霍山石斛“九仙尊1號(hào)”一步法再生體系的建立

戴亞峰 王詩文 張恩亮 李誠

摘要?[目的]簡化霍山石斛離體再生方法。[方法]以霍山石斛“九仙尊1號(hào)”帶節(jié)莖段為外植體，研究不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基、激素配比和添加物對(duì)九仙尊1號(hào)愈傷組織誘導(dǎo)的影響，并在愈傷組織的基礎(chǔ)上研究不同添加物和培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織增殖和再生的影響。[結(jié)果]九仙尊1號(hào)一步法再生的最佳培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L KT+1.0 mg/L IBA+15 g香蕉泥+0.5 g活性炭+30 g/L蔗糖，愈傷組織誘導(dǎo)率為16.67%，增殖率為10.83%，再生率95%;最佳移栽基質(zhì)為樹皮∶草炭1∶1，存活率為95.56%。[結(jié)論]九仙尊1號(hào)再生體系的建立為研究霍山石斛的分子機(jī)理提供了理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞?九仙尊1號(hào);一步法;植物組織培養(yǎng);再生體系

中圖分類號(hào)?S?567.23文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A

文章編號(hào)?0517-6611（2020）01-0189-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.01.057

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Development of One?step Regeneration System of Dendrobium huoshanse “Jiuxianzun 1”

DAI Ya?feng，WANG Shi?wen，ZHANG En?liang et al

（Jiuxianzun Huoshan Dendrobium Co.，Ltd.，Luan，Anhui 237012）

Abstract?[Objective] The research aimed to simplify the method of vitro regeneration of Dendrobium huoshanense.[Method]Stem segments of Dendrobium huoshanse“Jiuxianzun 1” were tested as explants to evaluate effects of types of basic medium，different combinations of exogenous hormones and additives for callus induction，based on the primary callus，effect of callus proliferation and regeneration under different basic medium and additives were investigated.[Result]The best medium for the one?step regeneration of Jiuxianzun 1 was MS+1.0 mg/L KT+1.0 mg/L IBA+15 g banana puree+0.5 g activated carbon+30 g/L sucrose.The callus induction rate was 16.67%，proliferation rate was 10.83% and regeneration rate was 95%; the best transplanting substrate was bark and peat mixed with 1∶1.The survival rate was 95.56%.[Conclusion]The establishment of the Jiuxianzun 1 regeneration system provides theoretical basis and technical support for studying the molecular mechanism of Dendrobium huoshanense.

Key words?Jiuxianzun 1;One?step method;Plant tissue culture;Regeneration system

霍山石斛（Dendrobium huoshanense）為蘭科（Orchidaceae）石斛屬（Dendrobium）多年生草本植物，原產(chǎn)于中國安徽霍山的道地藥材植物，具有促身心、延緩衰老的功效[1]。蘭科植物種子細(xì)小，通常無胚乳，難以萌發(fā);與蘭科其他植物種子類似，霍山石斛種子細(xì)小如粉，植物組織培養(yǎng)是目前最有效的繁殖方式[2-4]。

我國學(xué)者徐云昌鳥等[5]于1984年首次報(bào)道通過植物組織培養(yǎng)的方式獲得霍山石斛試管苗，在此后幾十年的研究中，霍山石斛的組織培養(yǎng)技術(shù)日趨成熟?？偨Y(jié)前人對(duì)于霍山石斛組織培養(yǎng)的研究中，溫云飛等[6]以種子為外植體誘導(dǎo)原球莖，進(jìn)而誘導(dǎo)原球莖發(fā)芽、生長直至生根，建立霍山石斛無性繁殖體系，整個(gè)組培過程共使用了10種不同的培養(yǎng)基配方處理;譚云等[7]以假鱗莖上段、下段以及幼芽作為外植體誘導(dǎo)霍山石斛擬原球莖的發(fā)生，結(jié)果發(fā)現(xiàn)霍山石斛成熟植株較難脫分化，最適宜的外植體是假鱗莖下段;崔瑩瑩等[8]在2017年以霍山石斛帶節(jié)莖段為外植體誘導(dǎo)叢生芽，再增殖的方式成功實(shí)現(xiàn)了霍山石斛微體快繁。綜合前人的研究發(fā)現(xiàn)霍山石斛的組培快繁體系均較為復(fù)雜，步驟繁瑣，同時(shí)離體快繁亟需一種簡便的方法。

