響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波提取楠竹葉黃酮工藝

許子競，黃世斌，戴天倫，張 芳，張 雄

(1.貴州工程應(yīng)用技術(shù)學(xué)院 天然產(chǎn)物協(xié)調(diào)創(chuàng)新中心，貴州 畢節(jié) 551700；2.貴州民族大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院 貴州特色資源實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550000)

楠竹(Phyllostachyspubescens)，又稱毛竹，屬多年生常綠植物，在我國栽培歷史悠久，主要分布在我國長江以南的丘陵和山麓地區(qū)及山村房前屋后。楠竹材質(zhì)堅(jiān)韌，富彈性，篾性優(yōu)良，在傳統(tǒng)應(yīng)用中，主要用于建筑、農(nóng)用、家具制作、生活用品等。近年來，隨著制藥工業(yè)和食品加工技術(shù)的發(fā)展，科研工作人員對竹資源的應(yīng)用，有了更深層次的研究和認(rèn)識，研究表明，竹葉提取物含有黃酮、茶多酚、酚酸、多糖等活性成分[1-3]，進(jìn)一步研究揭示，竹葉中總黃酮含量較高，為2%左右[4-5]。竹葉黃酮具有抗氧化、抗衰老、防輻射、抗癌變、增強(qiáng)免疫力、降血脂和膽固醇、抗動(dòng)脈硬化以及抑菌等作用[6-8]。

從竹葉提取竹葉總黃酮，目前大多數(shù)企業(yè)科研單位仍然采用傳統(tǒng)技術(shù)——溶劑浸提和溶劑外循環(huán)技術(shù)提取，但這些提取工藝技術(shù)，存在對原料利用率低、過程操作單元多、能耗高、產(chǎn)品溶劑殘留嚴(yán)重等問題。此外，提取過程中產(chǎn)生大量的廢水和廢渣，不僅嚴(yán)重污染了環(huán)境，還妨礙了竹葉總黃酮的高效提取和產(chǎn)品開發(fā)應(yīng)用。

近些年來，超聲波輔助提取技術(shù)在藥品和食品工業(yè)逐步興起，超聲波輔助提取高效和快速的新技術(shù)，解決了傳統(tǒng)提取耗時(shí)和環(huán)境污染的問題，并且由于超聲波提取技術(shù)具有成本低、自動(dòng)化程度高、操作性強(qiáng)等特點(diǎn)，使其較傳統(tǒng)提取工藝優(yōu)勢更為明顯。因此，本試驗(yàn)利用單因素和響應(yīng)面法相結(jié)合，采用超聲波輔助提取技術(shù)，對楠竹葉黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，旨在為更合理、高效地提取竹葉黃酮以及開發(fā)利用竹葉資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

3年生楠竹葉，貴州赤水林業(yè)局；乙醇，三氯化鋁，硫酸亞鐵，水楊酸，過氧化氫，焦性沒食子酸，分析純，蘆丁，上海同田生物技術(shù)股份有限公司；蒸餾水，實(shí)驗(yàn)室自制。

JA-1003B電子天平，上海越平科學(xué)儀器制造有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海沃瓏儀器有限公司；真空冷凍干燥機(jī)，上海豫明儀器有限公司；TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；BK-600D超聲波清洗器，濟(jì)寧鑫興超聲電子設(shè)備。

1.2 試驗(yàn)方法1.2.1 竹葉黃酮的提取工藝

將竹葉粉碎后，準(zhǔn)確稱取100 g竹葉粉碎樣品，用功率600 W的超聲波提取器提取，按工藝要求，加入體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇，設(shè)定工藝要求料液比、提取溫度和提取時(shí)間，批料提取3次，隨后將提取液濃縮進(jìn)行冷凍干燥，得干燥試驗(yàn)樣品，供檢測用[9-10]。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

