不同磷源在紅霉素工程菌發(fā)酵過程中的作用研究

丁彥琴 伍涵宇 牛春 張萍

摘要：通過向紅霉素種子液和發(fā)酵培養(yǎng)基中添加磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀，探討2種磷源對紅霉素培養(yǎng)發(fā)酵過程中的pH、菌體濃度及效價(jià)的影響，以及進(jìn)一步優(yōu)化得到最佳的培養(yǎng)基組分配比。結(jié)果表明，與原始工藝相比，向紅霉素發(fā)酵液中增添適量的磷酸氫二鉀作為無機(jī)磷源能增加紅霉素的產(chǎn)量，使發(fā)酵搖瓶中紅霉素效價(jià)提高了20%，達(dá)到7 560 U/mL;采用正交法對發(fā)酵液培養(yǎng)基中的淀粉、糊精、磷酸氫二鉀和黃豆餅粉進(jìn)行了相應(yīng)的優(yōu)化，效價(jià)升高至7 910 U/mL，較未優(yōu)化提高4.6%，較未加入磷酸氫二鉀發(fā)酵液提高了25.7%。

關(guān)鍵詞：紅色糖多孢菌;紅霉素;發(fā)酵培養(yǎng)基;磷酸氫二鉀;磷酸二氫鉀

中圖分類號：R978.1+5? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? ? ? ? 文章編號：1007-273X（2020）12-0005-03

紅霉素是臨床上被廣泛用于治療革蘭氏陽性菌感染的十四元大環(huán)內(nèi)酯類廣譜抗生素，最早是在1952年從土壤中的紅色糖多孢菌（Saccharopolyspora erythraea）中分離得到的次級代謝產(chǎn)物，隨后紅色糖多孢菌也成為工業(yè)上主要生產(chǎn)紅霉素的放線菌[1]。紅霉素的結(jié)構(gòu)主要由3部分組成，一個(gè)十四元的大環(huán)即紅霉內(nèi)酯、紅霉糖和德安糖，彼此通過O-糖苷鍵連接。在紅色糖多孢菌的發(fā)酵液中，主要產(chǎn)物是紅霉素A，除此之外還有紅霉素B、紅霉素 C、紅霉素D和少量的紅霉素E、紅霉素F等副產(chǎn)物。其中紅霉素A的抗菌活性最好，紅霉素B的生物活性是紅霉素A的0.15～0.20倍，而毒性則是其毒性的2倍，紅霉素E和紅霉素F的生物活性也只有紅霉素A的0.100～0.125倍[2，3]。以紅霉素A為前體合成的第二、三代紅霉素衍生物己被廣泛應(yīng)用于臨床，主要用于治療革蘭氏陽性細(xì)菌的感染[4]。目前國內(nèi)生產(chǎn)的紅霉素產(chǎn)量普遍偏低，據(jù)有關(guān)報(bào)道，國外的紅霉素發(fā)酵生產(chǎn)水平已達(dá)8 000～12 000 U/mL，而國內(nèi)的發(fā)酵水平一般在4 000～5 000 U/mL[5]。因此，對于紅霉素發(fā)酵水平效價(jià)提高的研究迫在眉睫。

微生物在生長繁殖過程中需要碳源、氮源、磷源、生長因子、無機(jī)鹽、水分6大營養(yǎng)物質(zhì)，其中磷是抗生素發(fā)酵培養(yǎng)基中的重要營養(yǎng)來源，對抗生素菌體生長和抗生素的合成有很大的影響。不同種類的磷源對抗生素的產(chǎn)量有密切關(guān)系[6]。發(fā)酵培養(yǎng)基中磷的來源可以分為有機(jī)磷源和無機(jī)磷源，有機(jī)磷源主要是黃豆餅粉、玉米漿等，無機(jī)磷源主要是磷酸鹽的化合物。發(fā)酵前期菌絲的生長和發(fā)酵單位的增長主要依靠無機(jī)磷的作用，而發(fā)酵后期促進(jìn)菌體合成產(chǎn)物主要依靠有機(jī)磷的幫助。培養(yǎng)基中增加無機(jī)磷的配比可以提高菌體的代謝速度、促進(jìn)發(fā)酵液含固量增長，如磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀等。目前紅色糖多孢菌發(fā)酵培養(yǎng)過程的培養(yǎng)基主要組成成分是淀粉、黃豆餅粉、糊精和葡萄糖，組分中缺少無機(jī)磷源的供給?？紤]到磷調(diào)控在次級代謝產(chǎn)物合成過程中的作用，本研究通過增加磷源物質(zhì)磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀，調(diào)節(jié)兩者的比例，使其達(dá)到合適的濃度，保證發(fā)酵液中的無機(jī)磷源含量，給菌體提供合適的磷源。