“九仙尊1號(hào)”是安徽六安九仙尊霍山石斛股份有限公司于2015年申報(bào)的霍山石斛優(yōu)質(zhì)品種，相比野生霍山石斛的藥用成分含量具有明顯優(yōu)勢(shì)，目前關(guān)于其離體再生體系的研究鮮見報(bào)道。近些年來隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，再生體系成為植物分子機(jī)理、基因編輯等的研究基礎(chǔ)[9]。該研究旨在構(gòu)建霍山石斛的優(yōu)良品種九仙尊1號(hào)再生體系，以期為后續(xù)研究九仙尊1號(hào)的分子機(jī)理以及利用轉(zhuǎn)基因的方式等研究霍山石斛藥用機(jī)理打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料

選擇生長良好、長勢(shì)一致的霍山石斛九仙尊1號(hào)帶節(jié)莖段為試驗(yàn)材料。所有材料均取自于九仙尊霍山石斛股份有限公司培養(yǎng)室的組培苗。

1.2?試驗(yàn)方法

1.2.1?培養(yǎng)條件。

試驗(yàn)所用培養(yǎng)基中蔗糖含量均為30 g/L，瓊脂為6 g/L，pH 為5.8～6.0，培養(yǎng)室溫度為（25±2）℃，暗培養(yǎng)20 d，之后光照強(qiáng)度2 000～3 000 lx，光照時(shí)間為12 h/d。

1.2.2?外植體處理。

選取霍山石斛九仙尊1號(hào)培養(yǎng)6～8個(gè)月的小苗莖段為外植體，莖段進(jìn)行切割，將1 cm左右的莖段接入培養(yǎng)基。

1.2.3?一步法誘導(dǎo)霍山石斛九仙尊1號(hào)再生體系的建立。

在試驗(yàn)前期的基礎(chǔ)上為了簡化試驗(yàn)流程，研究從愈傷組織培養(yǎng)到增殖再分化形成植株均采用同一種處理。研究以不同培養(yǎng)基（MS、1/2MS、KC）、不同外源激素組合（6-BA、KT、NAA）和不同添加物（香蕉泥、活性炭）為基礎(chǔ)，共27個(gè)處理（表1），其中Y1～Y18為不同樂源激素處理組合，Y19～Y27為不同添加物及培養(yǎng)基處理組合，每個(gè)處理接種30個(gè)外植體，每個(gè)處理重復(fù)3次。40 d繼代1次，180 d之后統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.2.4?移栽馴化。

待組培苗生長至3～5 cm時(shí)，開蓋煉苗5 d，之后將植株移栽至樹皮與蛭石不同比例（R1 1∶0，R2 1∶1，R3 2∶1、R4 3∶1、R5 4∶1）混合的栽培基質(zhì)中，保持基質(zhì)濕潤，每天噴水3次，保持空氣濕潤，噴水量不宜過大。

1.3?數(shù)據(jù)處理與分析

愈傷組織誘導(dǎo)率=形成愈傷組織外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%;增殖率=60 d后愈傷組織的顆粒數(shù)/接種的顆粒數(shù)×100%;再分化率=出芽的愈傷組織數(shù)/繼代的愈傷組織數(shù)×100%。所有的試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0和Excel 2013進(jìn)行處理分析。

2?結(jié)果與分析

2.1?不同激素處理對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

研究以正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)為基礎(chǔ)，由表2分析愈傷狀態(tài)和愈傷量KT相比較于6-BA，對(duì)九仙尊1號(hào)愈傷組織誘導(dǎo)具有更好的效果。Y1～Y9處理下的結(jié)果表明適宜的6-BA濃度為0.5 mg/L，隨著6-BA的提高，愈傷組織誘導(dǎo)率呈下降趨勢(shì);在6-BA和IBA的組合中隨著生長素濃度的升高，莖段的愈傷組織誘導(dǎo)率也呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，最適宜的生長素濃度為0.2 mg/L。

Y10～Y18處理下的結(jié)果表明隨著KT濃度的升高，在濃度到達(dá)1.0 mg/L時(shí)愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)16.67%，當(dāng)升至2.0 mg/L時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率也隨之下降至5.56%，最適宜的KT濃度為1.0 mg/L;Y11、Y14和Y17的處理下隨著生長素濃度的提高，愈傷組織誘導(dǎo)率也隨之提高，表明最適宜的IBA濃度為1.0 mg/L。

2.2?不同添加物及培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響?從圖1可看出，在3種培養(yǎng)基中添加活性炭和香蕉泥都會(huì)提高愈傷組織誘導(dǎo)率，而同時(shí)添加活性炭和香蕉泥效果也會(huì)優(yōu)于只添加一種組分。對(duì)比不同培養(yǎng)基處理，3種培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效果分別為MS>1/2MS>KC培養(yǎng)基，因此對(duì)比Y17表明，愈傷組織誘導(dǎo)最適宜的培養(yǎng)基為Y21。