分別考察料液比[1∶7，1∶9，1∶12，1∶15，1∶18，1∶21，1∶24，1∶27(g∶mL)]、提取時(shí)間(30，33，36，39，42，45，48，51 min)、提取溫度(50，55，60，65，70，75，80，85 ℃)對竹葉黃酮提取含量和提取率的影響。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)本文“1.2.2”中的試驗(yàn)因素進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以竹葉黃酮提取含量為響應(yīng)值(Y)，以料液比(A)、提取溫度(B)、提取時(shí)間(C)為變量因素，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 三因素和三水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)響應(yīng)面設(shè)計(jì)要求，分別對料液比、溫度和時(shí)間進(jìn)行變換：設(shè)A=(Z1-19)/6，B=(Z2-76)/8，C=(Z3-42)/6，以A，B，C為變量因素，楠竹葉黃酮提取含量(Y)為響應(yīng)值，通過Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表2，差異顯著性分析結(jié)果見表3。

1.2.4 楠竹葉黃酮含量測定

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作，參照趙振[11]標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法：準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，置于25 mL的容量瓶中，加甲醇溶解，配制成0.2 mg/mL濃度母液，從母液中分別移取0，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.6 mL置于10 mL的容量瓶中，移取2 mL的0.1 mol/L三氯化鋁溶液加入上述各容量瓶中，加入甲醇定容，室溫下放置15 min，供測定吸光度用。

楠竹葉黃酮含量的計(jì)算：

(1)

式中，M.粗總黃酮含量(%)；V0.取樣后定容體積(mL)；V1.樣品溶解后定容體積(mL)；V2.移取樣品體積(mL)；A.測定的吸光度；m.稱取的樣品質(zhì)量(g)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

蘆丁波長掃描結(jié)果和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1和圖2，線性回歸方程為A=46.125C+0.064(R2=0.992 3)，說明線性關(guān)系良好。由圖3可見，當(dāng)加入三氯化鋁后，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品發(fā)生了紅移現(xiàn)象，且加入三氯化鋁后吸收峰較為明顯，蘆丁在420 nm附近有強(qiáng)烈吸收。

圖1 蘆丁波長掃描圖

圖2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

圖3 三氯化鋁對照的紫外吸收圖

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果2.2.1 料液比對竹葉黃酮提取率的影響

單因素料液比試驗(yàn)結(jié)果見圖4。固定提取溫度76 ℃，提取時(shí)間42 min，料液比(g∶mL)從1∶7 增到1∶19，黃酮提取率由2.02%提升到3.53%。此后，隨著料液比的增加，黃酮含量開始略有下降，可能是由于溶劑量增加，引起提取物濃度稀釋，給試驗(yàn)檢測結(jié)果造成偏低影響。因此，選擇料液比1∶19較為適宜。

圖4 料液比對竹葉黃酮提取率的影響

2.2.2 提取時(shí)間對竹葉黃酮提取率的影響

單因素提取時(shí)間試驗(yàn)結(jié)果見圖5。固定提取溫度76 ℃，料液比1∶19 g/mL，提取時(shí)間從30 min增加到42 min，黃酮提取率從1.41%上升到3.51 %。此后，隨著提取時(shí)間的延長，黃酮含量略有下降，可能是由于其他雜物質(zhì)提取的增多，引起黃酮含量下降。因此，42 min是最佳提取時(shí)間。

圖5 提取時(shí)間對竹葉黃酮提取率的影響

2.2.3 提取溫度對竹葉黃酮提取率的影響

單因素提取溫度試驗(yàn)結(jié)果見圖6。固定提取時(shí)間42 min，料液比1∶19 g/mL，溫度從60 ℃到76 ℃，黃酮含量從1.43%到3.50%。此后，隨著溫度的升高，黃酮含量略有下降，可能是隨著提取溫度的升高，水溶性雜質(zhì)也增多，引起黃酮含量降低。因此，76 ℃是最佳提取溫度。

