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    1 株圓環(huán)病毒3 型美國毒株全基因組克隆與遺傳演化分析

    2022-01-13 06:29:10郝桂英陳瑛琪陳孝宇
    中國動物檢疫 2022年1期
    關(guān)鍵詞:核苷酸毒株基因組

    鄭 晶,郝桂英,謝 禮,安 微,楊 苗,陳瑛琪,張 婧,鄭 巧,陳 溪,陳孝宇,林 華

    (1.成都海關(guān)技術(shù)中心,四川省食品安全檢測重點實驗室,四川成都 610041;2.西昌學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院,四川西昌 615013;3.大連海關(guān)技術(shù)中心,遼寧大連 116014;4.武漢海關(guān)技術(shù)中心,湖北武漢 430010)

    豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus,PCV)是一種小型、無囊膜、單股負(fù)鏈環(huán)狀DNA 病毒[1],屬于圓環(huán)病毒科、圓環(huán)病毒屬[2],是已知最小的病毒之一。該病毒能在豬和其他動物中引起廣泛疾病[3-4]。目前在已有報道中,根據(jù)抗原性和基因型的不同,其可分為PCV1[5]、PCV2[6]、PCV3[7]和PCV4[8]3 個血清型。PCV3 可引起豬的皮炎腎病綜合征、繁殖障礙以及心臟和多系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)。PCV3 感染后,患病母豬受孕率降低,流產(chǎn)率增加,可出現(xiàn)產(chǎn)死胎或木乃伊胎現(xiàn)象;患病仔豬出現(xiàn)多器官系統(tǒng)功能紊亂[9]。2016 年美國首次報道發(fā)現(xiàn)PCV3,隨后波蘭[10]、韓國[11]、中國[12]及意大利[13]等國家也相繼報道。PCV3 在世界范圍內(nèi)迅速擴散,引起了各國高度重視和密切關(guān)注。

    PCV3 全基因組長度約2 000 bp,包含11 個可能的開放閱讀框(ORF1—ORF11)。其中有3 個主要的開放閱讀框:ORF1 編碼由297 個氨基酸(aa)組成的復(fù)制酶蛋白Rep,ORF2 編碼由214 個aa 組成的衣殼蛋白Cap,ORF3 編碼由231 個aa 組成的功能未知蛋白質(zhì)[7]。目前,國際上尚無普遍公認(rèn)的PCV3 亞型分類規(guī)則。大部分學(xué)者根據(jù)基因組DNA全長序列差異,將PCV3分為兩個亞型(PCV3a和PCV3b)[14];也有學(xué)者根據(jù)Cap 蛋白存在的兩個氨基酸突變(A24V 和R27K)不同,將PCV3分為3 個亞型(PCV3a、PCV3b 和PCV3c)[15-16]。根據(jù)現(xiàn)有流行病學(xué)報道,中國[17]、印度[18]、越南[19]、泰國[20]及美國[14]等主要流行PCV3a、PCV3b 兩個亞型,其他國家或地區(qū)對PCV3 不同亞型的流行情況鮮有報道。本研究通過對染病的美國種豬采集組織樣品進行多種病原核酸擴增,確認(rèn)病料組織PCV3 陽性,然后擴增PCV3 全基因組,并將其與GenBank 上不同地區(qū)PCV3 參考毒株全基因組序列進行遺傳進化比對分析,根據(jù)基因組差異進行分型,以期了解該序列與不同地區(qū)PCV3 毒株的遺傳進化關(guān)系,為PCV3 分子流行病學(xué)研究及防控提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    1.1.1 樣品 2021 年4 月,四川省某企業(yè)進口美國種豬中發(fā)現(xiàn)疑似染疫豬,臨床表現(xiàn)為進行性消瘦、呼吸困難、皮膚蒼白。對死亡豬采集肺臟、脾臟、淋巴結(jié)及小腸等組織樣品,放置于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.1.2 主要試劑 MagMAXTMCORE NucleicAcid Purification Kit 核酸提取試劑盒,購自賽默飛世爾科技公司;2×HotStartTaqplus Master Mix(Quick Load)、ddH2O,購自近岸蛋白質(zhì)科技有限公司;大腸桿菌DH5α、pMD18-T 載體、DL5 000 DNA Marker、DNA 膠回收試劑盒,購自寶生物工程(大連)有限公司;氨芐青霉素(ampicillin)、Trans2K DNA Marker、6×loading buffer,購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;胰蛋白胨(tryptone)和酵母提取物(Yeast Extract),購自英國Oxoid公司;氯化鈉、氫氧化鈉、瓊脂糖(agarose),購自西班牙BIOWEST 公司。

