感染的疫情[7-8]。同年，美國中西部多個地區(qū)的豬群發(fā)生水皰性疫情，感染豬的鼻吻、蹄冠狀帶部位出現(xiàn)水皰樣病變，偶見腹瀉癥狀，病情急促，新生仔豬病死率達(dá)30%～70%。后經(jīng)實驗室病原學(xué)鑒別診斷，排除口蹄疫、豬水皰病和水皰性口炎等重要動物疫病，最終確診為SVV感染[9-10]。2015年5月，我國廣東省也發(fā)生了SVV感染豬的疫情，其特征是鼻吻和蹄冠部出現(xiàn)明顯水皰，發(fā)病母豬發(fā)熱、厭食，產(chǎn)房仔豬急性死亡[11-12]。2016年10月，泰國北部一豬場暴發(fā)SVV疫情[13]。2017年初，我國福建和河南再次發(fā)生SVV感染豬的疫情[14]。至此，SVV在我國豬群中明確存在，且有蔓延趨勢，在河南省的豬群中也有該病的報道[14]。

豬感染SVV后出現(xiàn)水皰的臨床表現(xiàn)與感染口蹄疫病毒(FMDV)、豬水皰病毒(SVDV)、水皰性口炎病毒(VSV)等極為相似，主要都是鼻子和冠狀帶出現(xiàn)水皰、跛行、厭食、嗜睡、發(fā)燒，并且持續(xù)排毒[6]。其中，口蹄疫和豬水皰病都是國家法定一類動物疫病，且口蹄疫疫情一旦發(fā)現(xiàn)將對患病動物和同群動物全部捕殺，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，這就要求建立方便、快捷、準(zhǔn)確的鑒別診斷產(chǎn)品，早日確診，進(jìn)行相應(yīng)治療或處理[4-6]。非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC在FMDV的疫苗免疫和野毒感染的鑒別診斷中發(fā)揮著重要的作用，SVV與FMDV屬于同科病毒，有著相似的病毒框架和結(jié)構(gòu)。鑒于此，克隆SVV3ABC基因，進(jìn)行原核表達(dá)，制備抗原和抗體，以期為后續(xù)開發(fā)3ABC抗原或抗體的檢測試劑盒奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 SVV病料

試驗所用SVV病料由河南省動物疫病防控與營養(yǎng)免疫院士工作站采集保存。

1.2 載體及菌株

試驗所用的pET30a(+)載體由河南省獸用生物制品研發(fā)與應(yīng)用國際聯(lián)合實驗室保存，感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α和BL21(DE3)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要試劑

病毒基因組提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、LATaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ和BamH Ⅰ、T4 DNA連接酶、膠回收和質(zhì)粒抽提試劑盒、DL2000 Marker和DL15000 Marker，均購自寶生物工程(大連)有限公司；蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.4 病毒基因組的提取和3ABC基因的PCR擴(kuò)增

將病料進(jìn)行研磨，取少許放入離心管中，按照試劑盒步驟提取病毒RNA。把提取的病毒RNA取5 μL反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為PCR擴(kuò)增的模板。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中公布的序列，設(shè)計1對引物(3ABC-F：5′-CGCGGATCCATGAGCCCGAACGAAA-

ATGACG-3′和3ABC-R：5′-TCCCAAGCTTTACTGCATGGTTGCCAGCGGT-3′，在上、下游引物中分別引入位點BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位點，以及起始密碼子和終止密碼子)，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為988 bp。PCR反應(yīng)體系為50 μL，其中LATaqDNA聚合酶25 μL，10 μmol/L的上、下游引物各1 μL，cDNA模板1.5 μL，用ddH2O補(bǔ)至50 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35個循環(huán);72 ℃ 延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物6 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。

