耐旱根瘤菌對干旱脅迫下拉巴豆植株生長的影響

張淑卿，臧丹丹，李劍峰，郭金梅

(1.貴州師范學(xué)院地理與資源學(xué)院, 貴州 貴陽 550018；2.貴州師范學(xué)院喀斯特生境土壤與環(huán)境生物修復(fù)研究所, 貴州 貴陽 550018)

我國西南巖溶片區(qū)石漠化分布廣、程度深，是生態(tài)治理的重點和難點地區(qū)[1-2]。貴州巖溶石漠化地區(qū)生態(tài)系統(tǒng)常以石生和旱生為主[3]。土壤干旱缺水會影響植株根毛的生長從而降低根瘤菌對其侵染的機(jī)會，還會使根瘤菌的生長受到限制，難以與豆科植物共生結(jié)瘤。拉巴豆(DolichoslablabL.)為豆科蝶形花亞科菜豆族扁豆屬，根深抗旱，可以適應(yīng)典型的石灰性和酸性黃壤條件，在裸露于石漠表面的風(fēng)化石礫中也能較好生長[4]。拉巴豆品質(zhì)優(yōu)良，具有多種經(jīng)濟(jì)價值，可以代替控制紫莖澤蘭并且其種植當(dāng)年蓋度可達(dá)到93%[5]，具有良好的品質(zhì)和較強(qiáng)的適應(yīng)性和抗逆性，目前已經(jīng)作為優(yōu)質(zhì)豆科牧草在重慶、廣西等地區(qū)進(jìn)行廣泛種植[4,6-8]。篩選并利用促生能力及抗旱能力較強(qiáng)的拉巴豆根瘤菌株可提高干旱條件下豆科植物結(jié)瘤固氮的能力，對石漠干旱地區(qū)土壤養(yǎng)分恢復(fù)具有重要意義。楊培志等[9]發(fā)現(xiàn)接種根瘤菌可有效提高紫花苜蓿的耐旱能力。張慧敏等[10]發(fā)現(xiàn)根瘤菌與紫花苜蓿的共生固氮體系可提高紫花苜蓿生物量、根和葉中酶的活性以及營養(yǎng)物質(zhì)含量，并可增強(qiáng)紫花苜蓿耐寒、耐旱能力。張攀等[11]發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下接種根瘤菌能顯著提高苜蓿植株的滲透調(diào)節(jié)能力及活性氧防御能力。段如雁等[12]發(fā)現(xiàn)接種根瘤菌可顯著降低中度干旱脅迫對花櫚木幼苗葉片質(zhì)膜相對透性的影響，同時提高脯氨酸和可溶性糖平均含量以及SOD活性。沙樺欣等[13]發(fā)現(xiàn)在干旱脅迫條件下接種根瘤菌可顯著提高臺灣相思(AcaciaconfusaMerr.)幼苗的耐旱能力。韓玉竹[4]研究發(fā)現(xiàn)接種根瘤菌能提高拉巴豆葉片硝酸還原酶活性、葉綠素含量和根系活力，可改善拉巴豆氮、磷營養(yǎng)，提高凈光合速率，促進(jìn)生物量的積累。目前，國內(nèi)外對于耐旱豆科植物的研究主要集中于紫花苜蓿、大豆等方面，而關(guān)于同屬豆科的拉巴豆及其根瘤菌的耐旱性研究尚且鮮見。

本研究以聚乙二醇(PEG 6000)模擬干旱脅迫篩選出耐旱能力較強(qiáng)的拉巴豆根瘤菌作為供試菌株，采用試驗室盆栽拉巴豆的方法進(jìn)行控制水分脅迫試驗，比較拉巴豆植株生物量、最大光化學(xué)量子產(chǎn)量(Fv/Fm)、葉片中可溶性蛋白含量及丙二醛含量，篩選出干旱條件下促生能力強(qiáng)的優(yōu)良拉巴豆根瘤菌耐旱菌株，為石漠干旱生境拉巴豆植株專用根瘤菌菌劑的研發(fā)提供菌種材料。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試?yán)投狗N子：潤高拉巴豆(DolichoslablabL. Rongai)于2017年3月購自荷蘭百綠集團(tuán)(Barenbrug)，產(chǎn)地為澳大利亞，種子凈度97%，發(fā)芽率80.5%。