    1.1.3 引物設(shè)計與合成 參考GenBank 中收錄的PCV3 美國株(GenBank 登錄號:MK496297.1)全基因組序列,分別設(shè)計合成用于擴增PCV3 全基因組的2 對引物(表1)。引物由擎科生物(成都)科技有限公司合成。

    表1 引物序列

    1.2 樣品處理及RNA/DNA 提取

    無菌條件下將采集的病死豬肺臟、脾臟、淋巴結(jié)等組織研磨攪碎,按照MagMAXTMCORE NucleicAcid Purification Kit 核酸提取試劑盒說明書,從病料組織中提取基因組。

    1.3 病原檢測

    按照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[21-30]對病死豬組織分別進行豬細(xì)小病毒(PPV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬Delta 冠狀病毒(PDCoV)、塞內(nèi)卡病毒(SVV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬勞森氏胞內(nèi)菌(PPE)、豬支原體肺炎(M.HYO)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、PCV2及PCV3檢測。

    1.4 PCV3 基因組擴增

    以檢出PCV3 陽性的組織DNA 為模板,用已設(shè)計的2 對引物分別進行PCV3 基因組序列擴增。反應(yīng)體系為25.0 μL:2×TaqMaster Mix 12.5 μL、模板DNA 2.0 μL、上游引物1.0 μL、下游引物1.0 μL、ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)條件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 90 s,28 個循環(huán);72 ℃延伸5 min。取5.0 μL 擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳,觀察結(jié)果。

    使用DNA 回收試劑盒對與預(yù)期大小相符的2條片段進行膠回收,并分別與pMD18-T 載體4 ℃連接過夜;連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞,取100 μL 均勻涂布至含有氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)12~16 h;挑選單個陽性克隆菌落接種于含氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基,37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h,進行菌液PCR 鑒定。

    1.5 PCV3 全基因組核苷酸序列比對與遺傳進化分析

    使用質(zhì)粒提取試劑盒對陽性克隆菌液提取質(zhì)粒,將酶切(EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ)正確的重組質(zhì)粒送擎科生物(成都)科技有限公司測序;對擴增產(chǎn)物大小約1 200 和1 100 bp 的核苷酸序列進行拼接,獲得PCV3 全基因組序列,并與國內(nèi)外38 個PCV3 參考毒株(表2)通過BLAST 在線進行核苷酸同源性比對;同時,用生物信息學(xué)軟件進行遺傳進化分析,采用Neighbor-Joining(NJ)法(1 000 次重復(fù)bootstrap 分析)生成系統(tǒng)進化樹。

    表2 PCV3 參考毒株全基因組序列信息

    1.6 PCV3 毒株ORF1、ORF2 核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列分析

    用生物信息學(xué)軟件分別將獲得的美國毒株P(guān)CV3 ORF1 和ORF2 基因序列及推導(dǎo)的氨基酸序列與國內(nèi)外38 個毒株進行比對分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 病原檢測

    對病死豬組織分別進行PPV等9種病原檢測,結(jié)果顯示,僅檢出PCV3 陽性。

    2.2 PCV3 全基因組擴增

    將PCV3 全基因組擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,分別在約1 200 和1 100 bp 處出現(xiàn)擴增條帶,其大小與預(yù)期基本相符(圖1)。通過測序拼接后,獲得全長約為2 000 bp 的PCV3 全基因組序列。

    2.3 PCV3 毒株全基因組核苷酸序列比對與遺傳進化分析

    將獲得的PCV3 美國毒株命名為PCV3_USA2021(Genbank 登錄號:OL799306)。其與國內(nèi)外38 個毒株核苷酸同源性和遺傳進化分析結(jié)果顯示,PCV3_USA2021 全基因組核苷酸序列與38 個參考毒株序列同源性為98.7%~99.8%,其中,PCV3_USA2021 與美國毒株(PCV3-US_SD2016)、巴西毒株(255_18_42)、中國重慶毒株(PCV3_CN_Chongqing-147_2016)、中國吉林毒株(PCV3-China_JL17-42)、中國山東毒株(PCV3_Shandong-03_2016)、中國廣西毒株(PCV3/Guangxi-GL/04)等6 個毒株全基因組序列同源性最高,與俄羅斯毒株(PCV3-RU/SM17)和中國安徽毒株(PCV3/CN/Anhui-14/201611)同源性最低。