1? 材料與方法

1.1? 菌株

紅色糖多孢菌SPH001，寧夏泰瑞制藥股份有限公司實(shí)驗(yàn)室保存的工程菌株。

1.2? 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：淀粉15 g/L，氯化鈉4 g/L，硫酸銨3 g/L，碳酸鈣3 g/L，玉米漿12 g/L，瓊脂粉2.5 g/L，pH 6.95～7.05。

種子培養(yǎng)基：蔗糖35 g/L，硫酸銨4 g/L，玉米漿20 g/L，碳酸鈣5.6 g/L，pH 6.45～6.65。

發(fā)酵培養(yǎng)基：淀粉25 g/L，黃豆餅粉30 g/L，糊精35 g/L，硫酸銨0.24 g/L，葡萄糖20 g/L，碳酸鈣5 g/L，豆油8 g/L，pH自然。

1.3? 儀器

高效液相色譜儀，島津企業(yè)管理（中國）有限公司;722分光光度計(jì)，島津企業(yè)管理（中國）有限公司;電子分析天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;高速離心機(jī)，深圳天溯計(jì)量檢測股份有限公司;pH計(jì)，PHS-25型，上海儀分科學(xué)儀器有限公司。

1.4 培養(yǎng)方法

斜面孢子培養(yǎng)：用鏟子刮取原始菌株的孢子，蒸餾水稀釋后，取200 μL均勻涂至茄瓶斜面上，置于溫度33～35 ℃，相對濕度30%～50%培養(yǎng)6～7 d，4 ℃保存使用。

種子培養(yǎng)：取出保存的茄瓶斜面，鏟取1 cm×1 cm大小的斜面孢子接入30 mL的種子培養(yǎng)基中，置于搖瓶機(jī)上培養(yǎng)42～43 h，培養(yǎng)溫度為30～33 ℃，相對濕度30%～50%，搖瓶機(jī)轉(zhuǎn)速為220 r/min。

發(fā)酵培養(yǎng)：取培養(yǎng)好的種子液1 mL轉(zhuǎn)入30 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于搖瓶機(jī)上培養(yǎng)144～168 h，培養(yǎng)溫度為30～33 ℃，相對濕度30%～50%，搖瓶機(jī)轉(zhuǎn)速為220 r/min。

1.5? 分析方法

pH的測定：發(fā)酵培養(yǎng)一定周期后，使用pH計(jì)對發(fā)酵液的pH進(jìn)行檢測。

菌濃的測定：取10 mL離心管稱管重，再稱取發(fā)酵培養(yǎng)液10 g于10 mL的離心管中，5 000 r/min離心10 min，倒掉上清烘干并稱量沉淀的重量，菌體濃度=（沉淀重量-管重）×100%。

化學(xué)效價(jià)的測定：采用硫酸水解法進(jìn)行測定，取培養(yǎng)好的發(fā)酵液10 mL離心，吸取1 mL上清液至9 mL K2CO3溶液及10 mL乙酸丁酯的比色管中，密塞搖瓶30 s后靜止至分層，吸取5 mL乙酸丁酯相加入至含有10 mL 0.1 mol HCl的分液漏斗中，密塞振搖30 s后靜止至分層，吸取5 mL下層溶液沿管壁加入至含有3 mL濃硫酸的干燥試管中，緩慢晃動(dòng)試管至顯色后再加力搖勻，放置冷卻至室溫，紫外分光光度計(jì)于498 nm處檢測液體的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算溶液的化學(xué)效價(jià)。