供試菌株及其來源：采集栽培于重度石漠退化生境中生長的拉巴豆植株，取新鮮飽滿的粉色根瘤0.5 g，參照苗陽陽等[14]的方法以有效碘含量為0.45%～0.55%的碘伏溶液浸泡3 min進(jìn)行表面滅菌，無菌水清洗4～6次，直至清洗液無色無泡沫為止。加5 mL無菌水在超凈工作臺內(nèi)以無菌研缽研磨，取研磨液1 mL以無菌水稀釋1000倍。取稀釋菌液0.2 mL在含35%聚乙二醇(PEG 6000)[15]的YMA固體平板上均勻涂抹，共涂抹5份平板后置于生化培養(yǎng)箱內(nèi)28℃無光照培養(yǎng)，2 d后在各平板上選取菌落形態(tài)與根瘤菌一致、且單菌落直徑最高的10株菌為待選菌株，將待選菌株劃線純化5～6次后，培養(yǎng)斜面送至保定邁禾斯生物科技有限公司進(jìn)行菌株16SrDNA測序鑒定。經(jīng)鑒定，有3株菌為放射型根瘤菌，將其命名為RhizobiumradiobacterY-1(Y-1)、Rhizobiumradiobacter4-4(4-4)、Rhizobiumradiobacter37-1(37-1)，作為本試驗的供試菌株。

培養(yǎng)基：根瘤菌的液體培養(yǎng)使用YEM培養(yǎng)基，含K2HPO4·3H2O 0.5 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.2 g·L-1，NaCl 0.1 g·L-1，甘露醇10 g·L-1，酵母粉1 g·L-1。

利用YMA固體培養(yǎng)基進(jìn)行菌種的保存、活化及培養(yǎng)，以YEM培養(yǎng)基添加15 g· L-1的瓊脂配制。以上培養(yǎng)基以1 mol·L-1的NaOH溶液或1 mol·L-1HCl溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值為7.0±0.1。培養(yǎng)基121℃濕熱滅菌26 min。

1.2 試驗設(shè)計及方法

1.2.1 拉巴豆耐旱根瘤菌菌液的制備 將4℃保存的拉巴豆耐旱根瘤菌R.radiobacterY-1(Y-1)、R.radiobacter4-4(4-4)、R.radiobacter37-1(37-1)活化后接入100 mL YEM液體培養(yǎng)基中，在28℃、120 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)2～3 d，用液體YEM培養(yǎng)基調(diào)至OD600nm為統(tǒng)一值，使菌體濃度為1×109CFU·mL-1[15]，轉(zhuǎn)移至50 mL無菌離心管中，8 000 r·min-1離心10 min，棄去上清液，在沉淀中加入等量無菌水，充分打散后制成菌懸液待用[14]。

1.2.2 拉巴豆幼苗的培養(yǎng)及接種 取健康飽滿的潤高拉巴豆種子，置于50 mL無菌三角瓶中，用有效碘含量為5%的碘伏浸泡5 min，無菌水沖洗6次。沖洗液涂布于YMA固體培養(yǎng)基中以檢測種子表面滅菌是否徹底，表面滅菌種子放入鋪有雙層無菌濾紙的無菌培養(yǎng)皿中，加入適量無菌水，置于28℃條件下培養(yǎng)。以上操作在超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行。