    遺傳進化關(guān)系分析結(jié)果(圖2)顯示,PCV3_USA2021 毒株與美國毒株(PCV3-US_SD2016)形成一個小的分支,與中國云南毒株(YN1-2017)、中國吉林毒株(PCV3-China_JL17-42)、中國山東毒株(PCV3_Shandong-03_2016)、中國重慶毒株(PCV3_CN_Chongqing-147_2016)、中國江西毒株(PCV3_CN_Jiangxi-62_2016)、中國廣西毒株(PCV3/Guangxi-GL/04)、哥倫比亞毒株(PCV3_COL_Risaralda1_2018)、巴西毒株(255_18_42)、智利毒株(Type 3)、美國毒株(99)、日本毒株(KGS2098-1_2016 DNA)、韓國毒株(PCV3_KU-1605)等均處于一個大分支上,屬于PCV3a亞群。

    2.4 PCV3 毒株ORF1 基因核苷酸序列比對及推導(dǎo)氨基酸序列分析

    將獲得的美國毒株P(guān)CV3_USA2021 ORF1 基因序列(長度891 bp)與國內(nèi)外38 個毒株進行核苷酸同源性和遺傳進化分析。結(jié)果顯示,PCV3_USA2021 與38 個參考毒株ORF1 基因核苷酸序列同源性為99.1%~99.9%。其中PCV3_USA2021 與美國毒株(PCV3-US_SD2016)、智利毒株(Type 3)、巴西毒株(255_18_42)、西班牙毒株(35)、中國吉林毒株(PCV3-China_JL17-42)、中國山東毒株(PCV3_Shandong-03_2016)、中國山西毒株(PCV3_Pig_CN_ShanXi170709)等7 條毒株ORF1 基因序列同源性最高,與俄羅斯毒株(PCV3-RU/SM17)及墨西哥毒株(PCV3/MEX/GTO/01/2017)同源性最低。

    PCV3_USA2021 ORF1 基因序列推導(dǎo)的Rep 蛋白氨基酸序列(長度297 aa)與國內(nèi)外38 個毒株同源性為95.3%~100%。其中,PCV3_USA2021 與美國毒株(PCV3-US_SD2016)、德國毒株(DE7.3)、智利毒株(Type 3)、巴西毒株(255_18_42)、越南毒株(NNH/DN7/2018)、西班牙毒株(35)、中國江西毒株(PCV3_CN_Jiangxi-62_2016)、中國重慶毒株(PCV3_CN_Chongqing-147_2016)、中國湖北毒株(CN/Hubei-618/2016)、中國山西毒 株(PCV3_Pig_CN_ShanXi170709)、中 國 吉林毒株(PCV3-China_JL17-42)、中國山東毒株(PCV3_Shandong-03_2016)、中國廣西毒株(PCV3/Guangxi-GL/04)、中國福建毒株(FJ37)等14 條毒株推導(dǎo)的Rep 蛋白氨基酸序列同源性最高,與中國廣東毒株(PCV3/CN/Guangdong-SG1/2016)同源性最低。

    2.5 PCV3 毒株ORF2 基因核苷酸序列比對及推導(dǎo)氨基酸序列分析

    將獲得的美國毒株P(guān)CV3_USA2021 ORF2基因序列(長度645 bp)與國內(nèi)外38 個毒株進行核苷酸同源性和遺傳進化分析。結(jié)果顯示,PCV3_USA2021 與國內(nèi)外38 個毒株ORF2 基因核苷酸序列同源性為98.0%~100%。其中PCV3_USA2021 與美國毒株(PCV3-US_SD2016)ORF2基因同源性最高,與中國安徽毒株(PCV3/CN/Anhui-14/201611)同源性最低。