各組分的測定：發(fā)酵液離心取上清，加入甲醇5倍稀釋后，5 000 r/min離心10 min，取上清液使用高效液相色譜儀進(jìn)行檢測。色譜條件為：Waters XBridge^TM C18（250 mm×6 mm，5 μm）色譜柱，流動(dòng)相為甲醇-乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（pH 7.00，35∶30∶35），流速為1.0 mL/min，檢測波長為498 nm，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量為40 μL。根據(jù)各組分的峰面積值計(jì)算其效價(jià)。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 添加磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀對種子液的影響

種子培養(yǎng)基中分別添加濃度為4、8、10、12、14 g/L的磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀，配方比例見表1，種子液培養(yǎng)42 h后，檢測其pH和菌體濃度，結(jié)果如圖1所示，2種磷源濃度在4～14 g/L對種子液的pH不會(huì)產(chǎn)生太大影響，但是菌體濃度卻有所改變。當(dāng)磷酸氫二鉀濃度為4 g/L和8 g/L，菌體濃度明顯升高，表明在種子培養(yǎng)基中加入適當(dāng)濃度磷酸氫二鉀能促進(jìn)菌體代謝。

2.2? 添加磷酸氫二鉀和磷酸氫二鉀對發(fā)酵液的影響

為了進(jìn)一步驗(yàn)證2種磷源對紅霉素工程菌發(fā)酵過程的影響，將磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀以4、8、10、12、14 g/L的配比添加在紅霉素發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行單因素試驗(yàn)考察，配方比例見表2。每種配方做3個(gè)平行試驗(yàn)，對發(fā)酵液進(jìn)行pH、菌體濃度和效價(jià)的檢測取平均值，結(jié)果見圖2。由圖2可知，發(fā)酵液中添加磷酸氫二鉀配比為4 g/L和8 g/L時(shí)，能明顯提高菌體濃度，搖瓶效價(jià)亦從6 293 U/mL升高至7 560 U/mL。而添加磷酸二氫鉀為4 g/L時(shí)發(fā)酵液菌體濃度和效價(jià)沒有明顯改變，為8 g/L時(shí)菌體濃度和效價(jià)開始下降。當(dāng)繼續(xù)增大2種磷源濃度時(shí)，菌體濃度逐漸呈現(xiàn)下降趨勢，效價(jià)也隨之下降。由于無機(jī)磷能增加菌體代謝速度，促進(jìn)菌體生長，使得添加少量的無機(jī)磷源發(fā)酵單位也隨之增長。但是磷源過高會(huì)使氮磷比例失衡，打破菌體的代謝平衡，導(dǎo)致菌體代謝緩慢，發(fā)酵單位也隨之下降。磷酸二氫鉀溶解使發(fā)酵液呈酸性，而酸性條件不利于紅霉素菌體的代謝生長，故使得搖瓶發(fā)酵產(chǎn)生紅霉素的量愈來愈低。

2.3? 含磷源培養(yǎng)基配比的確定

根據(jù)單因素試驗(yàn)對培養(yǎng)基中添加磷源所進(jìn)行的研究，最終確定在發(fā)酵液培養(yǎng)基中添加4～8 g/L的磷酸氫二鉀。進(jìn)一步考察淀粉、黃豆餅粉、糊精和磷酸氫二鉀的最優(yōu)配比。得到一個(gè)合適的發(fā)酵液培養(yǎng)基配方，各因素水平見表3。采用L9（34）進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定最優(yōu)培養(yǎng)基配比，結(jié)果見表4。由表4可知，馬鈴薯淀粉、黃豆餅粉、糊精和磷酸氫二鉀4種因素對發(fā)酵水平的影響程度排序?yàn)锳>D>B>C，其中最優(yōu)的培養(yǎng)基搭配方式為A3B3C2D1，即淀粉30 g/L、黃豆餅粉30 g/L、糊精30 g/L、磷酸氫二鉀8 g/L。

3? 討論

本試驗(yàn)探討了2種無機(jī)磷源（磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀）對紅色糖多孢菌培養(yǎng)過程產(chǎn)生紅霉素的影響，發(fā)現(xiàn)添加適當(dāng)濃度磷酸氫二鉀對紅色糖多孢菌的生長可產(chǎn)生促進(jìn)作用，當(dāng)磷酸氫二鉀濃度為8 g/L，種子液和發(fā)酵液中菌體濃度都會(huì)明顯升高，效價(jià)也相應(yīng)提高至7 560 U/mL，當(dāng)濃度不斷增大至10、12、14 g/L時(shí)，菌種的生長受到抑制，代謝減弱，菌體濃度下降，效價(jià)降低。由此可知，培養(yǎng)基中添加適當(dāng)濃度磷酸氫二鉀在紅霉素的發(fā)酵過程中發(fā)揮著重要的作用。