試驗以石英砂混合石漠巖屑模擬重度石漠退化生境進(jìn)行盆栽，采用0.5～1 mm粒徑的石英砂和采集自貴州省烏當(dāng)區(qū)東風(fēng)鎮(zhèn)重度化山地裸巖間隙、直徑在3～5 mm的巖屑碎石。將巖屑及石英砂分別以121℃高壓滅菌3 h后，烘箱105℃烘干5 h。冷卻后裝入經(jīng)75%乙醇表面擦拭消毒、高度為20 cm的塑料盆內(nèi)。盆底部裝巖屑400 g，上覆石英砂200 g。挑取胚根長約2 mm左右的發(fā)芽種子，每盆播種3粒種子于砂表后再覆石英砂100 g。經(jīng)實際測定該盆栽土壤田間持水量(θf)為20.28%，通過每天稱重盆栽并定量補(bǔ)充無菌水來控制相對含水量到相應(yīng)脅迫強(qiáng)度，設(shè)置以下4個基質(zhì)水分梯度處理[16-17]：(1)正常水分，75%θf;(2)輕度干旱脅迫，60%θf;(3)中度干旱脅迫，45%θf;重度干旱脅迫，30%θf。

待幼苗長出第一片真葉時進(jìn)行菌液接種。定苗3株·盆-1，將制備好的根瘤菌菌懸液直接澆灌接種于盆栽中心，2 mL·盆-1，以不接種為對照(CK),3株供試菌株在各水分梯度處理下設(shè)3次重復(fù)。每天傍晚采用整體稱量法[18]控制基質(zhì)含水量，根據(jù)基質(zhì)水分狀況及處理要求及時補(bǔ)充水分，使各處理基質(zhì)維持設(shè)定的相對含水量。30 d后收獲幼苗。收獲時，將拉巴豆幼苗和基質(zhì)從盆中整體取出，用水沖洗整株，在水中將拉巴豆幼苗根系分開，盡量保持根的完整性，用濾紙吸干植株表面水分。

1.3 測定指標(biāo)

1.3.1 株高的測定 在播種后第30天對控制基質(zhì)水分處理拉巴豆植株株高進(jìn)行測定。

1.3.2 葉面積測定 參照宋英博等[19]、于守超等[20]植物葉面積測定的方法，利用打印機(jī)掃描第二片真葉和參照物(1 cm2或4 cm2黑色硬紙片)，用Photoshop 7.0測定參照物和第二片真葉的像素點。用Excel 2003計算出第二片真葉的葉面積。

1.3.3 葉片PSⅡ的最大光化學(xué)量子產(chǎn)量的測定 用MINI-PAM-II型便攜式調(diào)制熒光分析儀定期對拉巴豆葉片進(jìn)行葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)參數(shù)測定。測定前將植株暗適應(yīng)15～30 min，測定F0(初始熒光)、Fm(最大熒光)。通過計算獲得Fv=Fm-F0及PSⅡ(光系統(tǒng)Ⅱ)最大光化學(xué)量子產(chǎn)量(Fv/Fm)。

1.3.4 可溶性蛋白含量的測定 參照Bradford法[21]，配置考馬斯亮藍(lán)G-250溶液：稱0.2 g考馬斯亮藍(lán)G-250溶于100 mL 95%乙醇中，加入85%磷酸200 mL，用蒸餾水將其定容至2 000 mL，保存?zhèn)溆谩Ｈ? mL蛋白標(biāo)液加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250混勻，室溫下放置10 min后在595 nm下比色。以牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，配置1 000 μg·mL-1牛血清蛋白溶液建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。

圖1 可溶性蛋白標(biāo)線

稱取植物新鮮葉片0.2 g放入研缽中加4 mL蒸餾水研磨充分后轉(zhuǎn)移至5 mL離心管中，8 000 r·min-1離心10 min；取0.1 mL溶液于試管中，加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250混勻，室溫下放置10 min后在595 nm下比色(每個樣品3次重復(fù))。

1.3.5 丙二醛含量測定 參照硫代巴比妥酸法[22]測定出苗30 d后拉巴豆葉片的丙二醛(MDA)含量。稱取0.3 g新鮮葉片，加10%的三氯乙酸(TCA)研磨提取過濾，取上清液再加0.6% 的硫代巴比妥酸(TBA)，沸水浴后在波長532 nm、600 nm及450 nm下測定吸光度值。通過公式計算葉片中MDA含量。