2.3?不同處理對(duì)愈傷組織增殖及再分化的影響

在愈傷組織的繼代培養(yǎng)過程中，九仙尊1號(hào)的愈傷組織出現(xiàn)邊增殖邊分化的過程（圖2），同時(shí)在同配方繼代培養(yǎng)后會(huì)直接發(fā)育成完整植株。

通過對(duì)照組Y17，分析Y19～Y27處理下的結(jié)果表明，不同培養(yǎng)基和添加物對(duì)愈傷組織的增殖在Y21的處理下愈傷組織增殖率達(dá)到最高，為10.83%，最低為Y23和Y27，均為8.83%，在0.01水平上并無顯著差異（圖3a），在Y23的處理下愈傷組織的再分化達(dá)到100%，而Y21的誘導(dǎo)條件下愈傷組織的再分化率為95%，在0.01水平下也無顯著差異（圖3b）。因此為簡化操作流程確定“一步法”最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基為Y21即MS+1.0 mg/L KT+1.0 mg/L IBA+15 g香蕉泥+0.5 g活性炭+30 g/L蔗糖。

2.4?基質(zhì)對(duì)組培苗移栽的影響

由圖4可知，在R4的處理下，移栽存活率最高達(dá)95.56%，R1單獨(dú)使用樹皮移栽效果最差，樹皮和蛭石混合使用時(shí)，效果均優(yōu)于單獨(dú)使用樹皮。因此移栽組培苗最適的栽培基質(zhì)為樹皮∶蛭石3∶1。

3?結(jié)論與討論

我國有76種石斛，其中近50種石斛被用藥，尤其是霍山石斛，還具有很高的商業(yè)價(jià)值[10]，但霍山石斛野生資源面臨著過度采伐等問題。自1902年德國植物學(xué)家Gottlieb Haberlandt 首次提出了離體細(xì)胞培養(yǎng)的概念以來，100多年來植物組織培養(yǎng)的大量研究表明植物激素的種類、濃度和比例是影響植物形成愈傷組織到再生的最關(guān)鍵因素，通常細(xì)胞分裂素類激素是用來促進(jìn)芽分化，生長素類激素促進(jìn)生根[11-12]。該研究中6-BA和IBA配合使用時(shí)在濃度分別為0.5和0.2 mg/L時(shí)效果最好，同比KT和IBA配合使用時(shí)則在濃度分別為1.0和1.0 mg/L時(shí)效果最好，對(duì)比楊靜等[13]研究霍山石斛的擬原球莖時(shí)采用0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA誘導(dǎo)擬原球莖，分化培養(yǎng)采用2.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/L NAA + 0.03 mg/L TDZ， 該研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)新的配方可以一步再生。不同植物對(duì)植物激素的敏感度不一樣，歐洲百合對(duì)于TDZ較為敏感，簸箕對(duì)于6-BA敏感[14-15]，該研究結(jié)果顯示九仙尊1號(hào)對(duì)于KT的敏感度較高，效果也優(yōu)于6-BA。

KC培養(yǎng)基在大量研究中是極為適合蘭科的基礎(chǔ)培養(yǎng)基[16]。該研究結(jié)果表明MS是最適合九仙尊1號(hào)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在前人大量的研究中霍山石斛的最適合培養(yǎng)基是MS和1/2MS，該研究的結(jié)果也與前人吻合[17]。香蕉泥和活性炭已經(jīng)在多種植物中被證實(shí)對(duì)植物組培具有顯著的促進(jìn)作用[18-19]，該研究中單獨(dú)添加活性炭和香蕉泥效果并不顯著，但同時(shí)添加香蕉泥和活性炭對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率有顯著提升，在后續(xù)的組培中會(huì)適量添加香蕉泥和活性炭。

在實(shí)際生產(chǎn)中用一種培養(yǎng)基即可完成再生體系的建立可稱作“一步法”，一步法的優(yōu)勢(shì)在于能夠降低工作量、提高效率，有利于規(guī)模化生產(chǎn)[20]。該研究結(jié)果顯示霍山石斛九仙尊1號(hào)可用在培養(yǎng)基MS+1.0 mg/L KT+1.0 mg/L IBA+15 g香蕉泥+0.5 g活性炭+30 g/L蔗糖上一步完成愈傷組織誘導(dǎo)、增殖、再生的過程，前人關(guān)于霍山石斛組培快繁的步驟通常需要更換不同的培養(yǎng)基組分[13，17]，石斛屬植物也是很少一步法完成[21-22]。因此該研究的結(jié)果大大降低了霍山石斛快繁的工作量，提高了效率，同時(shí)為后期利用轉(zhuǎn)基因研究霍山石斛藥用分子機(jī)理以及基因編輯等方式奠定了重要基礎(chǔ)。

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