設(shè)施內(nèi)外春美桃果實有機酸含量及檸檬酸代謝酶活性差異研究

尹寶穎，馬 宏，李中勇，龐錦軒，賈秋蕊，張學(xué)英，徐繼忠

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，河北 保定 071000； 2.保定市農(nóng)業(yè)生態(tài)園管理處，河北 保定 071000；3.遷西縣林業(yè)局，河北 遷西 064300)

桃果外表色澤艷麗，營養(yǎng)豐富，口感細膩，深受消費者喜愛。設(shè)施桃栽培可以實現(xiàn)桃果提前上市，滿足市場需求，因此桃已成為目前設(shè)施果樹栽培的主要樹種[1]，但由于設(shè)施內(nèi)環(huán)境與露地環(huán)境存在差異，設(shè)施內(nèi)栽培的桃樹果實普遍存在口感不佳、低糖高酸的現(xiàn)象[2]。有機酸是果實中酸的主要成分，果實中不同的有機酸種類、含量和比例是決定果實風(fēng)味品質(zhì)的重要基礎(chǔ)[3]。有關(guān)果實中有機酸含量、組分及其相關(guān)酶活性變化已在蘋果、梨、杏、李、藍莓、棗、葡萄等樹種上有研究報道[4-9]。趙永紅等[10]認為，設(shè)施油桃果實中有機酸組分主要為蘋果酸和檸檬酸，隨著果實生長發(fā)育，蘋果酸含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，檸檬酸含量呈平穩(wěn)上升的趨勢。但有關(guān)設(shè)施內(nèi)外有機酸含量差異報道較少。果實中有機酸含量的變化與相關(guān)酶活性的變化關(guān)系密切，已有相關(guān)研究表明，影響果實有機酸含量變化的主要酶包括磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、蘋果酸酶(ME)、蘋果酸脫氫酶(MDH)、檸檬酸合成酶(CS)、異檸檬酸脫氫酶(IDH)和烏頭酸酶(ACO)[11-12]。前人認為有機酸類型不同的果實中有機酸合成酶和代謝酶的活性存在很大差異[13]。本研究分析設(shè)施內(nèi)外春美桃果實不同時期的有機酸含量、組分以及相關(guān)酶的活性變化，為改善設(shè)施內(nèi)春美桃果實品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料選取自河北省順平縣桃樹栽培基地，該基地主栽品種為春美桃，露地樹齡為5 a，樹形為三主枝開心形，株行距為1.5 m×3.0 m，試驗園整體管理水平高；選取長勢一致、生長健壯的樹為試驗樹。設(shè)施內(nèi)桃樹樹齡為5 a，樹形為紡錘形，株行距為1.0 m×2.0 m，試驗園整體管理水平高。于盛花后第5周開始，每周取樣1次，在每棵樹外圍中上部的4個方向各采果1個，共采集5棵樹，采后將果肉立即放入液氮冷凍，然后保存于-80 ℃的超低溫冰箱備用。

1.2 方法

1.2.1 可滴定酸含量的測定 采用標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液滴定法[14]測定可滴定酸含量。

1.2.2 有機酸含量的測定 先將桃果實去皮去核取果肉，準(zhǔn)確稱取3 g果肉，放入研缽，研磨至勻漿轉(zhuǎn)移到10 mL離心管中，加入超純水至刻度，放入超聲振蕩清洗機中超聲30 min，然后放入離心機中，在10 000 r/min、4 ℃下離心30 min，取出上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾到1.5 mL進樣小瓶中，上機測定。

采用液相色譜法測定。色譜儀為Agilent 1260 高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)，帶紫外檢測器。測定條件：Hypersil ODS2色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為KH2PO4(0.02 mol/L，pH值2.4)，流速0.8 mL/min，柱溫40 ℃，進樣量10 μL，檢測波長210 nm。

1.2.3 相關(guān)酶活性的測定

1.2.3.1 酶液的制備 參考HIRAI[15]和李雪梅[16]的方法，略有改動。取3 g果肉用3 mL研磨液在冰浴下研磨，4 000 r/min離心20 min，取上清液定容至5 mL，其中2 mL于4 ℃、15 000 r/min離心15 min，取上清液用提取緩沖液定容至4 mL，即得細胞質(zhì)烏頭酸酶(Cyt-ACO)酶液；沉淀用提取液定容至2 mL，用于測定煙酰胺腺嘌呤二核苷酸-異檸檬酸脫氫酶(NAD-IDH)活性。另外3 mL加入等體積提取液，取其中4 mL在大量透析液(即提取緩沖液)中4 ℃透析過夜，即得PEPC、CS酶液。各項操作均在0～4 ℃下進行。