Cm=6.45(A532﹣A600)-0.56A450

式中，Cm為MDA的濃度(μmol·L-1)；A450、A532、A600分別代表450 nm、532 nm和600 nm波長下的吸光度值。

MDA含量(μmol·g-1)=Cm×提取液體積(mL)/植物組織鮮重(g)

1.3.6 可溶性糖含量測定 參照蒽酮比色法[23]測定可溶性糖含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析，Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及作圖。采用Duncan法進(jìn)行各處理的多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫下接種耐旱根瘤菌對拉巴豆植株生長量的影響

植物處于干旱脅迫時生長往往受到抑制[24]。正常水分條件下，接種耐旱根瘤菌菌液后拉巴豆幼苗生長量均高于對照組，有顯著的促進(jìn)生長作用。隨著干旱脅迫程度的增加，各菌液處理下拉巴豆幼苗植株地上、地下生長量表現(xiàn)不同(見表1、表2)。由表1可見，在不同程度干旱處理下接種Y-1菌液能顯著促進(jìn)株高及葉片的生長，分別高出對照28.69%～56.34%，58.12%～73.17%(P<0.05)；在中度及重度干旱脅迫下，37-1菌液處理的幼苗株高和葉面積分別高出對照76.17%～118.58%，77.16%～100.51%，差異顯著(P<0.05)，且促進(jìn)作用大于Y-1菌液處理。

表1 干旱脅迫下耐旱根瘤菌對拉巴豆株高和葉面積的影響

由表2可見，接種拉巴豆耐旱根瘤菌菌液可促進(jìn)拉巴豆幼苗地下部分生長。輕度干旱脅迫時，植株產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)促進(jìn)了根系的生長，根長長于正常水分處理。隨著干旱程度的增加，植株地下生物量逐漸減小。但在同一干旱脅迫條件下，接種Y-1及37-1菌液處理，拉巴豆幼苗的根長、根鮮重、根體積均顯著高于對照(P<0.05)。由此可見，耐旱根瘤菌Y-1及37-1可顯著促進(jìn)干旱脅迫條件下拉巴豆植株的生長。

表2 干旱脅迫下耐旱根瘤菌對拉巴豆植株地下生長量的影響

2.2 干旱脅迫下接種耐旱根瘤菌對拉巴豆光合效能的影響

如表3所示，拉巴豆葉片的光能轉(zhuǎn)化效率隨著處理時間及干旱脅迫程度的增加而降低，接種耐旱根瘤菌則有助于延緩這一趨勢。處理30 d時，輕度至重度脅迫下Y-1菌液處理葉片F(xiàn)v/Fm高出對照20.65%～42.09%(P<0.05)；4-4菌液處理的Fv/Fm值在重度干旱脅迫下高于對照19.03%(P<0.05)；37-1菌液處理的Fv/Fm值在輕度和重度干旱脅迫下顯著高于對照；不論各處理與對照之間是否存在差異，其平均值均高于對照，說明接種拉巴豆耐旱根瘤菌能提高干旱條件下葉片的光合作用效率，其中菌株Y-1和37-1的表現(xiàn)效果更為明顯。

表3 干旱脅迫下耐旱根瘤菌對拉巴豆葉片光能轉(zhuǎn)換效率的影響

2.3 干旱脅迫下接種耐旱根瘤菌對拉巴豆植株葉片丙二醛含量、可溶性糖及可溶性蛋白的影響

丙二醛(MDA)是植物在受到傷害時，細(xì)胞膜發(fā)生膜脂過氧化作用而形成的最終分解產(chǎn)物，MDA 含量反映著植物細(xì)胞遭受逆境傷害的程度[25-26]。由圖2可知，拉巴豆葉片中MDA含量隨著干旱脅迫程度的不斷增加逐漸升高。隨著干旱程度的加重，接種Y-1菌液的幼苗葉片中MDA含量與對照組相比分別減少4.50%、-2.48%、16.65%、3.68%，接種37-1菌株的幼苗葉片MDA含量與對照組相比分別減少5.84%、43.75%、30.27%、6.70%，接種4-4菌液的幼苗葉片MDA含量與對照組相比分別增加4.48%、20.4%、-12.17%、7.99%，各處理均與對照組間存在顯著差異(P<0.05)。接種37-1菌液在各處理下均能緩解干旱脅迫的影響；接種Y-1菌液的拉巴豆幼苗除在輕度干旱時MDA含量高于對照外，中度、重度干旱脅迫處理均達(dá)到緩解干旱脅迫效果；接種4-4菌液處理只有在中度干旱時葉片MDA含量低于對照。由此可見，拉巴豆耐旱根瘤菌Y-1和37-1可緩解干旱對植株的傷害。