為了使培養(yǎng)基中碳源、氮源和磷源的搭配達(dá)到一個(gè)合適的配比，本試驗(yàn)進(jìn)一步采用正交法對發(fā)酵液的培養(yǎng)基進(jìn)行了相應(yīng)的優(yōu)化。結(jié)果表明，淀粉、糊精和黃豆餅粉對紅霉素的效價(jià)有顯著性影響[7]，淀粉和糊精作為速效碳源，易被菌體利用，促進(jìn)菌體的生長代謝[8]，黃豆餅粉是抗生素發(fā)酵工業(yè)中主要的有機(jī)氮源，特別是在紅霉素發(fā)酵過程中扮演著十分重要的角色[9]，在發(fā)酵前期，黃豆餅粉可以作為菌體生長所需的碳骨架[10]，在發(fā)酵中后期，它可以提供菌體所需的氨基酸。因此，在發(fā)酵液培養(yǎng)基組成中，重點(diǎn)優(yōu)化了淀粉、黃豆餅粉、糊精以及磷酸氫二鉀4種發(fā)酵液組分，結(jié)果表明，淀粉對紅霉素效價(jià)的影響最大，其次是糊精、磷酸氫二鉀和黃豆餅粉，當(dāng)4種組分的搭配比例分別為30、30、30、8 g/L時(shí)效價(jià)提高至7 910 U/mL，較未優(yōu)化時(shí)提高4.6%。

綜上所述，8 g/L的磷酸氫二鉀能提高紅色糖多孢菌產(chǎn)紅霉素的效價(jià)，同時(shí)在發(fā)酵液的主要影響組分達(dá)到合適配比的情況下，效價(jià)亦得到提高，為進(jìn)一步研究紅霉素培養(yǎng)基組成優(yōu)化奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] LI Y Y， CHANG X， YU W B， et al. Systems perspectives on erythromycin biosynthesis by comparative genomic and transcriptomic analyses of S.erythraea E3 and NRRL2338 strains[J]. BMC Genomics， 2013， 14（1）： 1-13.

[2] DEUBEL A， HOLZGRABE U. Development of an enhanced separation of erythromycin and its related substances by liquid chromatography[J]. Journal of pharmaceutical and biomedical analysis， 2007， 43（2）： 493-498.

[3] MIRONOV V A， SERGIENKO O V， NASTASYAK I N， et al. Biogenesis and regulation of biosynthesis of? erythromycins? in? Saccharopolyspora? erythraea[J]. Applied? biochemistry? and microbiology， 2004， 40（6）： 531-541.

[4] HOYT J C， ROBBINS R A. Macrolide antibiotics and pulmonary inflammation[J]. Fems microbiology letters，2001， 205（1）： 1-7.

[5] 張? 倫.紅霉素市場現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢[J].中國藥房，2003（12）：9-11.

[6] 賈志偉.不同磷源在抗生素發(fā)酵中的應(yīng)用[J].科技風(fēng)，2013（4）：116.

[7] 張? 萍，師文飛，黃文福，等.氮源、碳源影響紅色糖多孢菌發(fā)酵的研究[J].中國獸藥雜志，2018，52（4）：37-45.

[8] 王智慧. 紅霉素發(fā)酵工藝優(yōu)化研究[D].鄭州：鄭州大學(xué)，2014.

[9] HAMEDI J，MALEKZADEH F，SAGHAFI-NIA A E，et al. Enhancing of erythromycin production by saccharopolysporaerythraea with common and uncommon oils[J]. J Ind Microbiol Biot，2004，31（10）：447-456.

[10] 莊英萍，儲(chǔ)? 炬，張嗣良，等.紅霉素發(fā)酵過程前期參數(shù)相關(guān)分析及調(diào)控[J].華東理工大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，30（6）：636-639.