研磨緩沖液：0.2 mol/L Tris-HCl(pH值8.2)、0.6 mol/L蔗糖、10 mmol/L異抗壞血酸；提取緩沖液：0.2 mol/L Tris-HCl(pH值8.2)、10 mmol/L 異抗壞血酸、0.1% TritonX-100。

1.2.3.2 酶活性的測定 參考HIRAI[15]和羅安才等[17]的方法。測定的反應(yīng)體系為3 mL，各種酶活性分析反應(yīng)體系：PEPC反應(yīng)液含0.8 mol/L Tris-HCl(pH值8.5) 300 μL、0.01 mol/L還原型谷胱甘肽(GSH) 150 μL、3 mmol/L還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH) 150 μL、0.04 mol/L MgCl2150 μL、0.2 mol/L KHCO3150 μL、酶液500 μL、4 mmol/L磷酸烯醇式丙酮酸(PEP) 1 600 μL，紫外波長 340 nm。CS反應(yīng)液含0.8 mol/L Tris-HCl (pH值9.0) 300 μL、0.8 mmol/L 5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB) 150 μL、0.8 mmol/L乙酰輔酶A(acetyl-CoA) 150 μL、超純水300 μL、酶液800 μL、0.08 mol/L草酰乙酸(OAA) 1 300 μL，紫外波長 412 nm。NAD-IDH反應(yīng)液含0.8 mol/L Hepes (pH值9.0) 300 μL、4 mmol/L MnSO4150 μL、16 mmol/L NAD 150 μL、超純水600 μL、酶液1 200 μL、20 mmol/L異檸檬酸鈉600 μL，紫外波長為340 nm。ACO反應(yīng)液含0.8 mol/L Tris-HCl(pH值7.5)300 μL、2 mmol/L NaCl 150 μL、超純水450 μL、酶液1 200 μL、2 mmol/L烏頭酸900 μL，紫外波長為340 nm，測定前酶液用等體積2 mmol/L GSH在30 ℃共培養(yǎng)1 h。加入反應(yīng)底物后立即用UV-2450型紫外分光光度計測定吸光度，以5 s為單位掃描3 min，記錄吸光度變化，重復(fù)3次，以每分鐘吸光度變化0.01為1個酶單位。

2 結(jié)果與分析

2.1 設(shè)施內(nèi)外桃果實可滴定酸含量的變化

由圖1可知，設(shè)施內(nèi)外桃果實可滴定酸含量均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，設(shè)施內(nèi)果實可滴定酸含量是從盛花后第5周開始一直升高，到盛花后第8周達到峰值(1.35%)，然后下降，到盛花后第9～10周含量稍有升高，然后一直到成熟采收呈下降趨勢，成熟時果實可滴定酸含量為0.49%。露地果實可滴定酸含量從盛花后第5周開始呈上升趨勢，到盛花后第6周可滴定酸含量達到最高值(1.00%)，然后一直下降直到成熟采收，成熟時果實可滴定酸含量為0.27%。通過顯著性分析可知，盛花后第6周之前，設(shè)施內(nèi)桃果實可滴定酸含量顯著低于露地，盛花后第7～12周，設(shè)施內(nèi)桃果實可滴定酸含量均顯著高于露地桃果實。

不同小寫字母表示同一時期設(shè)施內(nèi)外差異顯著(P<0.05)，下同

2.2 設(shè)施內(nèi)外桃果實有機酸含量的變化

2.2.1 蘋果酸含量 設(shè)施內(nèi)桃果實蘋果酸含量呈先升高再降低的趨勢，在盛花后第6周達到最大值，為1.62 g/L，然后到盛花后第8周蘋果酸含量基本平穩(wěn)，從盛花后第9周開始蘋果酸含量急速下降，到成熟時設(shè)施內(nèi)桃果實蘋果酸含量為0.73 g/L。露地桃果實蘋果酸含量呈先升高后下降再升高的趨勢，到盛花后第6周達到最高值(0.95 g/L)，然后開始下降，到盛花后第9周下降到最低值(0.16 g/L)，之后到盛花后第12周蘋果酸含量一直升高，到成熟采收時為0.56 g/L。整個生長發(fā)育過程中設(shè)施內(nèi)桃果實蘋果酸含量一直顯著高于露地桃果實(圖2A)。