    PCV3_USA2021 ORF2 基因序列推導(dǎo)的Cap蛋白氨基酸序列(長度214 aa)與國內(nèi)外38 個毒株同源性為97.7%~100%。其中,PCV3_USA2021與美國毒株(PCV3-US_SD2016、99 和2164)、塞爾維亞毒株(NIVS)、西班牙毒株(35)、巴西毒株(255_18_42)、哥倫比亞毒株(PCV3_COL_Risaralda1_2018)、匈牙利毒株(PCV3/HU/Szerencs/2017)、韓國毒株(PCV3_KU-1605)、墨西哥毒株(PCV3/MEX/GTO/01/2017)、意大利毒株(PCV3-IT_CO2017)、日本毒株(KGS2098-1_2016 DNA)、智利毒株(Type 3)、中國山西毒株(PCV3_Pig_CN_ShanXi170709)、中國廣東毒株(PCV3/CN/Guangdong-SG1/2016)、中國福建毒株(FJ37)、中國南京毒株(PCV3 CN Nanjing 2017)、中國重慶毒株(PCV3_CN_Chongqing-147_2016)、中國江西毒株(PCV3_CN_Jiangxi-62_2016)、中國廣西毒株(PCV3/Guangxi-GL/04)、中國吉林毒株(PCV3-China_JL17-42)等21 條毒株推導(dǎo)的氨基酸序列同源性最高,與俄羅斯毒株(PCV3-RU/SM17)同源性最低。

    采用生物信息學(xué)軟件對所得的美國毒株P(guān)CV3_USA2021 與國內(nèi)外38 個毒株Cap 蛋白進行氨基酸位點突變分析。結(jié)果(表3)顯示,39 條氨基酸序列之間存在16 個突變位點,分別位于5、7、24、27、56、75、77、88、104、124、132、139、150、156、169、211 aa 位置,而本次擴增毒株P(guān)CV3_USA2021 以上位點沒有突變。

    表3 PCV3 Cap 蛋白氨基酸突變位點比對分析

    3 討論

    本研究通過采集死亡的進口美國種豬組織,設(shè)計引物擴增、拼接后,獲取1 條全基因組長度約為2 000 bp 的PCV3 全基因序列,將對應(yīng)毒株命名為PCV3_USA2021。然后將其與GenBank 收錄的38 個國內(nèi)外不同地區(qū)PCV3 參考毒株進行全基因組序列、ORF1 和ORF2 序列比對。分析結(jié)果顯示,該毒株全基因組序列與參考毒株全基因組具有較高的同源性(98.7%~99.8%),表明不同地區(qū)PCV3 的分布沒有明顯的地域性,PCV3 基因遺傳進化特性相對穩(wěn)定。同時,獲得的PCV3 毒株全基因組序列與國內(nèi)外38 條PCV3 毒株之間的ORF1 及ORF2 的同源性(分別為99.1%~99.9%和98.0%~100%)均高于全基因組序列之間的同源性,且ORF2 基因推導(dǎo)的Cap 蛋白氨基酸之間同源性為97.7%~100%,其中與21 條毒株Cap 蛋白氨基酸序列完全一致。分析結(jié)果表明,PCV3 進化相對比較保守。其中,毒株P(guān)CV3_USA2021 與美國毒株(PCV3-US_SD2016)同源性最高(99.8%),且通過構(gòu)建進化樹分析發(fā)現(xiàn),該毒株與美國毒株(PCV3-US_SD2016)親緣關(guān)系最近。

    根據(jù)全基因組序列比對獲得的進化樹分析結(jié)果,推定毒株P(guān)CV3_USA2021 為PCV3a 亞型。2016—2018 年美國中西部地區(qū)PCV3 流行情況研究報道[14]顯示,PCV3a 和PCV3b 兩種亞型在美國中西部廣泛流行。本研究獲取的毒株來自美國中西部地區(qū)(內(nèi)布拉斯加州)進口種豬,與該報道的PCV3a 亞型在美國中西部流行情況一致。

    PCV3 Cap 蛋白為主要結(jié)構(gòu)蛋白,可誘導(dǎo)動物機體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。Cap 蛋白氨基酸位點24 位于PCV3 抗體識別表位[19]。Cap 蛋白序列氨基酸位點比對結(jié)果顯示,PCV3a 和PCV3b ORF2基因編碼蛋白的氨基酸位點分別為纈氨酸(V)和丙氨酸(A),說明不同亞種PCV3 毒株可能在抗原性方面存在差異,需進一步研究。因此在種豬引種時,除做好病原檢測外,還應(yīng)結(jié)合產(chǎn)地疫病流行情況,選擇針對流行毒株的疫苗,提高疫苗免疫保護率,減少經(jīng)濟損失。

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