圖6 提取溫度對竹葉黃酮提取率的影響

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化竹葉多糖提取工藝2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

在本文“2.2”單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)方案進(jìn)行試驗(yàn)，以竹葉黃酮提取率為響應(yīng)值，得到試驗(yàn)結(jié)果如表2，并進(jìn)行響應(yīng)面與方差分析得表3。

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)方案與試驗(yàn)結(jié)果

表3 回歸系數(shù)的顯著性分析

利用SAS軟件對各因素回歸擬合后，得到多糖提取率與料液比、提取溫度和提取時(shí)間的二次多項(xiàng)回歸方程：

Y1=3.537+0.076A+0.145B+0.033C-0.223A2-0.036AB-0.038AC-0.375B2-0.036BC-0.067C2。

對表3進(jìn)行顯著性和方差分析，該回歸方程(F=30.78，P<0.01)極顯著：相關(guān)系數(shù)R2=0.982 3，說明模型能可信度在98.23%以上。失擬項(xiàng)(F=2.74，P=0.279>0.05)不顯著，說明該模型擬合情況較好，受其他因素影響較小?；貧w方程中一次項(xiàng)對竹葉黃酮提取率A顯著(P<0.05)、B極顯著(P<0.01)，交互項(xiàng)AB、AC、BC不顯著(P>0.05)；二次項(xiàng)A2、B2對竹葉黃酮提取率影響極顯著(P<0.01)。從方差分析F值大小(FB>FA>FC)可知，因素影響的主次順序?yàn)樘崛r(shí)間>料液比>提取溫度，綜上分析，說明該響應(yīng)面模型有效、可靠。

2.3.2 交互作用分析

分析響應(yīng)面三因素交互作用，結(jié)果見圖7～9，可見響應(yīng)面為開口向下的凸形曲面，說明響應(yīng)值存在極高值。在圖7中，在料液比達(dá)一定值時(shí)，提取時(shí)間和提取溫度相互作用較強(qiáng)，在提取溫度76 ℃和提取時(shí)間42 min左右時(shí)，竹葉黃酮提取率存在極值點(diǎn)；在圖8中，在提取時(shí)間一定時(shí)，提取溫度和料液比相互作用較強(qiáng)，在料液比1∶19(g∶mL)和溫度76 ℃左右時(shí)，竹葉黃酮提取率存在極值點(diǎn)；在圖9中，在提取溫度一定時(shí)，料液比和提取時(shí)間相互作用較強(qiáng)，在提取時(shí)間32 min和料液比1∶19(g∶mL)左右時(shí)，相互作用較強(qiáng)，竹葉黃酮提取率存在極值點(diǎn)。

圖7 料液比(A)和提取溫度(B)相互作用的等高線圖

圖8 料液比(A)和提取時(shí)間(C)相互作用的等高線圖

圖9 提取溫度(B)和提取時(shí)間(C)相互作用的等高線圖

2.3.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)真實(shí)試驗(yàn)條件，修正工藝參數(shù)為料液比(g∶mL)1∶20，提取溫度77 ℃，提取時(shí)間43 min，進(jìn)行平行試驗(yàn)，竹葉黃酮的提取率為3.43%。

3 結(jié)論

利用響應(yīng)面法提取3年生楠竹葉總黃酮的最佳提取工藝為料液比1∶19.85(g∶mL)，提取溫度77.43 ℃，提取時(shí)間 42.97 min，預(yù)測的最佳竹葉黃酮的提取率為3.54%；根據(jù)真實(shí)試驗(yàn)條件，修正工藝參數(shù)為料液比：1∶20(g∶mL)，提取溫度77 ℃，提取時(shí)間43 min，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，竹葉黃酮的提取率為3.43%，與預(yù)測值相比，其相對誤差為3.11%，說明該響應(yīng)面模擬模型可信度高，與真實(shí)試驗(yàn)接近。該研究結(jié)果可為竹葉黃酮的提取及竹葉資源的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。