2.2.2 檸檬酸含量 設(shè)施內(nèi)和露地桃果實檸檬酸含量均呈先升高后降低的變化趨勢。設(shè)施內(nèi)桃果實檸檬酸含量在盛花后第5周開始呈上升趨勢，第9周達到最大值(0.59 g/L)，經(jīng)過2周的平穩(wěn)期后開始迅速下降，到盛花后第12周下降到0.37 g/L。露地桃果實檸檬酸含量于盛花后第5周開始升高，盛花后第7周升高到最大值(0.65 g/L)，之后檸檬酸含量顯著降低，盛花后第12周達到最低值(0.15 g/L)。果實發(fā)育過程中，盛花后第5～8周桃果實檸檬酸含量均為露地顯著高于設(shè)施內(nèi)，盛花后第9～12周均為設(shè)施內(nèi)桃果實檸檬酸含量顯著高于露地桃果實(圖2B)。

2.2.3 奎寧酸和莽草酸含量 設(shè)施內(nèi)外桃果實奎寧酸含量總體呈先升高后降低的趨勢(圖2C)。設(shè)施內(nèi)桃果實奎寧酸含量在盛花后第5～8周緩慢升高，第8周達到最大值(1.79 g/L)，后期顯著降低，盛花后第12周桃果實中奎寧酸含量達到最小值(0.34 g/L)。露地桃果實奎寧酸含量在盛花后第5～7周變化較平穩(wěn)，盛花后第7周桃果實奎寧酸含量開始顯著降低，盛花后第9周下降到0.31 g/L，后期變化緩慢。果實發(fā)育過程中，盛花后第8周之后設(shè)施內(nèi)桃果實奎寧酸含量均顯著高于露地桃果實。

設(shè)施內(nèi)外桃果實莽草酸含量整體呈下降趨勢。設(shè)施內(nèi)桃果實莽草酸含量由盛花后第5周(0.066 g/L)開始下降，盛花后第12周，果實莽草酸含量為0.024 g/L。露地桃果實中莽草酸含量在盛花后第5周開始降低，到盛花后第9周下降到最低值(0.016 g/L)，盛花后第10周開始到果實成熟采收，莽草酸含量略有升高，但差異不顯著。在整個桃果實生長發(fā)育期，設(shè)施內(nèi)桃果實中莽草酸含量均顯著高于露地桃(圖2D)。

圖2 設(shè)施內(nèi)外桃果實有機酸含量的變化Fig.2 Changes of organic acid content inside and outside the greenhouse

2.2.4 設(shè)施內(nèi)外桃成熟果實中各酸組分所占比例 由表1可知，設(shè)施內(nèi)外桃果實成熟時，蘋果酸所占比例最高，分別為49.62%和56.47%，說明春美桃是蘋果酸型果實。設(shè)施內(nèi)成熟桃果實檸檬酸含量所占比例高于露地桃，同時也高于設(shè)施內(nèi)桃奎寧酸所占比例，而露地桃果實奎寧酸所占比例高于檸檬酸。設(shè)施內(nèi)外成熟桃果實莽草酸所占比例均較低。

表1 設(shè)施內(nèi)外桃成熟果實中各酸組分所占比例Tab.1 The proportion of acid components in the mature peach fruit inside and outside the greenhouse %

2.3 設(shè)施內(nèi)外桃果實檸檬酸代謝相關(guān)酶活性的變化

設(shè)施內(nèi)桃果實PEPC活性在盛花后第11周之前總體呈上升趨勢，第11周達到最大值，為42.37 U/(g·min)，在果實成熟采收時降至最低；露地桃果實PEPC活性在盛花后第6周達到最高值[30.59 U/(g·min)]，然后急劇下降至盛花后第7周，此時設(shè)施內(nèi)外桃果實PEPC活性差異不顯著，盛花后第7周至果實采收時PEPC活性變化幅度不大。設(shè)施內(nèi)外桃果實PEPC活性差異比較表明，整個生長發(fā)育過程中除盛花后第5、7、12周外，設(shè)施內(nèi)桃果實PEPC活性均顯著高于設(shè)施外桃果實(圖3A)。