1.5 重組質(zhì)粒pET30a(+)-3ABC的構(gòu)建

膠回收純化的3ABC基因片段和載體pET30a(+)均經(jīng)BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切后膠回收，將回收的目的片段和載體片段按一定的比例在T4 DNA連接酶的作用下16 ℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α中，轉(zhuǎn)化平板置溫箱(37 ℃)培養(yǎng)14 h，挑單菌落到含卡那霉素的液體LB中37 ℃搖菌13 h，然后提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切和PCR鑒定，將鑒定陽性的質(zhì)粒送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.6 重組質(zhì)粒pET30a(+)-3ABC的表達(dá)

按照參考文獻(xiàn)[15]中描述的表達(dá)方法對重組質(zhì)粒pET30a(+)-3ABC進(jìn)行原核表達(dá)和SDS-PAGE分析。

第二步則是成像過程，該過程利用衍射原理使物體光波信息得以再現(xiàn)，全息照片在相干激光的照射下，會形成兩個象，一個是初始像，另一個是共軛像。這樣產(chǎn)生的圖像具有較強(qiáng)的立體感，視覺效果也相對真實。值得一提的是，原則上全息照片的每一部分都能再現(xiàn)原物的整個圖像，利用這點，在同一張底片上進(jìn)行多次曝光就可以記錄多個不同的圖像，并且在顯示時也不會互相干擾。

1.7 重組3ABC蛋白的可溶性表達(dá)分析和純化

將1.6中的表達(dá)菌液擴(kuò)大培養(yǎng)，按照參考文獻(xiàn)[15]中描述的可溶性分析方法對重組3ABC蛋白進(jìn)行可溶性分析。按照參考文獻(xiàn)[16]中的KCl染色切膠純化的方法，對重組3ABC蛋白進(jìn)行純化，并通過SDS-PAGE分析純化的目的蛋白。

1.8 重組3ABC蛋白多克隆抗體的制備

用1.7中純化的重組3ABC蛋白作為抗原免疫2只大鼠(鄭州大學(xué)實驗動物中心)，一免抗原與弗氏完全佐劑等體積混合乳化，二免、三免和四免抗原與弗氏不完全佐劑等體積混合乳化，免疫劑量100 μg/只，背部皮下分點注射，每隔14 d免疫1次。第4次免疫后10 d，心臟采血分離血清，凍存于-20 ℃冰箱備用。

1.9 多克隆抗體反應(yīng)性和滴度檢測

將1.6中的表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，用制備的大鼠抗3ABC血清作為一抗，HRP標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)為二抗進(jìn)行Western blot，分析制備的多克隆抗體對表達(dá)的重組3ABC蛋白的識別能力。

將純化的重組3ABC蛋白作為抗原包被96孔板，制備的多克隆抗體作為一抗，HRP標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG為二抗進(jìn)行ELISA，分析制備的多克隆抗體的滴度。

2 結(jié)果與分析

2.1 3ABC基因的PCR擴(kuò)增

利用特異性引物擴(kuò)增3ABC基因，PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果顯示，在1 000 bp附近擴(kuò)增出1條比較亮的條帶，與預(yù)期片段988 bp大小相符(圖1)。

2.2 重組質(zhì)粒pET30a(+)-3ABC的構(gòu)建

將重組質(zhì)粒分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增和酶切鑒定，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，結(jié)果顯示，PCR擴(kuò)增條帶單一，大小約988 bp，BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切也出現(xiàn)1條大小約988 bp的條帶(圖2)，測序結(jié)果進(jìn)一步證實重組質(zhì)粒pET30a(+)-3ABC構(gòu)建成功。

M.DL2000 Marker；1.SVV 3ABC基因

M1.DL2000 Marker；M2.DL15000 Marker；1.PCR鑒定；2.雙酶切鑒定

2.3 重組質(zhì)粒pET30a(+)-3ABC的表達(dá)

重組質(zhì)粒pET30a(+)-3ABC轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析，在55 ku處出現(xiàn)1條特異性條帶，pET30a(+)空載體表達(dá)對照組沒有出現(xiàn)目的條帶(圖3)，該條帶與預(yù)測的目的蛋白大小相符。