注：不同小寫字母表示相同水分梯度下不同菌株處理間差異顯著(P<0.05)，下同。Note:The different lowercase letters means significant difference at P<0.05. The same below.

可溶性糖是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。由圖3可見，菌液處理下的拉巴豆葉片可溶性糖含量隨著干旱脅迫程度的增加不斷升高，這與干旱脅迫下拉巴豆葉片丙二醛含量變化趨勢一致。重度干旱脅迫下，4-4及Y-1菌液處理的幼苗葉片可溶性糖含量分別比對照組高出8.1%、3.53%，差異顯著(P<0.05)。

圖3 干旱脅迫下拉巴豆葉片可溶性糖含量的變化

植物體內(nèi)可溶性蛋白含量的增加可提高細(xì)胞的保水能力[27]。如圖4所示，隨著干旱脅迫程度的增加，植株葉片可溶性蛋白的含量普遍呈先增后減的趨勢。在正常水分和輕度干旱脅迫時，37-1菌液處理下的幼苗葉片可溶性蛋白含量最高，比對照組高出70.32%、144.14%，差異顯著(P<0.05)。在中度和重度干旱脅迫時，Y-1菌液處理的幼苗葉片可溶性蛋白含量最高，比對照組高出27.43%、108.57%，差異顯著(P<0.05)，且在干旱脅迫程度最大時達(dá)到最大值，高出其它處理56.26%～176.85%，差異顯著(P<0.05)；其次為37-1，其幼苗葉片可溶性蛋白含量比對照組提高11.14%、33.47%。接種4-4菌液的處理在3個干旱處理中，幼苗葉片中可溶性蛋白含量均低于對照組。由此可見，當(dāng)拉巴豆幼苗遭到干旱脅迫時，耐旱根瘤菌株37-1有助于植株抵抗輕度干旱，Y-1有助于其抵抗中度甚至重度干旱。

圖4 干旱脅迫下拉巴豆葉片可溶性蛋白含量的變化

3 討論與結(jié)論

干旱脅迫是一種非生物脅迫，可抑制作物的生長并降低作物產(chǎn)量[11]。干旱條件下，植物首先會脫水，其次其生理生化過程受到影響，但在整個干旱脅迫過程中，植物能逐漸適應(yīng)逆境環(huán)境并在生理和代謝方面產(chǎn)生積極的響應(yīng)[28]。根瘤菌可與豆科作物共生固氮提高作物產(chǎn)量，根瘤菌還能與豆科作物協(xié)同抗逆[29-30]。有研究表明，接種根瘤菌能有效減少膜脂過氧化物MDA含量的積累，顯著提高花櫚木幼苗的抗旱能力[12]，且接種根瘤菌后花櫚木幼苗 PSⅡ反應(yīng)中心內(nèi)的光能轉(zhuǎn)化效率和 PSⅡ的潛在活性提高，對干旱脅迫有較強(qiáng)的調(diào)節(jié)適應(yīng)能力[12]。張攀等[11]研究發(fā)現(xiàn)，接種根瘤菌能降低紫花苜蓿根、莖、葉中MDA含量，提高根、莖、葉中可溶性糖含量。本研究中，拉巴豆幼苗植株的生長量隨著干旱程度的增加均有不同程度下降，但在同一干旱脅迫條件下，接種Y-1和37-1菌株能顯著促進(jìn)植株生長，株高、根長、根鮮重、根體積均顯著高于對照(P<0.05)，說明耐旱根瘤菌對拉巴豆植株在干旱脅迫下的生物量積累有一定的促進(jìn)作用。干旱脅迫15 d時，各菌液接種處理與對照相比，葉片光能轉(zhuǎn)化效率無顯著差異，但隨著脅迫時間的增加，同一脅迫程度下Y-1和37-1菌液處理的植株葉片光能轉(zhuǎn)化效率均顯著高于對照(P<0.05)，且隨著干旱程度的增加，葉片的光能轉(zhuǎn)化效率也會逐漸增加，說明植株及根瘤菌對干旱脅迫都有一定的適應(yīng)過程，完全適應(yīng)逆境條件后，根瘤菌會促進(jìn)植株葉片對有機(jī)物的積累。這與段如雁等[12]的研究結(jié)果一致，即根瘤菌對干旱脅迫有一定的調(diào)節(jié)適應(yīng)能力，接種根瘤菌會提高植物的光能轉(zhuǎn)化效率。