設(shè)施內(nèi)桃果實CS活性呈雙峰變化的趨勢(圖3B)，首個高峰出現(xiàn)在盛花后第8周，峰值為3.58 U/(g·min)，此時桃果實CS活性顯著高于露地桃果實，第8周后迅速降低，到盛花后第10周達到第2個峰值，為2.64 U/(g·min)，此時桃果實CS活性顯著高于露地桃果實。露地桃果實CS活性整體呈先升高后降低的趨勢，盛花后第6周達到最高值[2.49 U/(g·min)]，后期緩慢降低，盛花后第11周CS活性達到最低值，為0.39 U/(g·min)，顯著低于設(shè)施內(nèi)桃果實。

設(shè)施內(nèi)外桃果實NAD-IDH活性均呈先上升后降低的趨勢，且均在盛花后第8周達到最大值，分別為1.00、0.97 U/(g·min)，差異不顯著，第8周前設(shè)施內(nèi)外NAD-IDH活性雖有變化，但變化幅度較小，設(shè)施內(nèi)NAD-IDH活性顯著高于露地桃果實，第8周后設(shè)施內(nèi)外桃果實中NAD-IDH活性均顯著降低，但設(shè)施內(nèi)外差異不顯著(圖3C)。

設(shè)施內(nèi)外桃果實Cyt-ACO活性在整個生長期均呈先下降后升高再下降的變化趨勢。盛花后第5～7周設(shè)施內(nèi)外果實Cyt-ACO活性均有小幅度下降，但設(shè)施內(nèi)外差異不顯著，第7周后設(shè)施內(nèi)外桃果實Cyt-ACO活性呈上升趨勢，盛花后第9周達到最大值，分別為0.81、1.47 U/(g·min)。此時設(shè)施內(nèi)桃果實Cyt-ACO活性顯著低于露地桃果實，第9周后設(shè)施內(nèi)外桃果實中Cyt-ACO活性均呈下降趨勢，且設(shè)施內(nèi)桃果實中Cyt-ACO活性高于露地桃果實(圖3D)。

圖3 設(shè)施內(nèi)外桃果實檸檬酸代謝相關(guān)酶活性的變化Fig.3 Changes of emzyme activities of citric acid inside and outside the greenhouse

2.4 設(shè)施內(nèi)外桃果實檸檬酸含量與代謝相關(guān)酶活性間相關(guān)性分析

由表2可知，設(shè)施內(nèi)桃果實檸檬酸含量與PEPC和CS活性呈正相關(guān)，其中，與PEPC活性呈顯著正相關(guān)(r=0.690*)，與NAD-IDH和Cyt-ACO活性呈負相關(guān)，其中，與NAD-IDH活性呈極顯著負相關(guān)(r=-0.820**)，表明設(shè)施內(nèi)桃果實中PEPC活性升高可以促進檸檬酸的積累；露地桃果實中檸檬酸含量與PEPC和CS活性呈正相關(guān)，與NAD-IDH和Cyt-ACO活性呈負相關(guān)，但均未達到顯著水平。

表2 檸檬酸含量與代謝相關(guān)酶活性間相關(guān)性分析Tab.2 Analysis of correlation between the content of citric acid and the metabolism enzyme activities

注:*、**分別表示0.05、0.01相關(guān)水平。

Note: * and ** mean significant at 0.05 and 0.01 levels.

3 結(jié)論與討論

對楊梅[18]、柑橘[19]等的研究結(jié)果表明，設(shè)施栽培對果實品質(zhì)有重要的影響，設(shè)施內(nèi)外果實中酸含量有差異，從而影響了果實的風(fēng)味形成。本研究以春美桃為試材，結(jié)果表明，設(shè)施內(nèi)外桃可滴定酸含量變化趨勢相同，設(shè)施內(nèi)早期(盛花后第6周前)果實中可滴定酸含量低于露地果實，后期高于露地果實，到采收時可滴定酸含量高于露地果實。關(guān)于設(shè)施內(nèi)外不同環(huán)境對果實有機酸含量影響的原因，錢皆兵等[20]認為，設(shè)施內(nèi)外土壤理化性質(zhì)不同，設(shè)施內(nèi)土壤的全鹽量明顯高于露地土壤，氮、磷、鉀含量比露地略有升高，因此設(shè)施內(nèi)外果實有機酸含量不同。趙雪惠等[21]研究表明，對設(shè)施內(nèi)的油桃補充藍光降低了油桃有機酸含量。馬凱等[22]研究表明，設(shè)施內(nèi)通過人工加富CO2可以提高果實品質(zhì)。