2.4 重組3ABC蛋白的可溶性表達(dá)和純化

pET30a(+)-3ABC轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21 (DE3)在IPTG終濃度為0.5 mmol/L、37 ℃下誘導(dǎo)表達(dá)6 h時， 3ABC重組蛋白主要在包涵體中表達(dá)(圖4)。SDS-PAGE結(jié)果表明，純化的重組蛋白在約55 ku的位置出現(xiàn)了1條單一的條帶(圖5)，與2.3中表達(dá)的3ABC重組蛋白位置相符。

M．蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.BL21[pET30a(+)]未誘導(dǎo)組；2.BL21[pET30a(+)]誘導(dǎo)組；3.BL21[pET30a(+)-3ABC]未誘導(dǎo)組；4.BL21[pET30a(+)-3ABC]誘導(dǎo)組

M.蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.BL21[pET30a(+)]誘導(dǎo)菌液；2.BL21[pET30a(+)-3ABC]誘導(dǎo)菌體裂解上清；3.BL21[pET30a(+)-3ABC]誘導(dǎo)菌體裂解沉淀

2.5 多克隆抗體的反應(yīng)性和效價檢測

Western blot分析結(jié)果顯示，表達(dá)的重組3ABC蛋白與大鼠抗3ABC血清反應(yīng)形成了特異的抗原抗體反應(yīng)帶，而與大鼠陰性血清反應(yīng)未形成相應(yīng)條帶(圖6)，表明制備的大鼠抗3ABC血清特異性良好，滴度大于1∶64 000。

M.蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.純化的重組3ABC蛋白

M.蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.抗3ABC陽性大鼠血清；2.陰性大鼠血清

3 結(jié)論與討論

SVV是一種新發(fā)豬病毒病，目前關(guān)于SVV疫苗和免疫診斷研究的報道相對較少。SVV與FMDV屬于同科病毒，基因和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)比較相似，因此，SVV的疫苗類型和免疫診斷產(chǎn)品與FMDV相似[6,17]。FMDV 3ABC抗體診斷試劑盒在FMDV的診斷，尤其是野毒感染與疫苗免疫鑒別診斷中發(fā)揮著非常重要的作用[18]。因此，本試驗對SVV3ABC基因進(jìn)行表達(dá)，并制備其多克隆抗體，以期為進(jìn)一步研發(fā)SVV 3ABC抗原或抗體診斷試劑盒提供基礎(chǔ)。

本試驗首先克隆了SVV的3ABC基因，其大小為969 bp，并構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET30a(+)-3ABC，將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，在IPTG為0.5 mmol/L、37 ℃條件下誘導(dǎo)6 h時，3ABC重組蛋白實現(xiàn)了高效表達(dá)。在表達(dá)條件多次優(yōu)化后，該融合蛋白仍主要以包涵體形式存在，這對融合蛋白的純化增加了難度?；蛟S這與蛋白質(zhì)本身的特性有關(guān)，后期可以通過考慮選取某一段進(jìn)行表達(dá)，實現(xiàn)可溶性表達(dá)，易于獲取有效抗原。本試驗通過切膠純化的重組3ABC蛋白免疫大鼠制備的多克隆抗體具有良好的反應(yīng)性和較高的滴度。切膠純化雖然簡便易于操作，但不易大量純化抗原，因此，在后期研究中應(yīng)該建立包涵體純化方法。

本研究首次表達(dá)了SVV 3ABC，可能與所用原核表達(dá)載體、感受態(tài)細(xì)胞、3ABC基因密碼子未優(yōu)化等有關(guān)，未能實現(xiàn)3ABC基因的可溶性表達(dá)，這對目的蛋白純化造成一定的困難。后續(xù)仍需調(diào)整實驗方案實現(xiàn)3ABC基因可溶性高效表達(dá)，為進(jìn)一步研發(fā)SVV 3ABC蛋白和抗體的檢測產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。