植物體內(nèi)可溶性糖、可溶性蛋白能降低細(xì)胞滲透勢，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，在干旱脅迫下能提高植物抗逆能力，是評價植物抗旱性的重要生化指標(biāo)[27]。本研究中，隨著干旱脅迫程度的增加，37-1和4-4菌液處理下植株葉片可溶性蛋白含量呈先增后減的趨勢，而Y-1菌液處理下幼苗葉片可溶性蛋白的含量隨著干旱脅迫程度增加而增大，在重度干旱脅迫下達(dá)到最大值，說明在干旱脅迫條件下，Y-1菌株處理可使拉巴豆植株的抗逆能力增強(qiáng)。雙因素方差分析發(fā)現(xiàn)：干旱脅迫與根瘤菌的交互作用對葉片可溶性糖及可溶性蛋白含量均有極顯著的影響(P<0.001)。

植物的耐旱能力還隨丙二醛含量的降低而增加[12]。本研究中，隨著干旱脅迫程度的增加，拉巴豆葉片中MDA含量升高，但在同一干旱脅迫尤其是在中度和重度干旱脅迫條件下，Y-1和37-1菌液處理的拉巴豆幼苗葉片MDA含量均顯著低于對照(P<0.05)，說明這兩株根瘤菌菌株能通過有效抑制幼苗的脂膜過氧化作用而降低這一作用的最終產(chǎn)物對幼苗的毒害，這與段如雁等[12]和霍平慧[31]的研究結(jié)果一致。而洪文君等[32]的研究表明當(dāng)土壤水分達(dá)到重度干旱脅迫時，接種叢枝菌根處理組的土沉香幼苗MDA含量顯著高于CK組，這可能是因為接種叢枝菌根可增大植株根系的表面積，使植株根系增加吸水通道，因此在中度干旱脅迫下MDA含量低于對照，但在重度干旱條件下，根系吸水通道的增加意味著根系會快速散失水分，故MDA含量增加。而本研究涉及的菌株為耐旱根瘤菌菌株，不會增加根系吸水通道，故在重度干旱脅迫下仍能使植株保持較好的抗逆能力。雙因素方差分析也得出，干旱脅迫與根瘤菌的交互作用對葉片MDA存在極顯著影響(P<0.001)。

研究表明，在逆境條件下分離到的根瘤菌菌株本身就具有較強(qiáng)的抗逆性，接種這種分離自逆境的根瘤菌菌株可提高植物本身的抗逆能力[12-13]。本研究的3株供試菌株來自于經(jīng)35%聚乙二醇(PEG 6000)的篩選，菌株本身就有較好的耐旱性，故在干旱脅迫下能顯著提高植株的耐旱能力，但4-4菌株在該方面的能力明顯弱于Y-1和37-1菌株。

因此，接種耐旱根瘤菌Y-1和37-1的菌液，可促進(jìn)拉巴豆植株株高、葉片、根系的生長，可增加根系鮮重、體積，增加葉片光能轉(zhuǎn)化效率及可溶性蛋白含量，降低葉片MDA含量，在促進(jìn)拉巴豆幼苗生長的同時能減緩干旱脅迫對幼苗的危害程度，是耐旱性能較好的菌株。