果實中的有機酸含量是果實風(fēng)味品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，不同種類果實有機酸組成及其含量存在顯著差異。在本試驗中發(fā)現(xiàn)，設(shè)施內(nèi)外春美桃果實有機酸組分有蘋果酸、檸檬酸、莽草酸和奎寧酸，其中蘋果酸含量分別占有機酸含量的49.62%和56.47%，是春美桃果實的主要有機酸。但果實成熟時設(shè)施內(nèi)春美桃果實檸檬酸所占比例明顯升高，設(shè)施內(nèi)外總酸含量相差0.47 g/L，其中，蘋果酸含量的差異占總差異的34.94%，檸檬酸含量的差異占總差異的47.67%，說明設(shè)施內(nèi)外檸檬酸含量的差異是造成果實成熟時酸味差異的主要原因。本研究還發(fā)現(xiàn)，桃果實檸檬酸含量整體呈先升高后降低的趨勢，果實發(fā)育前期露地果實檸檬酸含量顯著高于設(shè)施內(nèi)果實，果實發(fā)育后期露地果實檸檬酸含量顯著低于設(shè)施內(nèi)。果實有機酸含量的高低由果實生長發(fā)育過程中有機酸合成和降解共同決定[23-24]。有研究表明，在胞質(zhì)中PEPC催化磷酸烯醇式丙酮酸β-羧化生成OAA，OAA在MDH作用下產(chǎn)生蘋果酸。OAA和蘋果酸進入三羧酸循環(huán)(TCA)生成檸檬酸和其他代謝產(chǎn)物[25]。本研究結(jié)果表明，整個生長發(fā)育過程中設(shè)施內(nèi)桃果實PEPC活性顯著高于露地果實。相關(guān)性分析表明，設(shè)施內(nèi)PEPC活性與檸檬酸含量存在顯著正相關(guān)關(guān)系，設(shè)施外PEPC活性與檸檬酸含量存在正相關(guān)關(guān)系，但不顯著，說明PEPC活性對設(shè)施內(nèi)檸檬酸含量的影響大于露地。此結(jié)果與MOING等[26]的PEPC有效促進了桃發(fā)育過程中有機酸的合成和積累的研究結(jié)果相符。相關(guān)性分析還表明，設(shè)施內(nèi)外桃果實CS活性與檸檬酸含量呈正相關(guān)關(guān)系，但均不顯著，NAD-IDH和Cyt-ACO活性與檸檬酸含量呈負相關(guān)關(guān)系，其中設(shè)施內(nèi)桃果實NAD-IDH活性與檸檬酸含量呈顯著負相關(guān)關(guān)系，其余相關(guān)性不顯著，說明PEPC和CS促進檸檬酸的積累，而NAD-IDH和Cyt-ACO促進檸檬酸的降解，這與前人在棗[27]、果梅[28]、山葡萄[29]上的研究結(jié)果一致。果實發(fā)育前期，設(shè)施內(nèi)桃果實NAD-IDH活性顯著高于露地果實，導(dǎo)致設(shè)施內(nèi)桃果實檸檬酸降解速度大于露地果實，從而使設(shè)施內(nèi)桃果實檸檬酸含量顯著低于露地果實。果實發(fā)育后期，設(shè)施內(nèi)桃果實PEPC和CS活性顯著高于露地，而NAD-IDH活性僅在盛花后第10周差異顯著，致使設(shè)施內(nèi)檸檬酸合成量高于露地，從而使設(shè)施內(nèi)桃果實檸檬酸含量顯著高于露地桃果實，說明桃果實發(fā)育前期NAD-IDH活性對檸檬酸含量的調(diào)控作用較大，而果實發(fā)育后期PEPC和CS活性對檸檬酸含量調(diào)控作用較大。

綜上所述，春美桃果實為蘋果酸型果實，但成熟期設(shè)施內(nèi)外桃果實有機酸含量的差異主要由檸檬酸引起，設(shè)施內(nèi)桃果實PEPC活性和果實發(fā)育后期CS活性較高是導(dǎo)致設(shè)施內(nèi)桃果實酸性較高的主要原因。